医学细胞生物学 二、细胞学的经典时期 1890年Van Be neden和Boveri在观察细胞分裂时发现了中心体。随后，线粒体(R. Altmann,1894; C. Benda,1897)高尔基复合体(C. Golgi,1898)也相继被发现。 三、实验细胞学时期 从20世纪初期到20世纪中叶为实验细胞学阶段。这一阶段的主要特点是，细胞学的研究不只是借助光学显微镜着重于形态学结构的观察，而且还采用了多种实验手段对细胞的各种生化代谢和生理功能进行研究。同时细胞学还与相邻学科相互渗透形成一些重要的分支学科。1902年Boveri和W. Suttan把染色体的行为与G. Mendel的遗传因子联系起来，提出“染色体遗传理论”。同年，W. Cannon认为遗传因子在染色体上，并提出“遗传的染色体学说”。1909年W. Johannsen把遗传因子命名为gene（基因）。1910年T. Morgan根据他和合作者的大量实验工作，建立了“基因学说＇，证明基因是遗传性状的基本单位，且直线地排列在染色体上并成为连锁群。由此，细胞学与遗传学结合起来形成了细胞遗传学。1909年，R. Harrison建立了组织培养技术，直接观察和分析细胞的形态和生理活动。1943年，四、细胞生物学的形成和发展光学显微镜受到其分辨率和放大倍率的限制，不可能对细胞作进一步精细研究。1933年德国E. Ruska等人研制出第一台电子显微镜(electron microscope)。电子显微镜的发明和20世纪中叶分子生物学的发展，标志着亚显微结构与分子水平相结合的细胞生物学的开端。（一）电子显微镜的应用使细胞学研究深入到亚显微水平Ruska最初研制的电子显微镜的放大倍率达10000倍。之后，由于技术上的不断革新，电子显微镜的放大倍率达到几十万倍，分辨率由最初的50nm提高到零点几个纳米。同时用千电镜标本制作的超薄切片技术也在不断改进。从20世纪40年代，特别是50年代中期到60年代末期，电子显微镜的应用使细胞的形态学研究深入到亚显微水平，发现了过去在光镜下看不到的细胞器，如内质网(K. R. Porter,1945)、溶酶体(De duve,1956汃核糖体(Robe1tis,1958)；明确了过去在光镜下看到的高尔基复合体(A. J. Dalton等，1953)和线粒体(G. E. Palade,1953)等细胞器及其微细结构。随着电子显微镜技术的进展，除对细胞进行超微结构观察之外，也逐步深入到结构与功能相结合的探索，即应用生物化学与生物物理学手段对分离出的细胞器进行化学组分分析。这些工作的积累为细胞生物学的形成打下基础。20世纪70年代，超高压电子显微镜的出现，又相继发现了细胞质中纵横交错的网状细胞骨架结构(Porter,1976)和细胞核基质内的网状核骨架结构(E. G. Fey,1984)。20世纪80年代初期，扫描隧道显微镜(G. Binning和H. Rohrer,1981)和原子力显微镜(Binning)的发明，使细胞的亚显微结构观测深入到超微（大分子）结构层次，可用于研究DNA和蛋白质等生物大分子的表面立体结构。


医学细胞生物学 三、实验细胞学时期 （二）分子生物学的研究进展促进了细胞生物学的形成与发展自20世纪50年代始，分子生物学进入一个快速的发展时期。1953年J. Watson和F. Crick提出DNA双螺旋结构模型。1958年，M. Meselson和F. Stahl通过DNA复制研究，证明DNA复制为半保留复制。同年，Crick发表了“中心法则”(central dogma)，指出遗传信息的流向是DNA--+RNA--+蛋白质。 第一篇细胞生物学概论五、细胞生物学的发展趋势 纵观细胞生物学的发展历史，可以得出理论的提出和研究技术的进步是推动细胞生物学快速发展的结论。19世纪“细胞学说”的提出回答了生物界的统一性和生命活动的本质，奠定了包括细胞生物学在内的生命科学发展的基础；20世纪30年代电子显微镜的发明让入们看到了结构复杂和分工协作的细胞世界；20世纪50年代建立的DNA双螺旋结构模型和遗传信息传递的“中心法则”将细胞学研究带入分子水平，成为分子细胞生物学或细胞分子生物学。我们相信，21世纪初期完成的包括人类在内的生物体基因组序列分析的完成，将引领细胞生物学的快速发展。


医学细胞生物学 第一篇细胞生物学概论五、细胞生物学的发展趋势 1990年人类基因组计划(human genome project, HGP)启动，在这一世界性范围内的科学大合作中，中国科学家千1993年加入，承担其中1％的序列分析任务。2000年美、英、日、法、德、中6国学者共同绘制了人类基因组框架图，2003年人类基因组序列分析完成。人们发现包括入类在内的哺乳动物基因组中近98％的序列不与蛋白质编码基因相对应。随后发现，非编码DNA并非垃圾序列，它们均可被转录加工为非编码小RNA或长链非编码RNA。同时不依赖于DNA序列的可遗传信息一表观遗传现象的发现，使人类基因组信息更加复杂。可以认为，为诠释这些基因组结构及生物学意义的基因组学、转录组学、蛋白质组学、细胞组学等新兴领域生命信息和新技术体系的引入，将会像“20世纪50年代建立的DNA双螺旋结构模型和遗传信息传递的中心法则将细胞生物学研究带入分子水平“那样，细胞生物学又将进入一个新的快速发展时期。


医学细胞生物学 第一篇细胞生物学概论五、细胞生物学的发展趋势 目前，细胞生物学已经从专注“单个细胞＂的显微、亚显微和分子水平的常规研究扩展到更深的层次：一方面关注在生物个体水平研究细胞结构和功能的分子基础，研究细胞间相互作用、分工协作的社会关系，研究微环境细胞间相互联系的信息机制和功能取向；另一方面，基于多细胞生物的单个细胞测序技术精准解析不同身份细胞的功能基础。果蝇(Drosophila melanogaster汃线虫(Caenorhabditis elegans)、爪赡(Xenop匹laevis汃斑马鱼(Danio rerio)和小鼠(M监m监CU如）等是开展这方面研究的常用模型动物。这方面工作的有效开展，尚需要诸如活体成像技术等新的研究手段的不断进步，也包括不局限定性描述更多地开展定量测定和定量研究等技术的建立和不断革新。人类认识世界的目的是为了更好地改造世界，更好地造福人类。因此，细胞生物学理论及技术的转化和应用研究应该是细胞生物学发展的终极目标。该研究领域与医学关系十分密切，其中疾病的（干）细胞治疗研究及基千基因编辑技术纠正细胞功能缺陷研究将会成为突出的亮点。


医学细胞生物学 第三节细胞生物学与医学—、细胞生物学与医学的关系 细胞生物学是现代医学的基础和支柱学科。医学要解决的间题，是阐明人的生、老、病、死等生命现象的机制和规律，并对疾病进行诊断、治疗和预防。人类生命是从受精卵开始的，经过了胎儿、新生儿、幼年、成年、老年直至死亡的过程，这些过程都是以细胞为单位进行的。细胞正常结构的损伤和功能紊乱，必然导致人体组织器官的病变，并由此引起疾病。例如，严重危害人类健康的癌症，就是正常细胞癌变的结果；心血管疾病，如动脉粥样硬化的发生与动脉壁内皮细胞的特性改变有关；老年性痴呆等神经退行性疾病是神经元选择性变性死亡的结果。因此，细胞是体现人类生、老、病、死之单位，细胞生物学与医学的关系极为密切。细胞生物学的理论与技术的研究成果不断向医学领域渗透，在很大程度上促进了医学的进步。细胞生物学的研究内容在不断地加深与医学科学的结合，形成了细胞生物学的分支学科一—医学细胞生物学(me dical cell biology)。医学细胞生物学以揭示人体各种细胞在生理和病理过程中的生命活动规律为目的，期望能对人体各种疾病的发病机制予以深入阐明，为疾病的诊断、治疗和预防提供理论依据和策略。


医学细胞生物学 第—章绪论医学细胞生物学所要探讨的主要是与医 学相关的细胞生物学问题，这些问题往往是疾病发生发展的基础。医学细胞生物学的主要研究模式是，以疾病为导向，提出与疾病相关的细胞生物学问题，然后选择模型细胞开展细胞分子水平的基础研究，继之利用模型动物进行体内研究，力求回答临床问题。在此基础上进一步开展的临床应用的成果转化研究，如针对医学细胞生物研究中阐明的分子靶点，寻找并研制诊断试剂、靶点药物等，是近年提出的转化医学(translational medicine)研究的主要内容。转化医学强调将基础研究与解决患者实际问题相结合，实现从“实验图1-1转化医学研究过程：示医学细胞生物学在室到床边”的转化。因此，可以说医学细胞转化医学研究中的地位生物学是转化医学研究的基石（图1-1)。医学细胞生物学是医学院校学生的重要基础医学课程之一。它既是临床医学的基础，也与基础医学的其他学科，特别是人体胚胎学、医学遗传学、生理学、病理学，以及分子生物学等的关系非常密切。对医学生来说，学好细胞生物学，不仅能为学习其他医学课程打下扎实基础，而且有助千培养良好的科研思维习惯和科学素养，在今后的临床工作中，不断地发现问题、研究间题和解决问题。


医学细胞生物学 二、细胞生物学的主要研究领域与医学意义 细胞生物学是研究细胞生命活动规律及其机制的基础性学科。现代细胞生物学研究主要从分子水平揭示生物在生理或病理状态下细胞层面上所表现出的特征和行为。目前细胞生物学的主要研究领域包括：细胞结构与功能的信号基础，蛋白质的分选和运输，染色质的结构和功能，细胞结构体系的组装与去组装，细胞极性与细胞迁移，细胞增殖周期调控，细胞分化与干细胞特性，受精与生殖，细胞的衰老与死亡，细胞社会学，细胞与组织工程等。细胞生物学中许多领域的研究进展很快，这可能会成为推动医学向前发展的一个新的基础。在此举例介绍某些研究领域及其医学意义。


医学细胞生物学 （一）细胞间信息传递与细胞的信号转导 在高等动物和人类，各种生命活动，如神经系统、内分泌系统、免疫系统的运行都离不开细胞与细胞间的信息联系。细胞间的信息联系主要是通过神经递质、激素和旁分泌因子(paracrine)等信号分子来完成的，这些信号分子与细胞表面或细胞内部的受体结合，并引起下游胞内信号分子的级联反应，实现对细胞调节的过程称为信号转导(signal transduction)，其中整个信息传递过程的路径谓之信号转导通路(signaling pathway)。近年发现，细胞间的信息传递也可通过细胞分泌的包含复杂RNA和蛋白质的小膜泡－~外泌体(exosome)来完成。细胞的信号转导研究是细胞生物学领域一个很活跃的研究前沿，其主要研究内容是了解信号转导通路中各信号分子之间的相互关系，包括蛋白质的互作、修饰、降解、转位的生物学效应，以及不同信号转导通路间的相互应答(cross-talk)。细胞信号转导的生物学效应几乎涵盖了细胞所有的生命现象。因此，通过对细胞信号转导机制的研究，可了解到细胞的运动、增殖、分化及死亡等活动的机制和规律。


医学细胞生物学 （一）细胞间信息传递与细胞的信号转导 细胞信号转导的研究让我们了解到某些疾病的发病机制。例如，信号转导通路中的受体异常是高胆固醇血症和重症肌无力病入的发病原因。在家族性高胆固醇血症病入，其肝细胞膜上的低密度脂蛋白(LDL)受体减少，致使肝细胞对血液中LDL的摄入能力降低，从而引起高胆固醇血症。在重症肌无力患者的体内产生了抗乙酰胆碱受体的抗体，抗体与乙酰胆碱受体结合，使通过受体进行的信号转导过程受阻，出现重症肌无力症。霍乱弧菌所致的剧烈腹泻也是细胞信号转导通路受阻的典型例子。霍乱毒素能够糖基化肠黏膜细胞中的G蛋白的a亚基，使G蛋白持续失活，导致细胞的离子代谢紊乱和细胞内外渗透压失衡，大量水分进入肠腔。此外，信号转导通路中的蛋白激酶功能异常与肿瘤发生发展有关。


医学细胞生物学 （二）细胞分化与干细胞研究 脊椎动物和人类的机体由200多种不同类型的细胞组成。这些细胞的结构和功能各异，是细胞分化的结果。细胞分化(cell differentiation)是指在个体发育中，由单个受精卵产生的细胞在形态结构、生化组成和功能等方面形成明显的稳定性差异的过程。由一个受精卵来源的细胞为什么会变得如此多样与不同？这是细胞分化的研究内容。细胞分化的机制，是数百年来许多生命科学家付出毕生精力而至今尚未完全解决的难题。目前，人们认识到细胞分化的实质是基因的选择性表达，是胚胎细胞逐渐由“全能”到“多能”“单能”，最后成为“终末细胞＂的发育过程。人类胚胎早期的弱胚内细胞团(inner cell mass, ICM)细胞是多能性干细胞，它具有分化为成熟个体中所有细胞类型的潜能，已在体外成功建系，称为胚胎干细胞(emb1-yonic stem cell, ESC)。而来源于成体组织的单能性千细胞则称为成体干细胞(adult stem cell)或组织千细胞。干细胞是生物个体发育和细胞分化的基础，对于细胞生物学特性的研究将有助千对生命的基本现象，即发育和细胞分化以及机体衰老机制的认识。


医学细胞生物学 （二）细胞分化与干细胞研究 胚胎干细胞可以在体外培养、传代，且保持其无限增殖能力和多向分化潜能，特别是近年通过细胞重编程(cellular reprogramming)技术获得的诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPS细胞），显示出与胚胎干细胞相同特征，这使人们看到了彻底修复和再生人体病变器官的前景。理论上，干细胞经特定因子刺激后，可发育成特化的细胞，用于治疗由细胞功能障碍或组织受损引起的疾病，这就是所谓的细胞治疗；而利用胚胎干细胞，克隆人体组织器官，以治疗（替代病变器官）为目的的克隆技术称为治疗性克隆。因此，目前干细胞已成为生命医学研究领域的热点。


医学细胞生物学 （三）细胞增殖与细胞周期调控 细胞增殖是细胞生命活动的重要特征，是个体生长和发育的基础。组成人体的细胞多达2x1014个，是细胞增殖的结果。细胞增殖以周期性循环的方式进行。一个细胞经过一系列生化事件而复制它的组分，然后一分为二，这种周期性的复制和分裂过程即为细胞（增殖）周期(cell cycle)。在个体发育中，胚胎期细胞分裂增殖极为活跃，成体期除部分细胞不断分裂增殖之外，大多数细胞的增殖速度减慢，有的甚至停止分裂。细胞是如何知道什么时候分裂，什么时候停止分裂的，以及细胞不对称分裂的机制等是目前细胞增殖周期调控研究的主要内容。细胞增殖与细胞周期的调控一直是细胞生物学研究的重要领域，目前已发现了真核细胞内操纵细胞周期进程的三类细胞周期调控因子，它们是细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子；也发现了若干个监控细胞周期进程的反馈调控机制，即细胞周期检查点(cell cycle checkpoint)。


医学细胞生物学 （三）细胞增殖与细胞周期调控 细胞的增殖失控与人类的某些疾病，如肿瘤的发生等密切相关。肿瘤细胞的主要特性是细胞的无休止和无序的分裂并形成肿块。因此，研究细胞增殖与细胞周期的调控机制，也是了解肿瘤发生机制和控制肿瘤生长的重要途径。肿瘤的发生机制与防治研究是医学领域的重要研究课题，其中基因与肿瘤发生的关系、细胞信号转导与肿瘤、肿瘤干细胞特性以及癌细胞诱导分化研究等是目前肿瘤细胞生物学的主要研究领域。癌基因、抑癌基因的发现，以及其介导的信号转导机制的阐明，极大地丰富了人们对细胞增殖规律与细胞周期调控机制的认识。


医学细胞生物学 （三）细胞增殖与细胞周期调控 （四）细胞衰老与细胞死亡细胞衰老与细胞死亡是生物界的普遍规律。细胞衰老(cellular aging, cell senescence)是指细胞的形态结构和生理功能逐渐衰退的现象。在人类和高等动物，细胞总体的衰老将导致个体的老化。因此，细胞衰老是机体的衰老和老年病发病的基础。迄今在细胞衰老机制研究上已取得了一些进展，如发现随着细胞分裂次数的增加，染色体端粒的末端不断缩短；在低等生物线虫中，发现了影响线虫寿命的衰老基因和抗衰老基因（也称长寿基因）；在过早老化的Werner综合征病入，由千DNA复制时解旋障碍，其体外培养的细胞与正常人的细胞相比，只分裂了较少的次数就发生了衰老和死亡。可以想象，随着细胞衰老的规律和机制的阐明，人类延缓个体衰老的愿望将可能实现。细胞死亡(cell death)是指细胞生命活动的结束，传统上区分为坏死和凋亡两大类，新近发现细胞焦亡是又一种形式的细胞死亡。细胞凋亡(apoptosis)是指细胞在特定条件下遵循自身的程序而结束自己生命的过程，它是由基因控制的主动性死亡，因此也称为程序性细胞死亡。细胞凋亡是个体发育过程中必不可少的生物学事件，细胞凋亡异常，将引起发育畸形，如并指（趾）、肛门闭锁、两性畸形和神经管发育缺陷等。一些神经退行性疾病，如帕金森(Parkinson)病、阿尔茨海默(Alzheimer)病等与神经元凋亡密切相关。研究细胞凋亡的机制不仅对揭示生命活动的规律，也对了解疾病的发生、发展有重要意义。细胞凋亡研究领域非常活跃，继发现引起凋亡的基因家族（如caspase, bcl-2,p53)和诱导细胞凋亡的信号转导途径（如细胞表面死亡受体途径，线粒体途径）之后，又发现了一些新的凋亡形式，如细胞失巢凋亡(ano如s)和自噬性凋亡(autophagic apoptosis)。细胞焦亡(pyroptosis)是一种新的程序性细胞死亡，表现为细胞不断胀大直至细胞膜破裂，导致细胞内容物的释放进而激活强烈的炎症反应。细胞凋亡的本质是细胞的程序性坏死，广泛参与感染性疾病、神经系统相关疾病和动脉粥样硬化性疾病等的发生发展。随着研究的深入，将会对细胞死亡的机制有更深入的了解，并有可能为细胞死亡相关性疾病的治疗提供有效手段。


医学细胞生物学 （三）细胞增殖与细胞周期调控 （五）细胞的基因组学与蛋白质组学继入类基因组序列分析完成之后，逐渐形成的基因组学和蛋白质组学将细胞生物学研究推向一个新的领域。基因组(genome)是指细胞或生物体的一套完整的单倍体遗传物质，是所有不同染色体上全部基因和基因间的DNA的总和。基因组学是研究生物基因的组成，组内各基因的精确结构、相互关系及表达调控的学科。基因的表达调控研究是近年来细胞生物学中十分活跃的领域，其中关于表观遗传调控的研究，即表观遗传学(epigenetics)是该领域新的研究热点。表观遗传学是研究没有DNA序列变化并且可以遗传的基因功能变化的学科，如DNA甲基化，组蛋白密码(histone code，指组蛋白的乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、糖基化和跋基化等影响转录因子与DNA结合的动态转录调控），基因组印记(genomi c imprinting)以及表观基因组学(e pigenomi cs)等。此外，控制基因信息流向的小RNA和长链非编码RNA的不断发现又将为阐明细胞的生命活动规律打开新窗口。可以相信，细胞基因组学研究的医学意义将不可估址。


医学细胞生物学 （三）细胞增殖与细胞周期调控 蛋白质组“proteome”源于“prote in”与“genome"杂合，是指由一个细胞、一个组织或生物的基因组所表达的全部蛋白质。细胞的蛋白质组学以细胞内全部蛋白质的存在及其活动方式为研究对象，从整体角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成分、表达水平与修饰状态，进而了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动的规律。蛋白质的亚细胞定位对蛋白质功能的发挥起关键性作用，蛋白质亚细胞定位信息暗示着其生物学功能。目前基于亚细胞成分（如细胞膜、线粒体、溶酶体、内质网、高尔基复合体、细胞核等）分离技术的亚细胞蛋白质组学(subcellular proteomics)已成为蛋白质组学研究的重要内容。蛋白质组学研究的另一途径是，着重于寻找和筛选引起2个样本之间的差异蛋白质谱产生的有意义的因素，揭示细胞生理和病理过程的本质、对外界环境刺激的反应途径以及细胞调控机制，同时获得对某些蛋白质的功能分析，此即比较蛋白质组学。因此，蛋白质组学的研究不仅能为阐明细胞生命活动的规律提供物质基础，也能为探讨疾病的机制、疾病诊治和新药开发等提供重要的理论依据和实际解决途径。


医学细胞生物学 推荐读物 [I]Tapia N, Han OW, Scholer HR. Restoring stem cell function in aged tissues by direct reprogramming?Cell Stem Cell,2012,10:653-656.. （陈誉华）第二章细胞的概念与分子基础 细胞是目前已知的所有生命体的基本组成单位。单个细胞能够成为简单生命体，复杂生命体则由具有特定功能的多种细胞组装构筑而成。现认为所有生命体的细胞均是由一个共同的祖先细胞进化而来，这种祖先细胞经过漫长的突变、选择和适应，它的后代细胞渐渐趋异进化，呈现多种多样的形态与种类，构筑成多元的生命体，呈现千姿百态的生物种群。目前已知有结构简单的原核细胞和含有细胞核与膜包裹细胞器的真核细胞两类细胞。细胞内的物质称为原生质，构成基础是分子，包括无机分子、有机小分子和生物大分子。本章将介绍细胞的基本概念及分子组成，为进一步理解细胞生物学打下基础。 第一节细胞的基本概念一、细胞的种类 细胞是构成已知所有生命体的结构性、功能性、生物性的基本单元，是最小的具有独立复制能力的生命单元。


医学细胞生物学 第一节细胞的基本概念一、细胞的种类 20世纪60年代，细胞生物学家H. Ris依据细胞的结构将细胞分为原核细胞(prokaryo tic cell)与真核细胞(eukaryotic cell)两大类。近年的研究显示，原核生物在很早的时候就演化为两大类：古细菌(archaeobacteria)和真细菌(e ubacteria)。古细菌可能是细胞生存的更为原始的类型。1990年，美国C.R. Woese提出，将生物界划分为三个域：心古菌域（祖c h aea)，包括产甲烧菌、盐杆菌、热原质体等；＠细菌域(bacteria)，包括支原体、衣原体、立克次体、细菌、放线菌及蓝藻等；＠真核域(eukruya)，包括真菌、植物、动物和人类（图2-1)。基千此分类，某些生物学家建议将生物界的细胞分为三大类型：古核细胞（古细菌）、原核细胞与真核细胞。依据目前普遍的观点以及古细菌没有细胞核和由膜包裹的细胞器，本书仍把古细菌归属于原核细胞范畴。 细菌域古菌域真核域绿色非硫细菌I甲烧八迭球菌内变形虫革兰阳性菌甲烧杆菌\＼盐杆菌纤毛虫类紫细菌I热变形菌甲烧球菌＼速生热蓝细菌火盘菌＼球菌黄细菌栖热抱菌微抱子虫类双 、


医学细胞生物学 细菌域古菌域真核域绿色非硫细菌I甲烧八迭球菌内变形虫革兰阳性菌甲烧杆菌\＼盐杆菌纤毛虫类紫细菌I热变形菌甲烧球菌＼速生热蓝细菌火盘菌＼球菌黄细菌栖热抱菌微抱子虫类双 滴虫类原核细胞外由细胞膜包绕，膜内的细胞质中无内质网、高尔基复合体、溶酶体和线粒体等膜性细胞器；有核糖体；含一条不与蛋白结合的DNA链，集中分布千细胞质一个区域内，该区域没有膜包裂被称为拟核(n u cleo i d)；原核细胞较小，直径约为1到数个微米。原核细胞的另一特点是在细胞膜之外通常有一坚韧的细胞壁(cell wall)，细胞壁的主要成分是蛋臼多糖和糖脂。常见的原核细胞有支原体、细菌、放线菌和蓝绿藻（蓝细菌）等，其中支原体是最小的原核细胞。


医学细胞生物学 细菌域古菌域真核域绿色非硫细菌I甲烧八迭球菌内变形虫革兰阳性菌甲烧杆菌\＼盐杆菌纤毛虫类紫细菌I热变形菌甲烧球菌＼速生热蓝细菌火盘菌＼球菌黄细菌栖热抱菌微抱子虫类双 1支原体是最小最简单的细胞支原体(mycoplasma)是目前已知的最小的细胞，其直径约为细菌的外表面为一层坚固的细胞壁，其主要成分为肤聚糖(pept i doglycan)。有些细菌的细胞壁外还有一层由多肤和多糖组成并具有保护功能的结构一一荚膜(capsula)，在感染真核细胞后，荚膜能够保护细菌在真核细胞内生存。在细胞壁内面为脂质分子和蛋白质组成的细胞膜。细菌的细胞膜常可分为细胞膜外膜、细胞膜内膜，以及内外膜中间的间隙。有些蛋白位于外膜上，称为外膜蛋白；有些蛋白位于内膜上，称为内膜蛋白；还有些蛋白贯穿千内外膜间。细菌的细胞膜上还含有参与代谢反应的酶类，如呼吸链酶类。细菌胞质内的拟核区含有环状DNA分子。细菌的DNA结构特点是重复序列少，编码蛋白的基因编码序列是无间隔排列在一起的，序列中无内含子。在细菌的细胞质内还含有基因组DNA以外的遗传性DNA片段，常为能够自我复制的小环状DNA片段即质粒(plasmid)。


医学细胞生物学 细菌域古菌域真核域绿色非硫细菌I甲烧八迭球菌内变形虫革兰阳性菌甲烧杆菌\＼盐杆菌纤毛虫类紫细菌I热变形菌甲烧球菌＼速生热蓝细菌火盘菌＼球菌黄细菌栖热抱菌微抱子虫类双 细菌胞质中含有丰富的核糖体，每个细菌约含5000-50000个核糖体，其中大部分游离于细胞质中，小部分附着在细胞膜的内表面。细菌核糖体的沉降系数为70S，由一个50S的大亚基和一个30S的小亚基组成，它是细菌合成蛋白质的场所。细菌蛋白质合成的特点为细胞质内基因转录形成的mRNA不需要加工，直接翻译合成蛋白。细菌胞内蛋白合成是与基因转录偶联在一起的，即一边进行基因转录一边翻译合成蛋白。


医学细胞生物学 细菌域古菌域真核域绿色非硫细菌I甲烧八迭球菌内变形虫革兰阳性菌甲烧杆菌\＼盐杆菌纤毛虫类紫细菌I热变形菌甲烧球菌＼速生热蓝细菌火盘菌＼球菌黄细菌栖热抱菌微抱子虫类双 3.古细菌多生活在极端环境中古细菌是一类单细胞微生物，没有细胞核和由膜性包裹的细胞器，属于原核生物。古细菌最初是在极端的生态环境如热溫泉和盐湖中被发现的。现在确定广泛分布于自然界中，包括土壤、海洋和沼泽。古细菌也是人微生物群的组成部分，分布千人大肠、口腔和皮肤。由于大多数的古细菌不能从实验室分离，多依赖于古细菌生活环境中的DNA序列进行分类。古细菌具有有别于真核细胞和细菌的独特特征。古细菌的大小与形态多与细菌相似，少部分古细菌具有奇特形态；基因结构与代谢途径，特别是基因转录和翻译的酶类，与真核细胞类似；古细菌可利用多种物质提供能品，包括有机物、氨、金属离子、氢气和阳光等，有些古细菌具有固氮能力，但与植物和藻O',类不同，古细菌不能同时固氮和进行光合作用；古细菌为无性繁殖，不形成抱子。


医学细胞生物学 第二章细胞的概念与分子基础三、真核细胞 真核细胞比原核细胞进化程度高、结构复杂。由真核细胞构成的生物，包括单细胞生物（如酵母）、原生生物、动植物及人类等。真核细胞区别于原核细胞的基本特征是具有由核膜包围形成的细胞核结构和由膜包裹的细胞器。 （一）真核细胞的形态与大小 高等生物由数百种真核细胞组成，其形态是多种多样的，常与细胞所处的部位及功能相关。游离千液体的细胞多近于球形，如红细胞和淋巴细胞等；组织中的细胞一般呈椭圆形、立方形、扁平形、梭形和多角形，如上皮细胞多为扁平形或立方形，具有收缩功能的肌肉细胞多为梭形，具有接受和传导各种刺激的神经细胞常呈多角形，并出现多个树枝状突起，反映出细胞的结构形态与功能密切相关。不同类型细胞的大小差异很大，一般用微米(µm)和纳米(nm)作为描述细胞大小的单位。大多数细胞的直径在10~20µm之间，但有些细胞较大，如卯细胞，人卯细胞约为lOOµm，一些鸟类动物卯细胞可达几个厘米。


医学细胞生物学 （二）真核细胞的基本结构 在光学显微镜下，真核细胞可区分为细胞膜(cell membrane汃细胞质(cytoplasm)和细胞核(nucleus)，在细胞核中可看到核仁结构（图2-3)。电子显微镜下，细胞质中可以看到由单位膜组成的膜性细胞器，如内质网、高尔基复合体、线粒体、溶酶体、过氧化物酶体，以及微丝、微管、中间纤维等骨架系统。在细胞核中也可看到一些微细结构，如染色质、核骨架。一般将在光学显微镜下看到的结构称为显微结构，而把在电镜下看到的结构称为亚显微结构(submicroscopic structure)或超微结构(ultrastructure)。


医学细胞生物学 中心线粒细胞核细胞高尔基复合 真核细胞是以生物膜的进一步分化为基础，使细胞内部构建形成许多更为精细的具有专门功能的结构单位。真核细胞虽然结构复杂，但可以从以下四个方面理解真核细胞的结构特点：1以脂质及蛋白质成分为基础的膜相结构体系一—生物膜系统生物膜系统是指以生物膜(biological membrane)为基础而形成的一系列膜性结构或细胞器，包括细胞膜、内质网、高尔基复合体、线粒体、溶酶体、过氧化物酶体及核膜等。组成这些膜性结构或细胞器的膜具有相似的单位膜(unit m e mbra n e)结构，即电镜下的内外两层致密的深色带和中间层的浅色带，膜厚度在8~10nm之间。这些膜性结构或细胞器均含有其特殊的酶系或蛋白质，在细胞内各自独立地执行其功能。如细胞膜的主要功能是进行物质交换、信息传递、细胞识别及代谢调节等作用；核膜把细胞分为细胞质和细胞核两部分，不但使遗传物质得到更好的保护，而且在维持细胞核与细胞质之间的物质交换方面起重要作用；线粒体是产能细胞器，为细胞的活动提供所需的能量；内质网是细胞内蛋白质和脂类等生物大分子合成的场所；高尔基复合体是合成物质加工、包装与分选的细胞器；溶酶体则是细胞内的消化器官，能消化分解各种生物大分子。 14第—篇细胞生物学概论 2以核酸蛋白质为主要成分的遗传信息表达体系一遗传信息表达系统真核细胞的遗传物质位于细胞核中，储存遗传信息的DNA与蛋白质结合，组装成为高度有序的染色质结构。DNA与蛋白质的结合与组装程度决定了DNA复制和遗传信息的表达状态与模式，DNA的转录产物RNA也与蛋白质结合存在于细胞内。遗传信息的流向是由DNA一RNA(mRNA)一蛋白质。mRNA在核糖体(ribosome)上翻译形成蛋白质。核糖体也称核蛋白体，电镜下呈颗粒状，直径约为l5~25nm，是合成蛋白质的机器。核糖体由RNA和蛋白质组成，RNA约占核糖体的60%，蛋白质约占40%。从组成结构上看，核糖体中的RNA主要构成核糖体的骨架，将蛋白质串联起来形成合成蛋白的机器。在一些细胞内核糖体位置可确定蛋白质在细胞内的位置，即可在细胞内对蛋白质进行定位。3由特异蛋白质分子构成的细胞骨架体系——细胞骨架系统细胞骨架(cytoskeleton)是由一系列纤维状蛋白组成的网状结构系统，广义的细胞骨架包括细胞质骨架与核骨架，狭义的细胞骨架则指细胞质骨架。细胞质骨架主要由微丝、微管和中间纤维组成，其功能是维系细胞的形态和结构，参与细胞运动、细胞内物质运输、细胞分裂及信息传递等生命活动过程。细胞核骨架由核纤层蛋白(lamin)与核骨架组成，维持核形态、基因表达、染色体包装和分布及核内分区等核内结构。4.细胞质溶胶在细胞质中除了细胞器和细胞骨架等有形结构外，其余的为可溶性的细胞质溶胶(cytosol)。细胞与环境、细胞质与细胞核，以及细胞器之间的物质运输、能撞传递、信息传递都要通过细胞质溶胶来完成。细胞质溶胶约占细胞总体积的一半，是均质而半透明的液体部分，其主要成分是蛋白质，占细胞质总址的20％左右，故细胞质呈溶胶状。细胞质溶胶中的蛋白质很大一部分是酶，多数代谢反应都在细胞质溶胶中进行，如糖酵解、糖异生，以及核背酸、氨基酸、脂肪酸和糖生物合成反应等。细胞质溶胶的化学组成除大分子蛋白质、多糖、脂蛋白和RNA之外，还含有小分子物质水和无机离子K+,Na+,Cl-、M矿和Ca2＋等。以上4种基本结构体系构成了细胞内部结构紧密、分工明确、功能专一的各种细胞器，并以此为基础保证了细胞生命活动的高度程序化与自控性。真核细胞与原核细胞比较有很大差异（表2-1)，这种差异不仅体现在形态结构上，也表现在基因组(genome)组成上。此外，真核细胞的某些细胞器也含有DNA。动物类细胞中线粒体中含有少址的DNA，可编码线粒体tRNA、rRNA和组成线粒体的少数蛋白。 特征原核细胞真核细胞 细胞结构核膜无有核仁无有线粒体无有内质网无有高尔基复合体无有溶酶体无有细胞骨架有细胞骨架相关蛋白有核糖体有，70S有，80S基因组结构DNA量（信息址）少大DNA分子结构环状线状染色质或染色体仅有一条DNA,DNA裸露，不与组蛋白结有2条以上DNA分子，DNA与组蛋白和部合，但可与少址类组蛋白结合分酸性蛋白结合，以核小体及各级高级结构构成染色质与染色体基因结构特点无内含子，无大队的DNA重复序列有内含子和大址的DNA重复序列第二章细胞的概念与分子基础在生物界中，病毒(virus)是迄今发现的最小、结构最简单的生物存在形式。绝大多数病毒必须在电子显微镜下才能看到。病毒主要是由一个核酸分子(DNA或RNA)与蛋白质组成的核酸－蛋白质复合体，含有DNA的病毒称为DNA病毒，含有RNA的病毒称为RNA病毒。有的病毒结构更简单，仅由一个有感染性的RNA或蛋白质组成。仅由RNA组成的病毒称为类病毒(viroid)，仅由蛋白质组成的病毒称为朊病毒(prion)。病毒的结构简单，不能独立完成生命活动过程，依赖活细胞才能完成它们的基本生命活动，因此病毒也被视为不“完全”的生命体，是细胞的寄生体。根据病毒寄生的宿主不同，可将病毒分为动物病毒、植物病毒和细菌病毒，其中细菌病毒又称为噬菌体。多数动物病毒进入细胞的主要方式是靠细胞的“主动吞饮”作用来实现的。进入细胞内的病毒核酸利用宿主细胞的全套代谢系统，以病毒核酸为模板，进行病毒核酸的复制、转录并翻译形成病毒蛋白，然后装配成新一代的病毒颗粒，最后从细胞释放出来，再感染其他细胞，进入下一轮病毒增殖周期。病毒在细胞内的增殖过程是病毒与细胞相互作用的复杂过程，离开活细胞后，病毒无法增殖而扩增。 第二节细胞的分子基础 组成细胞的物质称为原生质(protoplasm)，不同细胞的原生质在化学成分上虽有差异，但其化学元素基本相同。原生质的化学元素有50多种，其中主要的是C、H、0、N四种元素，约占90%，其次为S、P、Cl、K、Na、Ca、Mg、Fe等元素，这12种元素约占细胞总噩的99.9%以上。此外，在细胞中还含有数量极少的微量元素，如Cu、Zn、Mn、Mo、Co、C1、Si、F,Br、CLi、Ba等。这些元素并非单独存在，而是相互结合，以无机化合物和有机化合物形式存在于细胞中。有机化合物为有机小分子和生物大分子，是组成细胞的基本成分。 —、生物小分子 细胞内有无机化合物和有机化合物两类生物小分子。(—)水和无机盐是细胞内的无机化合物无机化合物包括水和无机盐。水是细胞中含蜇最多的一种成分，是良好的溶剂，细胞内各种代谢反应都是在水溶液中进行的。细胞中的水除以游离形式存在之外，还能以氢键与蛋白质分子结合，成为结合水，构成细胞结构的组成部分。无机盐在细胞中均以离子状态存在，阳离子如Na+, K+,ca2+、Fe2+,M忙等，阴离子有Cl-、SO广、PO广、HC03等。这些无机离子中，有的游离于水中，维持细胞内外液的渗透压和pH，保障细胞的正常生理活动；有的直接与蛋白质或脂类结合，组成具有特定功能的结合蛋白（如血红蛋白）或类脂（如磷脂）。 （二）有机小分子是组成生物大分子的亚单位 有机小分子是分子量在100~1000范围内的碳化合物，分子中的碳原子可多达30个左右。细胞中含有4种主要的有机小分子：单糖(monosaecch釭ide)、脂肪酸(fatty acid汃氨基酸(amino acid)和核昔酸(nucleotide)。糖主要由碳、氢、氧三种元素组成，其化学组成为(CH20)"，其中n通常等于3、4、5、6或7，故又称碳水化合物(carbohydrate)，是细胞多糖的亚基和能源的主要来源化合物；脂肪酸分子由两个不同的部分组成，一端是疏水性的长经链，另一端是亲水性的狻基(—COOH)，其衍生物如磷脂由一个以2条脂肪酸链组成的疏水的尾和一个亲水性的头组成，它们是细胞膜的组分；氨基酸是一类多样化的分子，但均有一个共同的特点，都有一个狻基和一个氨基，两者均与同一个a碳原子连接，它们是蛋白质的亚基；核昔酸分子由一个含氮环的化合物与一个五碳糖（戊糖）相连而成，该戊糖是含有多个磷酸基团的核糖或脱氧核糖，核昔酸是核酸的亚基。 二、生物大分子 生物大分子是由有机小分子构成的，细胞的大部分物质是大分子，大约有数万种生物大分子，分子量从10000到1000000不等。细胞内大分子由小分子组装而成，分子变大，具有与小分子截然不同的生物学特性。细胞内主要的大分子有核酸、蛋白质、多糖和脂肪，其分子结构复杂，在细胞内各自执行独特的功能。 (—)核酸携带遗传信息 核酸(nucle i c acid)是生物遗传的物质基础，目前已知的所有生物体，包括病毒、细菌、真菌、植物、动物及人体细胞中均含有核酸。核酸是生物的生长、发育、繁殖、遗传和变异的基础。细胞内的核酸分为核糖核酸(ribonucle i c acid, RNA)和脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA)两大类。其中DNA携带着控制细胞生命活动的全部遗传信息，RNA则参与遗传信息的表达。1核酸的化学组成核酸分子由几十个乃至OlICl几百万个单核甘酸聚合而成，因此核昔酸是核酸的。 基本组成单位。核背酸由戊糖、碱基（含氮有机碱） 和磷酸三部分组成。戊糖有两种，即D－核糖和D-2脱氧核糖（图2-4)。碱基也有两类：嗦呤和瞪唗。嗦呤有腺嗦呤(adenine, A)和鸟嗦呤(guanine, G);核糖2'－脱氧核糖啪淀有胞啥唗(cytosine, C)、胸腺啥唗(thymine, T)和尿啥唗（u诅cil, U)（图2-5)。除此之外，在DNA和图2-4DNA和RNA分子中戊糖的结构式RNA分子中还发现有一些修饰碱基，即在碱基的某些位置附加或取代某些基团，如6－甲基嗦呤、5－甲基胞啥唗和5－轻基胞啥唗等，因它们的含量很少，又称稀有碱基。绝大部分稀有碱基分布在RNA分子上。 严\/N------C||/\们|\N]II N|c2NH式＼多CH腺嗦呤(A)咑卿 胞瞪唗(C)胸腺啥唗(T)尿啼唗(U)图2-5常见噤呤和啼唗的结构式第二章细胞的概念与分子基础核背酸的产生过程是首先形成核昔。核昔NHi由碱基与核糖或脱氧核糖缩合而成。核糖的第1\位碳原子与啥唗第1位氮原子或与嗦呤第9位氮原子形成N—C键，即糖甘键。由于核糖有两c。种，因此核甘又分为核糖核甘（简称核昔）及脱氧核糖核甘（简称脱氧核甘）。核甘的戊糖胫基与磷酸形成酷键，即成为核昔酸。一般生物体内存在的大多是5'－核昔酸，即磷酸与核糖第5位上轻基形成酷键，如腺昔酸(AMP)、鸟昔酸(GMP)、胞甘酸(CMP)、尿昔酸(UMP)，以及脱氧腺背酸(dAMP汃脱氧鸟昔酸(dGMP汃脱氧胞昔酸(dCMP汃脱氧胸旮酸(dTMP)。此外，有时磷酸可同时与核昔上2个经基形成酷键，这就形成了环化核背酸。常见的有3',5'－环化腺昔酸(3',5'-cycl ic adenylic acid,cAMP)和3',5'－环化鸟从5'－环化鸟昔酸(cGMP)3'、5'－环化腺昔酸{cAMP)昔酸(3',5'-cycl ic guanylic acid, cGMP)（图2-6)。图2-6单核首酸的结构式核酸由大量的单核昔酸聚合而成，单核昔酸间的连接方式为：一个核背酸中戊糖的5'碳原子上连接的磷酸基以酷键与另一个核甘酸戊糖的3'碳原子相连，而后者戊糖的5'碳原子上的磷酸基又以酷键再与另一个核昔酸戊糖的3'碳原子相连，由此通过3'、5'磷酸二酷键重复相连而形成的多聚核昔酸链即为核酸（图2-7)。表2-2列出了DNA和。


医学细胞生物学 严\/N------C||/\们|\N]II N|c2NH式＼多CH腺嗦呤(A)咑卿  5'磷酸二酣键[0-f=0OH第一篇细胞生物学概论 RNA在化学组成上的异同。从化学组成上看，DNA可视为由脱氧核甘酸线性排列组成，由于各种脱氧核昔酸中脱氧核糖和磷酸都是相同的，只有碱基是不同的，因此，可用碱基的排列顺序来代表DNA的脱氧核昔酸组成顺序。DNA分子中的脱氧核昔酸或碱基的排列顺序也称DNA的一级结构。RNA则由核糖核昔酸线性排列组成。戊糖脱氧核糖核糖碱基腺嗦呤(A)鸟嗦呤(G)腺嗦呤(A)鸟嗦呤(G)胞啼唗(C)胸腺啥唗(T)胞啥唗(C)尿啥唗(U)磷酸磷酸磷酸核昔酸脱氧腺昔酸(dAMP)腺昔酸(AMP)脱氧鸟背酸(dGMP)鸟昔酸(GMP)脱氧胞昔酸(dCMP)胞昔酸(CMP)脱氧胸昔酸(dTMP)尿昔酸(UMP)3'5'2. DNA20世纪50年代初，有关DNA样品的X－射线衍射分析结果提示，DNA分子是由两条链组成的螺旋状多聚体3对来源于不同生物细胞的DNA分子的碱基含量进行分析，证明[A]=[T],[C]=[G]([］表示摩尔浓度）。1953年Watson和Crick提出了DNA分子的双螺旋结构模型（图2-8)，该模型认为，DNA分子由两条相互平行而方向相反的多核昔酸链组成，即一条链中磷酸二酷键连接的核昔酸方向是5'一3'，另一条是31-->5'，两条链围绕着同一个中心轴以右手方向盘绕成双螺旋结构。螺旋的主链由位千外侧的间隔相连的脱氧核糖和磷酸组成，双螺旋的内侧由碱基构成，即一条链上的A通过两个氢键与另一条链上的T相连，一条链上的G通过三个氢键与另一条链上的C相连，或者说A总是与T配对，G总是与C配对，这种碱基间的配对方式称为碱基互补原则。螺旋内每一对碱基均位于同一平面上，并且垂直于螺旋纵轴，相邻碱基对之5'间距离为0.34nm，双螺旋螺距为3.4nm。构成DNA分子的两图2-8DNA双螺旋结构模式匼条链称为互补链。由千组成DNA的两条链是互补的，即A=T、C圭G，因此，如果知道一条链中的碱基排列顺序，依据碱基互补原则，便可知道另一条链上的碱基排列顺序（图2-9)。


医学细胞生物学 5'磷酸二酣键[0-f=0OH第一篇细胞生物学概论 DNA的双螺旋结构易受环境因素特别是湿度所影响，在低湿度时呈A型，高湿度时呈B型，分别称为A-DNA和B-DNA，其中B-DNA即Waston和Crick描述的DNA双螺旋结构。A-DNA所形成的右手螺旋与B-DNA不同，比B-DNA较大而且较平。此外，还有入发现呈左手螺旋的DNA，称为Z-DNA。DNA的主要功能是储存、复制和传递遗传信息。在组成DNA分子的线性核昔酸序列中蕴藏着大量的遗传信息。虽然DNA分子中只有四种核昔酸，但核昔酸的数量却非常巨大，并可随机排列，这就决定了DNA分子的复杂性和多样性。如果一个DNA分子由n个核昔酸组成，则其可能的排列顺序为4n。如此多的排列顺序展示了遗传信息的多样性，即生物种类的多样性。


医学细胞生物学 5'磷酸二酣键[0-f=0OH第一篇细胞生物学概论 细胞或生物体的一套完整的单倍体遗传物质称为基因组，它是所有染色体上全部基因和基因间的DNA的总和。迄今包括入类在内的多个生物的DNA序列分析已经完成，入类基因组DNA含有的io~，飞，碱基数为2.9lxl06~3.2xl06kb(3xl09bp)，其中：（A+T)和(G+C)分别占54％和38%；编码蛋白质序第二章细胞的概念与分子基础列（外显子）占DNA的l.1%～1.4%，内含子序列占24%，基因间序列占75%；基因的数目约2万～3万个，每个基因的长度平均为2-30kb，其中功能未知的占60％以上；DNA中含有大量的重复序列，约占50％以上；每个入约有0.1％的核昔酸差异。


医学细胞生物学 5'磷酸二酣键[0-f=0OH第一篇细胞生物学概论 DNA分子中所携带的遗传信息传递给后代细胞靠DNA复制来实现，DNA双螺旋结构模型很好地解释了这一信息传递过程的普遍机制。组成双螺旋DNA的两条链是互补的，每一条链都含有与其互补链精确配对的碱基序列，因此，两条链中的每一条都可以携带相同的信息。DNA复制从两条互补的DNA链局部分离（分叉）开始，以每条链为模板，在DNA聚合酶作用下将脱氧核糖核昔酸加在DNA链的3'末端，所加上去的核昔酸是与模板链上的碱基互补的，从而产生与模板链序列互补的DNA子链。如此，可将遗传信息全盘复制出来，最终形成完整的DNA分子。新形成的双链DNA分子在核昔酸或碱基序列上与充当模板的亲代DNA分子完全相同，由于每条亲代DNA单链成为子代DNA双链中的一条链，故称为DNA半保留复制(semiconservative replication)。


医学细胞生物学 5'磷酸二酣键[0-f=0OH第一篇细胞生物学概论 DNA分子所携带的遗传信息的流向是先形成RNA，这种以DNA为模板合成RNA的过程称为转录(tra n scri pti on)。DNA转录和DNA复制不同，它以一条链的特定部分为模板合成一条互补的RNA链，在RNA合成之后，DNA重新形成双螺旋结构，并释放出RNA分子，然后，形成的RNA被翻译成体现遗传信息的蛋白质，后者决定细胞的生物学行为。近些年研究发现，不依赖千DNA序列（碱基排列顺序）的遗传信息，如DNA甲基化、组蛋白修饰等也可遗传给子代即表观遗传，这使基因组信息更加复杂，为诠释细胞的功能奠定了分子基础（详见本教材第九和第十五章）。


医学细胞生物学 5'磷酸二酣键[0-f=0OH第一篇细胞生物学概论 3. RNA DNA转录来的RNA分子也是由四种核昔酸通过3',5'磷酸二酷键连接而成的。组成RNA的四种核甘酸为腺节酸、鸟昔酸、胞昔酸和尿昔酸，与DNA分子的区别仅在于RNA中的尿密唗替代了DNA中的胸腺啥唗。此外，RNA分子中的戊糖是核糖，而不是脱氧核糖。大部分RNA分子以单链形式存在，但在RNA分子内的某些区域，RNA单链仍可折叠，并按碱基互补原则形成局部双螺旋结构这种双螺旋结构呈发夹样，也称为RNA的发夹结构（图2-10)。RNA的结构和功能的研究是近闷0i}些年来飞速发展的领域，新的RNA特别是不编码蛋白质的非编码RNA(no ncoding RNA, ncRNA)被不断地发现，表2-3总结了动物细胞内主要的RNA种类。


医学细胞生物学 5'磷酸二酣键[0-f=0OH第一篇细胞生物学概论 (l)mRNA:mRNA(messe nger RNA)约占细胞内总RNA的lo/o~5%。含量虽少，但种类甚多而且极不均一，例如每个哺乳类动物细胞可含有数千种大小不同的mRNA。原核细胞与真核细胞的mRNA不同，原核细胞没有真核细胞mRNA所特有的5'端7－甲基三磷酸鸟昔(m7G5ppp)帽子结构，也没有3'端的由30-300个腺昔酸组成的多聚腺甘酸尾巴(3'polyadenylate tail,糖－磷酸主链polyA)结构。在高等真核生物，不同组织细胞中mRNA的种类相差极大。mRNA在遗传信息流向过程中起重要作用，即携带着来源于DNA遗传信息的mRNA与核图2-10RNA发夹结构模式图糖体结合，作为合成蛋白质的模板。mRNA分子中每三个相邻的碱基组成一个密码子(codon)，由密码子确定蛋白质中氨基酸的排列顺序。因此，整个mRNA链即是由一个串联排列的密码子组成。


医学细胞生物学 5'磷酸二酣键[0-f=0OH第一篇细胞生物学概论 mRNA指导特定蛋白质合成的过程称为翻译(translation)。在原核生物，mRNA在合成的同时可直接翻译为蛋白质，而真核细胞则不同，其mRNA在合成之后需经过一系列的加工，然后才能成为合成蛋白质的模板。原核细胞的mRNA为多顺反子(polycistron)，即一分子RNA有时可携带几种蛋白质的遗传信息，能指导合成几种蛋白质，而真核细胞中的mRNA是单顺反子(monocistron)，每分子RNA只携带一种蛋白质遗传信息，只能作为一种蛋白质合成的模板。此外，不论是原核细胞的多顺反子rnRNA，还是真核细胞的单顺反子mRNA，在其5'端和3'端都各有一段由30到数百个核甘酸组成的非翻译区(untranslated region, UTR)，中间则是具有编码蛋白质功能的编砃区(co由ng region)。UTR是蛋白质翻译调控的重要靶点之一。(2)rRNA:rRN A(ribosomal RNA)在细胞中的含盘较丰富，约占RNA总噩的80%~90%，其分子量在三种RNA中也最大。rRNA的大小一般用沉降系数S表示。rRNA通常也呈单链结构，其主要功能是参与核糖体(ribosome)的形成。核糖体是合成蛋白质的机器，由大小两个亚基组成，在原核生物第二章细胞的概念与分子基础中核糖体为70S，其大小亚基分别为50S和30S,50S大亚基中含23S和5S rRNA,30S小亚基中含有16S rRNA。在16S rRNA的3'端有一个与mRNA翻译起始区互补的保守序列，是mRNA的识别结合位点。而真核生物的核糖体为80S,40S的小亚基含18S rRNA,60S大亚基则含有28S、5.8S和5S三种(3)tRNA:tRNA(transfer RNA)的含量约占细胞总RNA的5%～10%，分子较小，由70到90个核昔酸组成。tRNA化学组成的最大特点是含有稀有碱基。tRNA分子为单链结构，但有部分折叠成假双链结构，以至整个分子结构呈三叶草形（图2-11)：靠近柄部的一端，即游离的3'端有CCA三个碱基，它能以共价键与特定氨基酸结合；与柄部相对应的另一端呈球形，称为反密码环，反密码环上的三个碱基组成反密码子(anticodon)，反密码子能够与mRNA上密码子互补结合，因此每种tRNA只能转近些年研究发现，tRNA还可以作为反转录时的引物。当反转录病毒在宿主细胞内复制时，需要细胞内的tRNA为引物，反转录成与其互补的DNA链(cDNA)。可以作为引物的常见tRNA是色氨酸tRNA、脯氨酸－tRNA。


医学细胞生物学 5'磷酸二酣键[0-f=0OH第一篇细胞生物学概论  氨基酸结合臂ACC3'端3' rRNA。rRNA约占核糖体总量的60%，其余的40％为蛋白质。运一种特定的氨基酸，参与蛋白质合成。5'端:A. tRNA三叶草形结构模式图；B. tRNA分子空间结构模式图第—篇细胞生物学概论表达该小RNA的基因记作miR-181。miRNA普遍存在于生物界，具有高度的保守性。


医学细胞生物学 氨基酸结合臂ACC3'端3' rniRNA的形成与作用机制是：在细胞核内编码rniRNA的基因转录成rniRNA初级产物(prirniRNA)，在Drosha(RNase皿家族的成员）的作用下，剪切为约70~90个核背酸长度、具有茎环结构的rniRNA前体(pre-rniRNA)。rniRNA前体在细胞核－细胞质转运蛋白的作用下，从核内运输到胞质中。然后，在Dicer酶（双链RNA专一性RNA内切酶）的作用下，rniRNA前体被剪切成21~25个核昔酸长度的成熟双链rniRNA。起初，成熟rniRNA与其互补序列互相结合成所谓“双螺旋结构＂；随后，双螺旋解旋，其中一条结合到RNA诱导基因沉默复合物(RNA-induced silencing complex, RISC)中，形成非对称RISC复合物(asymmetric RISC assembly)。非对称RISC复合物通过与靶基因mRNA3'端UTR互补结合，抑制靶基因的蛋白质合成或促使靶基因的mRNA降解，从而参与细胞分化与发育的基因表达调控（图2-12)。


医学细胞生物学 miRNA初级产物miRNA前体成熟miRNA_-~尸:u_;＿－－邓基因组DNA.酝．瞿仁Drosha（剪切miRNA初级产物）Dicer非对称RISC复合物miRNA与靶基因完全互厂~iRNA与靶基因部分互补靶基因mRNA降解靶基因翻译抑制 需要指出的是，Dicer酶除了在rniRNA形成过程中起重要作用之外，还可将一些外源双链RNA加工成为22nt左右的小干扰RNA(small interferencing RNA, siRNA)。同miRNA的作用机制类似，这些siRNA也能够以序列同源互补的mRNA为靶点，通过促使特定基因的mRNA降解来高效、特异地阻断体内特定基因表达，这种现象称为RNA干扰(RNA inte1ference, RN Ai)。核酶的底物是RNA分子，它们通过与序列特异性的靶RNA分子配对而发挥作用。目前已发现了具有催化活性的多种类型的天然核酶，其中锤头状(hammerhead)核酶和发夹状核酶已被人工合成，并显示召。出很好的功能。可以根据锤头结构的模式设计能破坏致病基因的转录产物，从而为基因治疗提供新途径。


医学细胞生物学 第二章细胞的概念与分子基础23（二）蛋白质是遗传信息的功能载体 蛋白质(protein)是构成细胞的主要成分，约占细胞干重的50％以上。蛋白质是呈现DNA遗传信息的物质，决定细胞的形状和结构，担负细胞的功能。自然界中蛋白质的种类繁多，通常由20种氨基酸组成排列组合而成。


医学细胞生物学 第二章细胞的概念与分子基础23（二）蛋白质是遗传信息的功能载体 1蛋白质的组成蛋白质是高分子化合物，分子量大多在10000以上，基本单位为氨基酸，由几十个至几百个以上氨基酸组成的多聚体。自然界中有很多种氨基酸，组成蛋白质的有20种L-a－氨基酸；蛋白质氨基酸序列由mRNA上的遗传密码所编辑。每一个氨基酸都含有一个碱性的氨基(-NH2)和一个酸性的狻基(—COOH)，以及一个结构不同的侧链(-R)（图2-13)。从氨基酸的结构式可知，氨基酸为两性电解质。按氨基酸侧链－R的带电性和极性不同，可将氨基酸分为四类：即带负电荷的酸性氨基酸，带正电荷的碱性氨基酸，不带电荷的中性极性氨基酸，以及不带电荷的中性非极性氨基酸。酸性氨基酸有谷氨酸、天冬氨酸；碱性氨基酸有精氨酸、赖氨酸、组氨酸；其余氨基酸则为中性氨基酸。细胞生命活动过程中氨基酸的修饰是常见现象，如蛋白质序列中的酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸磷酸化与去磷酸化在蛋白质执行信息传递功能过程中起重要作用；组蛋白序列中赖氨酸、精氨酸的乙酰化和甲基化等行使表观遗传功能，调控基因转录等作用。


医学细胞生物学 第二章细胞的概念与分子基础23（二）蛋白质是遗传信息的功能载体 组成蛋白质的各种氨基酸按一定的排列顺序，以肤键氨基端｝狻基端}H2N—C—COOH--H3N+-C—coo-I连接而成。肤键是一个氨基酸分子上的狻基与另一个氨基酸分子上的氨基经脱水缩合而成的化学键（图2-14)。CH3妯氨基酸通过肤键而连接成的化合物称为肤(peptide)，由两非离子型离子型个氨基酸连接而成的称为二肤，三个氨基酸连接而成的称图2-13氨基酸的结构式为三肤，以多个氨基酸连接而成的称为多肤。多肤链是蛋白质分子的骨架，其中的每个氨基酸称为氨基酸残基，组成蛋白的氨基酸残基的差异体现蛋白质的特征。因此，20种氨基酸的不同排列组合顺序反映出蛋白质的结构与功能的多样性。


医学细胞生物学 肤键 2蛋臼质的结构氨基酸的排列顺序是蛋白质的结构基础，但蛋白质不只是其组成氨基酸的延伸，它是以独特的三维构象(conformation)形式存在。通过对蛋白质晶体的X－射线衍射图谱分析，可以了解到蛋白质的三维结构。1958年J. Kend rew首先确定了由153个氨基酸组成的肌红蛋白的三维结构（图215)。迄今已经有数千种蛋白质的三维结构被分析出来。这些蛋白质结构反映出来的共同特征是其多肤链的折叠(folding)。事实上，蛋白质的折叠与核糖体上蛋白质的合成同步进行，即边合成边折叠，新生肤链在合成过程中结构不断发生调整，合成、延伸、折叠、构象调路直至最后三维结构的形成。除一类可溶性蛋白分子伴侣(moleculm chaperone)参与辅助或陪伴蛋白质的折叠之外，蛋白质三维构象的形成主要由其氨基酸的顺序决定，是其氨基酸组分间相互作用的结果。图2-15肌红蛋白的三维结构根据蛋白质的折叠程度不同，通常将蛋白质的分子结构分为四级，即蛋白质的一级结构、蛋白质的二级结构、蛋白质的三级结构和蛋白质的四级结构。蛋白质的一级结构是指蛋白质分子中氨基酸的排列顺序。一级结构中氨基酸排列顺序的差异使蛋白质折叠成不同的高级结构。


医学细胞生物学 肤键 大部分蛋白质分子结构中往往有两种主要的折叠形式，即a－螺旋(helix）和B－片层(sheel)结构，这两种结构被认为是蛋白质的二级结构。二级结构是在蛋白质一级结构基础上形成的，是由千肤链主链内的氨基酸残基之间有规则地形成氢键相互作用的结果。在a－螺旋中，多肤链沿着螺旋轨道盘旋，每3.6个氨基酸盘旋一周，相邻的两个螺旋之间借肤键的亚氨基(>N—H)的氢原子与碳基(>C=O)的氧原子间形成氢键，氢键与螺旋长轴平行。细胞内的多肤在合成之后可自发地形成a－螺旋，a螺旋是多肤链最稳定的构象，主要存在于球状蛋白分子中，如肌红蛋白分子中约有75％的肤链呈氐螺旋。在B－片层结构中，多肤链分子处于伸展状态，多肤链来回折叠，呈反向平行，相邻肤段肤键之间形成的氢键，使多肤链牢固结合在一起。B－片层结构主要存在千纤维状蛋白如角蛋白中，但在大部分蛋白质中这两种结构同时存在。


医学细胞生物学 肤键 多肤链在二级结构的基础之上进一步折叠，形成蛋白质的三级结构。三级结构是由不同侧链间相互作用形成的，相互作用的方式有氢键、离子键和疏水键等。具有三级结构的蛋白即表现出生物学活性，但某些蛋白质的结构较复杂，由一条以上的多肤链所组成，需要构成四级结构才能表现出生物活性。蛋白质四级结构是在三级结构基础之上形成的，在四级结构中每个独立的三级结构的肤链成为亚单位，多肤链亚单位之间通过氢键等非共价键的相互作用，即形成了更为复杂的空间结构。这样，只有亚单位集结在一起的四级结构才显示出蛋白质的生物学活性，机体中的大部分酶类在发挥作用时即表现为四级结构。图2-16总结了蛋白质的高级结构特点，图2-17为血红蛋白四级结构的模式图。．一＄夕r«二夕口P－片层二结构域、一`_,＆«`J仓蛋白质亚单位（单体）蛋白质分子（二聚体）


医学细胞生物学 二级结构三级结构四级结构 蛋白质折叠成稳定的三维结构即构象的过程已在实验室中得到较深入的研究。某些溶剂，如尿素可以破坏折叠蛋白中的非共价键，使蛋白质去折叠成失去自然构象的松散肤链，这个过程称为蛋白质的变性。这种变性是可逆的，当去掉尿素、并加入适量的还原剂如B－琉基乙醇时，变性的蛋白质重新折叠并恢复为原来的构象，该过程谓之复性。目前蛋白质的这种折叠与去折叠的可塑性已被广泛用于基因工程过程中表达蛋白的提取与提取后的复性，3.蛋白质的结构与功能的关系蛋白质的功能取决于其结构（或构象），可以说有什么样的结构就有什么样的功能。一级结构是蛋白1nm血红素质功能的基础，如果氨基酸的排列顺序发生变化，将会形成异常的蛋白图2-17血红蛋白的四级结构质分子。例如，在人体的血红蛋白中，其B链上的第六位谷氨酸如果被第二章细胞的概念与分子基础绷镁酸替代，则形成异常血红蛋白，导致入体锦刀形红细胞贫血。一些常见蛋白如TGF书（肿瘤转化生长因子）仅在聚合成蛋白二聚体(d ime1)时，才能发挥功能。在生活细胞内，蛋白质亚单位也只有组装成大的适当的超分子结构，如蛋白质复合物、酶复合物、核糖体、病毒颗粒等，才能更好地完成生命活动过程。


医学细胞生物学 二级结构三级结构四级结构 入们通常根据多肤链的独立折叠单位，即结构域(struct ural domain)去推断某些蛋白质的功能。组成一个结构域的氨基酸残基通常在40~350之间，最小的蛋白仅含有一个结构域，较大的蛋白则含有多个结构域，此时结构域是大分子蛋白质的结构组成单元。一个蛋白质的不同结构域常常与不同的SH3结构域激酶结构域1功能相关，例如脊椎动物中具有信号转导功能的Src蛋白激酶含有四个结构域：起调节作用的SH2和SH3结构域，以及其他两个具有酶催化活性的结构域（图2-18）。一般情况，具有相同结构域的蛋白，往往有类似功能，例如，具有螺旋－环－螺旋(helix-loophelix,HLH)和亮氨酸拉链(leucine zipper,L-Zip)结构特点的蛋白质多为能与DNA结合的转录因子(transcri ption factor)。


医学细胞生物学 二级结构三级结构四级结构 活细胞内蛋白质功能的发挥与其构象的不断改变密切相关。常见的例子是蛋白质的磷酸化与C SH2结构域激酶结构域2去磷酸化所引起蛋白质构象的改变，即将一个磷酸基团共价连接至一个氨基酸侧链上能够引起蛋白质较重要的构象改变而改变蛋白的活性，去除磷酸基团，将使蛋白质恢复原始构象并恢复原始状态。蛋白质磷酸化包括通过酶催化把ATP末端磷酸基O=P?—o-团转移到蛋白质的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸侧链的轻基基团上，该反应由蛋白激酶催化，而其逆反应的去磷酸化则由蛋白质磷酸酶完成（图2-19)。细胞内包含数百种不同的蛋白激酶，每一种蛋白激酶负责不同蛋白质或不同


医学细胞生物学 二级结构三级结构四级结构 系列蛋白质的磷酸化；同时细胞内还有许多高度特异性的磷酸酶，它们负责从一个或几个蛋白质中去除磷酸基团。对许多种蛋白质而言，磷酸基团总是不断重复地被加到一特定的侧链上，然后被移去，从而使蛋白质的构象不断改变，这是真核细胞完成信息传递过程的分子基础之一。关激酶此外，磷酸基团的丢失还可驱动一类胞内重要蛋-磷酸酶-白－-GTP结合蛋白构象的巨大变化。这类蛋白的活化—--受控于其与三磷酸鸟昔(GTP)或二磷酸鸟昔(GDP)的结激酶开：：-一－一·、关合：当蛋白质与GTP结合时呈现活性构象，而其与G DP结B磷酸酶合时则变成一种非活性构象。如同蛋白质的磷酸化作用，—--该过程也是可逆的（图2-20)。这些GTP结合蛋白的活化图2-19蛋白质的磷酸化与去磷酸左右其功能的发挥与去活化起分子开关的作用，在真核细胞生命活动的信息A.蛋白质磷酸化与去磷酸化反应；B蛋传递过程中起重要作用。白激酶催化蛋白质磷酸化，可以提高也可4.酶是一类特殊类型的蛋白质酶(en zy m e)是由生以降低蛋白质活性，这取决于磷酸化的位物体细胞产生的具有催化剂作用的蛋白质。机体内的许罚和蛋白质的结构多代谢反应乃至信息传递过程均是在酶催化下完成的。 第一篇细胞生物学概论衬上GTP水解活性形式无活性形式GTP结合蛋白形成分子开关无活性形式工快活性形式 酶具有很高的催化效率，比一般催化剂高106~1010倍，和一般催化剂一样，酶只能加快反应速度，其本身在反应前后没有结构和性质上的改变。酶具有高度的专一性，即一种酶只能催化一种或一类反应C由千大部分酶具有蛋白质四级结构特点，因此，酶具有高度不稳定性，很容易受机体内各种因素影响。酶催化的特异性和高效性是由酶分子中某些氨基酸残基的侧链基团所决定的，这些氨基酸残基在酶蛋白的多肤链中处千不同部位，但通过多肤链折叠可使这些氨基酸残基彼此接近形成特定的区域，以识别和催化底物，这就是所谓酶的活性中心。有些酶除了具有活性中心之外，还有一个可结合变构剂的变构位点这类酶称为变构酶。一些物质通过与变构位点结合，调节酶蛋白构象，从而达到对酶活性的调节作用。（三）多糖存在千细胞的膜结构表面和细胞间的间质中糖在细胞中占有很大比例，细胞中的糖除了以单糖的形式存在之外，还广泛分布着多糖和寡糖。线形大分子和分支的大分子糖类可以由简单而重复的单元组成，短链称为寡糖，长链称为多糖。例如，糖原是一种多糖，它完全由葡萄糖连接在一起形成。但细胞中大部分的寡糖和多糖的序列是非重复的，由许多不同的单糖分子组成，这类复杂的寡糖或多糖通常与蛋白质或脂质连接在一起，形成细胞表面的一部分，例如，正是这些寡糖确定了一个特定的血型。因此，细胞中寡糖或多糖存在的主要形式有糖蛋白、蛋白聚糖、糖脂和脂多糖等，这些复合产物也称为复合糖。糖蛋白(glycoproteins)是共价结合糖的蛋白质，其中的糖链和肤链的连接是有规律的，常见的连接方式是N－糖肤键和O－糖肤键(carbohydrate-peptide linkage)。N－糖肤键是指糖碳原子上的轻基与组成肤链的天冬酰胺残基上的酰胺基之间脱水而形成的糖昔键；O－糖肤键则是糖碳原子上的胫基与组成肤链的氨基酸残基上的轻基脱水而形成的，具有这种性质的氨基酸有丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、经赖氨酸和胫脯氨酸等。糖脂(glycolipids)是含有糖类的脂质。根据组成不同，可把糖脂分为4类，即鞘糖脂、甘油糖脂、磷酸多粘醇衍生糖脂和类固醇衍生糖脂。哺乳动物细胞中主要存在的是鞘糖脂，在鞘糖脂中含中性糖类的称为中性鞘糖脂，有些除了含有中性糖类之外，还含有唾液酸或硫酸化的单糖，其中含唾液酸的鞘糖脂又称为神经节昔脂(gangl iosides)，含磷酸化单糖的鞘糖脂则称为硫甘脂(sulfat卜d es)。近年来在不同种类细胞的质膜上还发现了一类新的复合糖类，即糖基磷脂酰肌醇(glycosy lphos phatid ylinositol, GPI)，一些蛋白可与GPI的霖糖链结合从而铀定在质膜上。糖蛋白、蛋白聚糖、糖脂和脂多糖等复合糖主要存在于细胞的膜结构表面和细胞间的间质中。复合糖中糖链结构的复杂性提供了大晨的信息，糖链在构成细胞抗原、细胞识别、细胞黏附及信息传递中起重要作用。如人类ABO血型抗原、免疫球蛋白IgG、黏附分子整联蛋白(in tegrin)等在发挥作用过程中均离不开糖链的参与。 第三节细胞的起源与进化 细胞的起源与进化是生命科学的重要研究领域，细胞起源的过程，实际上就是生命发生的过程。目前认为，地球上所有生物的细胞都是从一个共同的祖先细胞进化而来的，最初细胞的形成经历了漫第二章细胞的概念与分子基础27长的过程，并逐渐进化为真核细胞及多细胞生物。表2-4列出了基于目前认识而推断的细胞起源与进化的时间表。 年代（距今）发生事件45亿年地球形成44亿年海洋出现38亿年生命出现（原始生命体、原始细胞形成）35亿年蓝细菌形成（原核细胞，需氧）15亿年真核细胞形成12亿年多细胞生物形成（藻类）—、原始细胞的形成（－）地球上原始生命的诞生 一般认为，原始生命是由原始地球上的非生命物质通过化学作用，经过漫长的自然演化过程逐步形成的。这个过程大至可以分为四个阶段：心从无机小分子形成有机小分子物质；＠从有机小分子物质形成生物大分子物质；＠从生物大分子物质组成多分子体系；＠从多分子体系演变为原始生命。1从无机小分子形成有机小分子物质早期的地球经过若干亿年的演变，火山喷出的气体形成原始大气，主要含有二氧化碳氮气氢气及少量的甲皖氨等，但几乎没有氧气使原始地球的大气层呈还原状态。原始大气物质在雷电、紫外线和火山爆发等因素作用下，可能聚集成简单的有机小分子，如氨基酸、核背酸、糖和脂肪酸。在实验室模拟原始地球的条件，如水中的氢气、甲烧和氨气的混合物在真空放电、紫外线照射等条件下，可形成包括氨基酸在内的各种有机小分子。因此人们推断原始地球大气的还原状态揭示了生命起源所需的基本物质。水是生命之源。在原始地球，简单的有机小分子与地壳表面的水体作用，形成含有机化合物的水溶液，在某些火山活动区域有可能形成浓的溶液。这些稀的和浓的溶液最后汇集到大的水体中。这就是现今大家普遍接受的观点：生命起源于早期地球“温暖小水池”的“有机汤”中。2从有机小分子物质形成生物大分子物质一般认为，在原始地球上形成的有机小分子被雨水冲刷到原始海洋，经过长期的进化和选择，逐渐聚合成生物大分子：核昔酸与核昔酸之间能够通过磷酸二酷键相连接，并逐步形成线性多核昔酸；氨基酸和氨基酸之间能够通过肤键相连接，并逐步形成多肤。美国科学家福克斯(F. Fox)等人曾进行合成生命大分子的模拟实验。将各种氨基酸混合，置于130-180屯下加热一个小时，或加入多磷酸后60气温育较长时间，能产生具有肤键结构的类蛋白物质。同时，还证明多核昔酸也能按这种方式生成。以上实验，说明了有机化合物和生命大分子可以在化学合成过程中实现。3.从生物大分子物质组成多分子体系生物大分子本身并不能独立表现生命现象，只有当它们形成了多分子体系时，才有可能演化成为原始生命。在早期地球的原始海洋中，由有机小分子聚合而来的生物大分子进一步形成由许多多肤分子及多肤－核酸组成的大分子，包含脂质分子在内于水溶液中，形成所谓的“团聚体”或“微球体”，漂浮在原始海洋中，构成独立的多分子体系。4从多分子体系演变为原始生命多分子体系表面可能产生和存在催化功能，能够促进各类单体的聚合，并促使产生更高级的原始蛋白和核酸，经过长期的进化过程，核酸－蛋白质微滴能够从无生命的海洋中摄取化学分子和能量，体积逐渐增大到足以分裂出与“亲代“微滴相似的“子代“微滴，并利用有利的性状组合，继续增长和分裂。当出现具有原始新陈代谢和遗传特征（自复制）时，就标志着原始的生命的产生。 第一篇细胞生物学概论 .--·-一一一一经典实验：Miller模拟实验一一一一背景知识生命起原是一个极其复杂而又难以研究的问题U为了解释生命起原的原因，科学家进行了许多探索和实验，形成了各种各样的生命起庥学说。虽然19世纪70年代恩格斯在《反杜林论》中就指出：“生命的起原必然是通过化学的途径实现的”;20世纪20年代奥巴林(A. I. Opari n)和霍尔丹(J. B. S. Haldane)相继提出生命起原的化学进化观点，认为最初的生命是在地球温度下降以后，在极其漫长的时间内，在原始地球的条件下，元机物转变为有机物，有机物发展为生物大分子和多分子体系，直到演变出原始的生命体；但这些都只是理论的推剧，还缺乏令人信服的实验证据。为了验证上述理论，1953年美国芝加哥大学研究生未勒(S. L. Miller)在其导师尤利(H. C. Urey)指导下，首次在实验室内模拟原始地球还原性大气中的的雷鸣闪电，结果从无机物合成出有机物（特别是多种组成蛋白质的氨基酸），这是生命起源研究的一次重大突破，称之为米勒模拟实验(M iller's simulated experim en t)。实验内谷实验装置如图2-21所示。将水注入左下方的500ml烧瓶内，抽出空气。 然后打开左侧的活塞，泵入CH4、NH3和凡的混 合气体（模拟还原性大气）。再将烧瓶内的水煮沸，使水蒸气驱动混合气体在玻璃管内不断循环，进入右上方的烧瓶（带有电极）中，并在其中连续图2-21有机分子的自发形成进行火花放电（模拟雷鸣闪电）一周，再经冷凝器冷却后，产生的物质沉积在管道中（模拟原始大气中生成的有机物被币水冲淋到原始海洋），然后进行取样分析。此实验结果得到的20种小分子有机化合物中，包含11种氨基酸，其中有4种氨基酸（甘氨酸、丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸）是天然蛋白质中所含有的。 发表论文 Gurdon J. The developmental capacity of nuclei taken from intestinal epithelial cells of feeding tadpoles. J Ernbryol Exp Morphol,1962,10:622-640342第四脯细胞的基本生命活动Gurdon最初的想法是研究分化成熟细胞的细胞核是否伴随基因组的改变，却意外地克隆了蛙。他的实验不仅为细胞分化的本质和规律提供了有力证据，而且为动物克隆(animal clone)研究提供了完整的技术路线。1997年，英国爱丁堡Roslin研究所的Wilmut和其同事将成年绵羊的乳腺上皮细胞的细胞核移植到另一只羊的去核的卵细胞中，成功地克隆出世界上笫一只哺乳动物一“多莉"(Dolly)羊。随后，一系列克隆动物如克隆牛、克隆狗及非人灵长类动物克隆猴等也相继问世。这些克隆性动物研究进展，给人类难治性疾病的治疗和器官移植材料的来源带来了期盼，一种以疾病治疗为目的的人类治疗性克隆研究在不断的伦理争吵声中逐步迈向医学科学殿堂。Gurdon被视为动物克隆的先驱，其研究结果也在一定程度上催生了“细胞重编程”领域的形成与发展，该领域的标志性成果是日本学者S. Yamanaka构建的iPS细胞。Gu rdon与Yamanaka共同荻得了2012年诺贝尔生理学或医学奖。已如上述，细胞分化不伴随基因组的改变，那么基因组的活动模式是什么？大量研究表明，多细胞生物个体发育与细胞分化过程中，其基因组DNA并不全部表达，而呈现选择性表达，即它们按照一定的时空顺序，在不同细胞和同一细胞的不同发育阶段发生差异表达(d iffere ntial expressi on)。这就导致了所谓的奢侈蛋白(luxury protein)即细胞特异性蛋白质的产生，如红细胞中的血红蛋白、皮肤表皮细胞中的角蛋白、肌细胞的肌动蛋白和肌球蛋白等。编码奢侈蛋白的基因称奢侈基因(luxury gene)，又称”组织特异性基因(tissue-specific gene)”，是特定类型细胞中为其执行特定功能蛋白质编码的基因。不同奢侈基因的选择性表达赋予了分化细胞的不同特征。当然，一个分化细胞的基因表达产物不仅仅是奢侈蛋白，也包含由持家基因表达的持家蛋白。持家基因(house-keeping gene)，也被称为管家基因，是生物体各类细胞中都表达，为维持细胞存活和生长所必需的蛋白质编码的基因，如细胞骨架蛋白、染色质的组蛋白、核糖体蛋白、以及参与能矗代谢的糖酵解酶类的编码基因等。一些简单的实验便可证明细胞分化的本质。例如，鸡的输卵管细胞合成卵清蛋白，胰岛细胞合成胰岛素，成红细胞合成B－珠蛋白，这些细胞都是在个体发育过程中逐渐产生的。用相应的基因制作探针，对三种细胞总的DNA的限制性酶切片段进行Southern杂交实验。结果显示，上述三种细胞的基因组DNA中均存在卵清蛋白基因、胰岛素基因和B－珠蛋白基因。然而用同样的三种基因片段作探针，对这三种细胞中提取的总RNA进行Northern杂交实验，结果表明，输卵管细胞中只有卵清蛋白mRNA,胰岛素细胞只有胰岛素mRNA，成红细胞只有B－珠蛋白mRNA。因此，细胞分化的本质是基因的选择性表达，一些基因处于活化状态，同时另一些基因被抑制而不活化。


医学细胞生物学 发表论文  （二）原始细胞的形成 1具有自我复制能力的多聚体的形成核昔酸与氨基酸能各自聚合形成大的多聚体。多聚体的形成是原始细胞形成的关键步骤。关于核昔酸与氨基酸多聚体（即核酸与蛋白质）的起源，普遍认为是首先产生了能自我复制的RNA多聚体，然后在RNA指导下合成了蛋白质。同时，多核昔酸RNA所携带的信息也因碱基互补配对从一代传到另一代。20世纪80年代以来具有催化能力的RNA即核酶的发现为这一观点提供了有力证据。核酶不仅能催化核酸的剪接，而且也能催化氨基酸间肤键的形成、以及tRNA与氨基酸之间键的形成与断裂。随着进化的演进，随机产生的某些氨基酸多聚体可能具备了某些酶的特性，它们可以作为催化剂催化RNA分子的复制，而RNA多聚体则可通过其自身核昔酸排列顺序来指导原始蛋白的合成。因此，在生命进化过程中，原始的核酸多聚体和氨基酸多聚体是相互依存、相互作用的。


医学细胞生物学 （二）原始细胞的形成 2膜的出现与原始细胞的诞生生命进化受自然界选择的影响，为了保持多核昔酸的自我复制，以及避免多核甘酸指导合成的优质蛋白质丢失，需要一个将它们包围起来的膜出现。人们推断在生命出现前的原始液体表面，磷脂分子能自发地装配成包围RNA和蛋白质的膜结构，这种初级的形态实体经过自然选择便形成了原始细胞。此时RNA的复制及RNA指导的蛋白质合成在一个由膜包绕的相对稳定的环境中进行。应该指出的是，尽管上述推测的原始细胞和现存的支原体很相似，但支原体和原始细胞不同，其遗传信息储存千DNA之内，而不是在RNA内。因此在生命进化过程中，储存遗传信息的生物大分子DNA的形成在生命体一一原始细胞形成之后，在后续的原始细胞的不断进化过程中，在蛋白质的帮助下，由RNA指导形成双螺旋DNA，以DNA方式储存的遗传信息更加稳定，而且双链形式还可提供修补的机会。由此，一些学者认为在细胞的起源过程中，RNA起到承前启后的作用。


医学细胞生物学 二、原核细胞向真核细胞的演化 原始细胞形成以后，依靠其增殖能力在进化过程中逐步获得优势，最终裂盖了地球表面。原始细胞可能是以原始海洋表面的有机物为营养的异养型原始生物。由于地球早期的地表大气层中没有游离氧，所以这类原始细胞只能通过厌氧呼吸获得能械。但是，当原始海洋内的有机物随着异养消耗而减少时，只靠异养就难以生存，因而，在新的条件下，随着原始细胞形态和功能的逐渐分化，最终产生了具有质体功能的蓝藻类的原核生物，使原始生命从异养型发展为自养型。原始细胞中出现了包圃细胞的细胞膜、储存遗传信息的DNA、指导蛋白质合成的RNA和制造蛋白质的核糖体，是原核细胞诞生的标志。一般认为，真核细胞是由原核细胞进化而来的，原始真核细胞大约在15亿年前在地球上出现。关千真核细胞如何从原核细胞进化而来，目前有两种假说：1分化起源说该学说认为，原核生物在长期的自然演化过程中，通过内部结构的分化和自然选择，逐步形成网膜系统、胞核系统和能量转换系统等，使其成为结构日趋精细，功能更加完善的真核细胞，最终形成真核生物。


医学细胞生物学 二、原核细胞向真核细胞的演化 2内共生起源说内共生学说(endosymbi ot ic hypothes is)认为，真核细胞是由原始厌氧菌的后代吞入了需氧菌逐步演化而来，进而使真核细胞能在氧气充足的地球上生存下来。 第一篇细胞生物学概沦 氧与代谢的关系在细胞进化过程中起重要作用。原始地球的大气中不存在氧，古代原核细胞的代谢途径只能在无氧条件下进行，事实上在现存的绝大多数生物中，依然保留着进化过程中保存下来的糖的无氧分解（酵解）代谢。当合成的原始有机物被耗尽时，那些能够利用大气中的二氧化碳和氮来合成有机物的细胞，便会在自然选择中存活下来。这样的细胞在合成有机物如进行光合作用时，同时把氧作为代谢产物释放到大气中。因此认为，大气中出现氧是在生物巳能进行光合作用之后的事。随着光合作用的出现，大气中的氧含址不断增高，以致成为许多早期生物的有害物质（比如对厌氧菌）。但通过自然选择，有些细胞可进化为能够利用氧来进行代谢反应。随着大气中的氧不断积累，有些厌氧菌则逐渐被淘汰，而另一些厌氧菌则与需氧型细胞结合在一起营共生生活，并逐渐形成了最早的真核细胞。


医学细胞生物学 第一篇细胞生物学概沦 人们早就推断真核细胞中线粒体的形成，是远古时期的古细菌或真核细胞吞噬真细菌的结果，但该推断无法在实验室内验证。结合细菌和线粒体基因组的序列分析，目前认为线粒体起源千15亿年前的祖先细胞—一类似a－蛋白细菌(a-proteobacterium)的真细菌对宿主古细菌或古代真核细胞的侵袭，进入宿主内的a蛋白细菌成为内共生体(endosymbionl)，即由“入侵者“变为”被俘虏者”。这样的真核细胞的出现，使代谢反应趋于复杂化，需要更多的膜表面来进行各种代谢反应，为此，在进化过程中为增加膜的表面积，细胞膜逐渐内陷并形成了各种各样的细胞器。细胞核等细胞器的出现是真核细胞区别于原核细胞的主要特征。 三、单细胞生物向多细胞生物的进化 生命进化的另一个重要步骤是由单细胞进化出现了多细胞生物。早期的真核生物均为单细胞生物，直到若干亿年后，出现了多细胞生物，然后分化成各种各样的植物和动物，最后人类从动物界分化出来。最早的多细胞生物化石距今已有近7亿年。


医学细胞生物学 三、单细胞生物向多细胞生物的进化 多细胞生物进化的早期可能是由单细胞聚集成群体。例如，黏细菌通常以单细胞阿米巴方式活动，以吞噬细菌为生，在遇到饥饿的情况下，单个细胞聚集起来，形成蚝瑜状的多细胞个体，并能进一步分化为基部、子包子梗、抱子痪等几个部分，以更有效地适应周围环境。袍子毅中每个抱子在适宜条件下可发展成一个阿米巴单细胞个体。细胞在向多细胞机体进化过程中，另一个最重要的特点是出现细胞的分化，即在多细胞的机体内，各种细胞朝不同方向发展，形成结构和功能各异的不同组织，但又互相协调成为一个有机的整体。现存的团藻可能反映出较早出现的多细胞生物的某些特征。团藻实际上是单个细胞经过多次分裂，后代仍聚在一团未曾分开而成的个体，但是在这团细胞中，已有一定的分工，有的细胞特化其运动功能，有的细胞特化其光合作用功能（产生能扯），有的细胞特化其有性生殖功能。在高等脊椎动物，清楚可辨的特化细胞有200多种，这些不同特化（或分化）的细胞形成不同的组织，如上皮组织、结缔组织、肌肉组织和神经组织等，这些组织并进一步组成执行特定功能的器官和系统。


医学细胞生物学 小结 细胞骨架是指真核细胞质中的蛋白质纤维网架体系。通常所说的细胞骨架主要是指存在于细胞质内的微管、微丝和中间纤维，称为细胞质骨架6后来又发现细胞核内也存在着细胞骨架，主要包括核基质、核纤层和朵色体骨架等，与细胞质骨架共同称为广义的细胞骨架。微管是由微管蛋白和微管结合蛋白组成的中空圆柱扶结构，在不同类型细胞中有相似结构。微管是一种动态结构，主要存在于细胞质中，控制着膜性细胞器的定位及胞内物质运输。微管还能与其o·;1?他蛋白质共同装配成纤毛、鞭毛、基体、中心体、纺锤体等结构，参与细胞形态的维持、细胞运动和细胞第七章细胞骨架与细胞的运动177分裂等。微丝是由肌动蛋白组成的细丝，它以束状、网状或散在等多种方式有序地存在于细胞质的特定空间位置上。微丝是一种动态结构，可与许多种微丝结合蛋白相结合，参与细胞形态维持、细胞的运动、肌肉收缩和细胞质的分裂等活动。中间纤维是三类细胞骨架纤维中结构最为复杂的一种，可分为六种类型。中间纤维在细胞内形成一个完整的网状骨架系统，为细胞提供机械强度支持。中间纤维还与细胞连接以及细胞内信息传递及物质运输、细胞分化有关。


医学细胞生物学 小结 有些细胞靠纤毛、鞭毛进行运动，是由微管1司的相互滑动来实现的。一些单个细胞的运动，如细胞迁移时伪足的形成就是由微丝完成的。而在此过程中细胞骨架的重排以及细胞移动的方向受到细胞外信号精密调控，并由微管和微丝来协同完成。细胞骨架的异常可引起很多疾病，包括肿瘤、一些神经系统疾病和遗传性疾病等。不同细胞骨架成分在细胞内的特异性分布可用于对一些疑难疾病的诊断，也可根据细胞骨架与疾病的关系来设计药物。


医学细胞生物学 （莫显明）第三章细胞生物学的研究方法 细胞，特别是哺乳动物的细胞，体积微小而结构复杂，因而对细胞、细胞内部的结构、细胞组分的功能及其相互关系的了解程度主要取决千所使用的研究手段和方法。细胞生物学的发展在很大程度上依赖于研究技术的进步与仪器设备的改进。一种新技术或新方法的创立与应用，常常会给学科开辟一个新的领域，或带来革命性的变化。细胞生物学研究方法很多，原理和操作步骤各不相同，但都是利用细胞及其分子的性质，以不同的方式或过程来展示细胞的生命活动。学习研究方法的目的就是为了更好地了解和阐明细胞及其分子生命活动的特性。本章将从细胞的形态观察、细胞的分离和培养、细胞组分的分离纯化和测定、细胞化学和细胞内分子示踪，以及功能基因组学研究技术等方面，对一些常用技术的原理、方法和应用作简要介绍，以期同学们能对细胞生物学研究方法有个概貌的了解，为今后从事生物医学研究打下基础。


医学细胞生物学 第一节显微镜技术 人眼的生理结构限定了其分辨能力约为lOOµm。典型的动物细胞直径为10~20µm，而核糖体、抗休、ATP等细胞内众多重要的复合体或分子的直径都在1~lOOnm的纳米尺度范围内。因此，观察细胞的生命活动必须借助显微镜。显微镜技术经历了光学显微镜技术、电子显微镜技术和纳米显微镜技术的发展阶段。降低最小分辨间隔、呈现细胞内的精细结构，甚至实时呈现活细胞内分子间的作用过程是显微镜技术发展的直接成果。对细胞生命活动进行探索的需求推动了显微镜技术的进步，而显微镜技术的进步也极大地推动了整个生命科学研究的发展。 —光学显微镜技术 尽管A. Van Leeuwenhoek在17世纪70年代用他自制的显微镜看到了细菌和动物的精子细胞，但直到l9世纪初制造出具有更高分辨能力的光学显微镜时，才确认所有的动物和植物都是由细胞构成的，即细胞学说(cell doctrine)。可以说光学显微镜与细胞生物学同步而生，不断发展，是细胞生物学必不可少的研究工具。近年来，由千各种新型示踪分子、光学原理以及计绊机数据处理等技术的应用使得光学显微技术的作用日益重要。


医学细胞生物学 (—)普通光学显微镜的分辨率 光学显微镜(l i ght mi cros(,ope)主要山聚光镜、物锐和目锐三部分组成。衡扯显微锐成像能力的主要指标是显微镜的分辨率(reso lu tion, R)。分辨率是指能够区分相近两点的最小距离。能够区分的两点的距离越小，则显微镜的分辨率越高。普通光学显微镜的横向分辨率(R,,）和纵向分辨率(R)R'-)=0.61妇．sin0,R,=2V(n·sin0)2n·sin0为镜口率，亦称数值孔径(numerical aperture, NA); n为聚光镜和物镜之间介质的折射率（空气约为1，油浸镜的镜汕为1.3-1.5);0为标本对物镜镜口张角的半角(sin0的最大值为1)；入为照明光源的波长（人眼敏感的波长为555nm，白光一般采用527nm)。


医学细胞生物学 (—)普通光学显微镜的分辨率 综合各种影响因素，普通光学显微镜理论上的横向分辨率为250nm，纵向分辨率为550nm。由千第三童细胞生物学的研究方法生物样品性质和显微镜制作工艺的限制，光学显微镜实际应用中的横向分辨率约为0. Sµm，而纵向分辨率约为lµm。线粒体大小约为0. Sµm，是普通光学显微镜通常能观察到的细胞内最小结构。一殷将光镜下所见物体结构称为显微结构(microscopic structure)。


医学细胞生物学 (—)普通光学显微镜的分辨率 普通光学显微镜的放大系统一般由物镜和目镜组成。物镜靠近被检物体，进行第一次放大，目镜靠近眼睛，将物镜放大后的图像再放大（图3-1)。物体经过两次放大后，总放大倍数为两次放大倍数的乘积。放大倍数越大并不意味着越能够看清楚更小的物体，光学显微镜的放大倍数有一个极限，可用下面的公式表示：最大放大倍数＝人眼分辨率(~100µm)=500光镜分辨率(-0.2µm)超过以上的放大倍数不会提高分辨率，属千无效放大。多数细胞总重量的70％是无色透明的水，只有很少的内含物不透光。因此，未经处理的细胞在普通光镜下几乎是看不见的。使细胞成会为可见的常用方法就是用染料对细胞的不同组分进行染色(s taining)。一些纺织用染料被发现可用千生物组织的着色，并对细胞的特殊部位具有选择性，如苏木精(hematoxylin)对负电荷分子有亲和性，能显示出细胞内核酸的分布；酸性染料如伊红(eos in)可使细胞质染色；苏丹染料(sudan dye)在脂肪中的溶解度比在乙醇中大，所以苏丹染料的乙醇饱和溶液能使脂肪着色。尽管巳发现了许多特异性染料，但其大部分的作用机制尚不清楚。


医学细胞生物学 (—)普通光学显微镜的分辨率 生物组织在染色前必须固定(fixat i on)，固定使得大分子交联而保持在原有的位置上，不至于在以后的染色等处理过程中移位或丢失而物锐产生人工假象。常用的固定方法是将组织放在固定液中，如甲酸或戊二酸溶液，这两种分子都能够与蛋白质的游离氨基酸形成共价键，从而将邻近的蛋白质分子牢固地交联在一起。大部分的组织太厚而不能在显微镜下直接观察，固定后还斋制成沛切片(sect i o n)，然后将切片黏附在载玻片表面进行染色。但由于固光源~定后组织仍很柔软，在切片前需用支持剂一蜡或树脂进行包埋(em图3-1光学显微镜bed)。适用千光镜观察的切片厚度为l~10µm。图中显示的是普通光学显（二）相差显微镜通常用千观察活细胞微镜的光路。光线被聚光在观察样品的制作过程中，细胞成分的丢失或失真通常是难以避锐聚集于样品，物镜和目免的。若想避开这个问题，只有不加固定、染色等程序，直接观察活细镜的组合能聚焦形成眼睛中的样品图像胞，这需要特殊的光学系统。光的波长决定可见光的各种色彩，振幅决定光的亮度。波长和振幅的改变能够被入眼所辨识。光在通过活细胞时，波长和振幅几乎没有改变，但由于细胞各结构的密度不同，通过致密部分（如细胞核）的光线，速度变慢，与通过邻近部位（如细胞质）的光线之间产生相位偏差或光程差，这种差异人眼不能分辨。相差显微镜(p hase contras t m icroscope)利用光的衍射和干涉效应把透过标本不同区域的光波的光程差变成振幅差，使活细胞内各种结构之间呈现清晰可见的明暗对比。观察培养细胞的结构常用倒置相差显微镜，它的特点是光源和聚光镜装在载物台的上方，相差物镜在载物台的下方，可以清楚地观察到培养瓶内的贴壁或悬浮细胞。相差显微镜的最大优点是能够观察活细胞的活动，但由千许多细胞运动缓慢，难以在短时间内完成观察，因此需要用显微电影摄影术(microcinematography)或电视录像(video recording)以一定时间间隔拍摄记录。当影片或电视录像带以正常速度放映时，所拍摄的情节就被大大地加快了，用这种方法可以准确地记录细胞或细胞器的运动过程和速度。（三）暗视野显微镜通过散射光成像暗视野显微镜(dark-fi eld microscope)是将光源以一定的角度倾斜照射到样品上，照射光无法进入物镜，只有从被照样品发出的散射光能进入物镜被放大，在黑暗的背景下呈现明亮的像。暗视野显微镜主要是观察物体的轮廓，分辨不清内部的微细构造，适合于观察活细胞内的细胞核和线粒体、液体介质中的细菌和真菌等。暗视野显微镜也可用千观察细胞的运动。


医学细胞生物学 (—)普通光学显微镜的分辨率  （四）荧光显微镜可以呈现强反差的彩色图像 荧光分子可以在吸收特定波长的光后，发射出更长波长的可见光，前者称为激发光(excitation light)，后者称为发射光(emission light)。由于荧光分子可以使被检样品呈现不同的染色，因此也称荧光染料。细胞内某些天然物质如叶绿素就是荧光分子；一些细胞成分虽然不是荧光分子，但可以用荧光分子对其进行染色或标记，这在实际当中有着广泛的应用。比如，叮唗橙能对细胞DNA与RNA同时染色，显示不同颜色的荧光。DNA呈绿色，RNA呈红色。与抗体共价结合的荧光分子，可以用来特异性地检测细胞表面或固定后的细胞内特定的抗原。


医学细胞生物学 （四）荧光显微镜可以呈现强反差的彩色图像 与普通光学显微镜相比，荧光显微镜(fluorescence microscope)在结构上的突出特点是具有两组滤光片。第一组滤光片在光源与标本之间，仅能通过荧光染料的激发光；第二组滤光片在标本与物镜之间，仅能通过激发出的荧光（图3-2)。荧光显微镜观察到的像是以暗背景为映衬的，因此具有成像反差强，检测灵敏度高的特点。此外，使用荧光显微镜观察细胞内标记了不同荧光染料的分子可以呈现彩色图像。多种对细胞内特定离子有特异亲和性或依赖于细胞内酶的催化作用才能发出荧光的活体荧光染料，使入们可以对活细胞内分子的动态变化进行实时观察。基千以上特点，荧光显微技术被广泛应用于细胞生物学研究。3第二个滤光片：阻断不需要的荧光信号，使波长在520-560nm特异的绿色荧光通过2．分光镜：510nm以下的光反射，而510nm以上的光透过1第一个滤光片：仅让波长在450-490nm的蓝光通过＾｀＃＼—物锐I旷－~I样品图3-2荧光显微镜的光学系统荧光显微镜的滤镜组包括两个滤光镜(I和3)和一个分光镜（2)。检测荧光分子荧光素的一套滤镜组如图所示。由于放大，荧光图像的亮度与物镜的镜头孔径成比例，因此，对于这种显微镜来说，高锐头孔径的物镜特别重要（五）共聚焦激光扫描显微镜可以提供高清晰的彩色三维图像用普通光学显微镜观察标本的菏切片，无法得到三维结构的信息，且光学显微镜是全视野照明，来自焦平面前后的漫射光线参与最后成像，降低了图像的反差和分辨率。共聚焦是指物镜和聚光镜第三章细胞生物学的研究方法互相共焦点，亦即两者同时聚焦到一个点，保证了只有从标本焦面发出的光线聚焦成像，焦面以外的漫射光不参加成像，因此能有效抑制背景噪声，提高信噪比，使图像更加清晰。此外，由共聚焦产生的纵向分辨率的增强，使对细胞内部结构进行“光学切片”成为可能。这是共聚焦显微镜与普通光学显微镜相比的突出优势。共聚焦激光扫描显微镜(confocal laser scanning microscope, CLSM)以单色激光作为光源，对样品焦平面进行扫描，产生二维图像，改变焦平面即可得到一系列二维图像（图3-3)。图像信息经计算机重建，就可得到完整的三维图像，并可从空间的任意角度观察标本的整体结构。


医学细胞生物学 （四）荧光显微镜可以呈现强反差的彩色图像  共聚焦针孔一一激光三维样品焦点 由针孔来的光线聚集由聚光点发射出的荧光聚光点外发射出的成一点照射到样品上聚集在针孔到达检测器光不能聚集在针孔，检测器无法检测图3-3共聚焦激光扫描显微镜A激光经针孔聚于样品的一点上；B从样品点上发出的荧光聚焦千第二个共聚焦针孔上；C从样品的其他部位发出的光不能聚焦于第二个针孔处，故不能成像。通过光束扫描样本，在焦平面上建立一个清晰的二维图像，而不受样品其他区域光线的影响CLSM多用于检测发射荧光或用荧光标记的物质，其横向和纵向分辨率一般为200nm和500nm,基本达到了光学显微镜分辨率的理论值。由于其操作简便，可观察活细胞，在细胞生物学的研究中被广泛应用。C LSM可以辨别细胞内许多复杂物质的三维结构，包括构成细胞骨架系统的纤维、染色体及基因的排列等。


医学细胞生物学 （六）超分辨光学显微镜的分辨率达到纳米尺度 光的衍射效应，即穿过小孔径后的光会发生扩散，使光不能用来观察比其本身波长短得多的细节。这是光学显微镜存在分辨率极限的主要原因。l873年德国人Ern st Abbe首先阐明了衍射效应对光学显微镜分辨率影响，确定了物镜镜口率、照明光线波长与显微镜分辨率的关系。因此，通常将由于光的衍射效应导致的光学显微镜分辨率极限称为Abbe限度(Abbe limit)。近几年来，在应用新的光学原理（如非线性光学原理）、发光／示踪分子和信号分析技术的基础上，已经建立起了实用的能够突破Abbe限度的超分辨显微技术(super-resolution microsopy)，使光学显微镜的分辨率达到了30~50nm的纳米尺度。超分辨显微技术主要是根据荧光分子的发光特性和物理机制，使距离衍射限度内的两个邻近荧光分子差异激发，以呈现分辨率超越Abbe限度的图像。也就是说，超分辨显微技术利用荧光基团的物理或化学特性，使相邻的衍射限度内的分子处千不同的“开”或“关”的状态，以使彼此区分开来。一般可将超分辨率显微技术可以分为两类：一类是集成成像技术，利用结构化光照明在空间上调制位于衍射限度内分子的荧光行为，使全部荧光分子不同时发射，以此来获得分辨率小千衍射限度的图像，如受激发射损耗(st imulated emission depletion,STED)技术、相关的可逆饱和线性荧光跃迁(reve氏i ble saturable optical linear fluorescence tran s山ons,RESOLIT)技术，以及饱和结构光照明显微技术(saturated structured illumination microscopy, SSIM)；另一类是单分子成像技术，利用光开关(photoswitching)或其他机制在不同的时点随机激活位于衍射限度内的单个分子，然后测届每一个单独荧光基团的位置，并进行三维重建，以此获得衍射限度内的图像，如随机光学重建显微技术(stochast i c optical reconstruction microscopy, STORM)、光激活定位显微技术(photoact i vated localization microscopy, PALM)和荧光光激活定位显微技术(fluorescence photoactivation localization microscopy, FPALM)。


医学细胞生物学 （六）超分辨光学显微镜的分辨率达到纳米尺度 超分辨显微技术利用可见光(380~740nm)，具有非接触、无损伤、可观测内部结构的特点。这些特点使其可以观测活的组织或细胞，并可进行内部深层三维结构成像。同本节后面介绍的能够达到纳米尺度的显微技术，即电子显微镜技术、扫描酵道电子显微镜技术和原子力显微镜技术相比，超分辨显微技术在细胞生物学研究中具有较明显的优势，随着其技术和设备的发展和完善，必将像普通光学显微镜一样，在生命科学研究中具有广泛应用。


医学细胞生物学 二、电子显微技术 光学显微镜的分辨率受照明光源波长的限制，无法分辨小于0.2µm的微细结构。电子的波长比光要短得多，电子显微镜(elec tron microscope, EM)用电子束做光源大大提高了显微镜的分辨率。电子运动越快，波长就越短，以10万伏特电压加速的电子，其波长约为0.004nm。理论上，用这样短波电子照明，显微镜的分辨率可达到0.002nm，但由于电磁透镜的相差比玻璃透镜的相差要大得多，电镜的实际分辨率不超过0.1nm。这样的分辨率用于检查金属材料时，可以清晰看到相邻的金原子间的距离(0.2nm)。生物样品由于标本的制备，反差及照射损伤等原因，电子显微镜的分辨率实际上仅约2nm，尽管如此，它仍是光学显微镜分辨率的100倍，可以观察到细胞膜、细胞核、线粒体、高尔基复合体、核糖体、中心粒等细胞器的微细结构。这种在电子显微镜下观察到的细胞的结构称为亚显微结构（subm icroscop ic structure)或超微结构(ultrastructure)。


医学细胞生物学 (—)透射电子显微镜用于观察细胞的超微结构 电子显微镜通常是指透射电子显微镜(transmission elec tron microscope, TEM)，它的总体设计与光学显微镜相似，但要大得多，且上下颠倒。照明光源是释放电子的鸽丝，作为阴极位于约2m高的镜筒顶端。电子能与空气中的分子碰撞而发生散射，故需将镜筒中的空气抽出保持高度真空状态。由灯丝发射的电子受到其下方阳极吸引而加速，通过一个中央小孔而形成电子束，沿镜筒向下运动。沿镜筒设置的精密线圈产生轴对称磁场从而作为电磁透镜使电子聚焦，就如同光学显微镜中光线被玻璃透镜聚焦那样（图3-4)。标本通过一个气闸送入镜筒，置于电子束的通道上。电子束通过标本时，根据标本各部位密度的不同，部分电子发生散射，只有剩余的电子成像，经物镜和投影镜等放大后投射到照相底片上或荧光屏上。散射的电子不参加成像，故标本中密度大的部分成像后形成电子流蜇减少的暗区，相反，标本密度小的部位散射电子少而形成明区。


医学细胞生物学 (—)透射电子显微镜用于观察细胞的超微结构 用于电镜观察的生物标本需特殊制备。电镜标本必须置于高真空中进行观察，所以含水的活组织细胞是无法观察的。为防止生物样品在死亡后和在脱水过程中产生结构改变，离体的生物标本要迅速加以固定。常用戊二醋和四氧化俄双重固定，戊二醒在蛋白质分子之间形成共价键将它们交联固定，四氧化俄除了与蛋白质共价结合之外，还对多种成分特别是对脂类有良好的固定效果。电子的穿透力很弱，镜检前必须将固定后的组织制成50~100nm，即约细胞的1/200厚度的超簿切片。为此，要将固定和脱水的标本放入液态的单体树脂中浸透，加温使之聚合成为固体的包埋块。在特定的超薄切片机上，用玻璃刀、钻石刀将包埋块切成超蒲切片，最后将切片置于直径3mm的金属载网上进行观察。


医学细胞生物学 (—)透射电子显微镜用于观察细胞的超微结构 电镜下所见到的标本的反差，取决于组成元素的原子序数，原子序数越高，散射的电子越多，反差越大。生物分子主要是由一些低原子序数的轻元索（氢、氧、碳、氮等）组成的，它们散射电子的能力笋三章2日胞生吻学的研穷方，去电子枪------l匕\/非常弱，在电镜下难以见到明暗反差。为此，常常在切片前后用一些俄、铀、铅等狱金屈的盐类浸染标本进行电子染色，以增大反差。细胞的不同成分对这些盐类有不同的亲和力，造成染色程度的不同，显示不同的反差。例如，俄对脂质容易着色，用来观察细胞的各种膜性构造效果非常好。高压透射电镜(h igh-voltage electron microscope, HVEM)的光源的加速电压一般在20万伏特以上。加速屯压在so万伏特以上则称为超高压电子显微镜。目前世界上已有加速电压在300万伏特的超高压电镜。超高压电镜由千增加了加速电压，增强了电子的穿透能力，可以观察更厚的电镜切片。在10万伏特下，可见到3~7µm厚切片中的细胞超微结构，加速电压为300万伏特时，可以观察到10µ,m厚切片内的超微结构。而且加速电压越高，电子波长越短，电镜的分辨率也越高。


医学细胞生物学 (—)透射电子显微镜用于观察细胞的超微结构 透射电子显微镜借助金属投影、冰冻断裂及冰冻蚀刻技术可获取三维图像。金屈投影法(metal shadowing)把带有干燥样品的载网放在真空罩中，高温蒸发铅或跁等重金属，使金屈颗粒以一定的倾斜角度喷向样品。这样，随着样品表面的高低起伏，重金屈形成不同厚度的薄膜，显示了投影(shadowin g)效果，给出了一个样品表面结构的三维图像。如果喷锁的样品很小或喷锁后的金属膜淜得足以使电子束透过，则可以直接用透射电镜进行观察，比如一些蛋白、核酸类大分子，病毒颗粒及细胞壁这样的样品。对厚样品则需在喷锁后将样品部分溶去，仅剩砌沛的样品的金屈复型(replica)，再用碳元素垂直喷锁形成一碳膜，加固复型，然后在透射电镜下观察复型。下述冰冻断裂与冰冻蚀刻两种技术是金属复型法的最好应用事例，为细胞生物学的研究作出了重大贡献。


医学细胞生物学 (—)透射电子显微镜用于观察细胞的超微结构 冰冻断裂(freeze-fracture)多用于观察细胞膜性结构的内部构造。将样品用液态氮(-196"C）快速冷冻后，用刀切割冻结的样品组织块。切面常常从膜脂质双层的中央疏水部通过，暴露出膜的内部构造。将暴露出的切面用铅进行喷锁，制成复型后观察。用此技术对蛋白质在膜内的分布悄况进行观察，方便、直观，具有划时代意义。冰冻蚀刻(freeze-etching)与冰冻割断法一样，低温（液态氨，－269"C）下切割后，徐徐升溫，真空下使水分升华（冷冻干燥），在细胞周围的冰迅速减少下陷的同时，细胞内的游离水也减少下陷，膜和其他一些结构暴露出来，制作复型后有显著的断面浮雕效果，用于观察细胞的内部构造。


医学细胞生物学 (—)透射电子显微镜用于观察细胞的超微结构 （二）扫描电子显微镜用于观察生物样品表面的立体结构用透射电镜观察超薄切片仅能反映细胞的二维结构，虽然可以通过观察大队的连续切片重建立体图像，但费时费力，步骤繁琐。用扫描电子显微镜(scanning electron microscope, SEM)可以直接观察标本表面的三维形态。扫描电镜比透射电镜小，结构简单。透射电镜是电子透过标本后成像，扫描电镜是电子束照射在标本后产生二次电子成像。样品衙经固定、干燥并用重金屈膜拟盖。由光源发出的非常细的电子束（一次电子）在样品表面逐点逐线地扫描，产生的散射，即二次电子信号被收集、转换放大，在电视荧光屏上同步扫描成像（图3-5)。样品产生二次电子多的部位在荧光屏上相应的点就亮，反之则暗。由千二次电子产生的多少与电子束在标本表面的投射角有关，亦即与样品的表面起伏有关，在荧光屏上就会得到样品表面形貌的立体图像。扫描电镜分辨率较低(3~10nm)，不及透射电镜，多用于细胞整体或组织的观察。


医学细胞生物学 三］电子枪样品 图3-5扫描电镜的工作原理在扫描电镜中，电磁线圈聚焦电子束扫描样品，产生二次电子，经检测器收集后在荧光屏成像（三）冷冻电镜用于解析生物大分子的结构在低温下使用透射电子显微镜观察样品的显微技术，被称为冷冻电子显微镜技术，简称冷冻电镜(c1Jo-electron microscopy, c1Jo-EM)。冷冻电镜是重要的结构生物学研究方法，它与另外两种技术：X射线晶体学(X-ray crystallography)和核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR)一起构成了高分辨率结构生物学研究的基础，在获得生物大分子的结构并揭示其功能方面极为重要。经过三十多年的发展，冷冻电镜技术已经产生了多种解析生物分子或细胞结构的方法。2017年诺贝尔化学奖授予三位冷冻电镜领域的学者，表彰他们“在开发用于溶液中生物分子高分辨率结构测定的冷冻电子显微镜技术方面的贡献”。目前备受瞩目的冷冻电镜结构解析则主要是指单颗粒三维重构技术。该方法通过对大蜇离散分布的单个分子的电子显微像进行统计分析来解析生物大分子的三维结构。


医学细胞生物学 第三章细胞生物学的研究方法 电喷雾离子化源第一质揽分析器撞击室第二质矗分析器检测器第一质盘分析器第二质盘分析器I II I II I II…—N-C-C—N-C-C-N-C-C图3-17串联质谱测定多肤氨基酸序列A串联质谱仪结构；B肤段在串联质谱中的运动过程；C.肤段断裂位点高通量测序技术堪称DNA序列分析技术发展历程的一个里程碑。该技术可以对数百万个DNA分子进行同时测序，这使得对一个物种或个体的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，因此也将其称为深度测序(deep sequencing)或下一代测序技术(next generation sequencing, NGS)。为便千理解和应用，在此首先介绍常规的DNA测序方法。DNA常规测序的原理，是基于F. Sanger建立的双脱氧链末端合成终止法。即在以单链DNA为模板的DNA合成反应体系中，利用一定比例的4种3'－双脱氧核昔三磷酸(ddNTP)代替部分脱氧核昔三磷酸(dNTP)作为底物，一旦双脱氧核背三磷酸掺入到合成的DNA链时，由于核糖的3'位碳原子上不含轻基，无法与下一个核背酸反应形成磷酸二酷键，导致正在延伸的DNA终止。目前最常应用的是四色荧光自动化测序技术。用4种发出不同颜色荧光的荧光素分别标记4种ddNTP，以一定的比例与4种无标记dNTP混合，在同一反应管中用单向引物进行DNA延伸反应，带荧光素标记的某一3'－双脱氧核昔三磷酸在掺入DNA片段导致合成终止的同时，使该片段3'端标上了这种特定的荧光素。同一反应管中大量的模板DNA经过20~30循环的单向延伸反应，最终会产生许多仅相差一个单核背酸的不同长度的单链DNA片段混合物，每个DNA片段3'末端的最后一个ddNTP，决定了该片段发出的荧光颜色。每一管中混合存在的不同长度的单链反应产物可以通过凝胶电泳在同一个泳道有效分开。检测器的激光束在凝胶的底部附近检测并记录通过泳道的每一条带所标记的荧光颜色，计算机阅读这四种颜色后得到并存储核酸序列。


医学细胞生物学 第三章细胞生物学的研究方法 与常规的DNA测序方法相比，高通量测序的原理是将DNA固定在芯片上，测序反应以大规模阵列形式排列，边合成边测序，不依赖千电泳，阵列上DNA合成时的单个碱基改变所发出的荧光信号被检测器捕获并转化为一个测序峰值，从而获得序列信息。荧光信号可以由被荧光标记的dNTP产生，也可以由DNA合成时所触发的酶催化底物激发出的荧光形成。目前应用的高通量测序技术以Roche公司的454焦磷酸测序技术、Illumina公司的Sole~a聚合酶合成测序技术和ABI公司的SOLiD连接酶测序技术为主，这些技术在测序开始时，均需要基千PCR扩增的信号放大过程。新近发展起来的以对单分子DNA进行测序（非PCR扩增）的技术，真正达到了读取单分子荧光的能力。


医学细胞生物学 第三章细胞生物学的研究方法 高通量测序技术的实际应用价值是与其他基因组水平研究技术的联合。例如，高通谥测序技术与转录组技术结合，可进行高通址的RNA测序，即RNA-seq。通过对同一样品转录组的深度测序可以捕获低表达的基因，而对大盘样品同时测序可以获得样品之间的表达差异。高通量测序技术与ChIP联合，形成ChIP-seq技术；与基因组甲基化检测技术结合，形成Methyl-seq技术；与CLIP技术结合，形成CLIP-seq技术。联合应用RNA-seq、ChIP-seq、Methyl-seq、CLIP-seq，再应用有效的生物信息学方法，对获得的数据进行深入分析，可大大加深我们对复杂基因调控系统的网络结构和相互作用方式的认识。高通量测序技术使得单细胞测序技术成为可能。


医学细胞生物学 三、其他显微技术 从1665年R. Hooke第一次使用显微镜观察细胞以来，显微镜的发展经历了光学显微镜时代和电子显微镜时代，目前扫描探针显微镜(scanning probe microscope, SPM)也得到了很好的开发和应用。扫描探针显微镜实现了人们直接观察单个原子的梦想，而且还能对原子进行操控、组合，形成具有新的物理、化学、生物学特性的颗粒。扫描隧道显微镜和原子力显微镜是扫描探针显微镜体系的主体，由于它们的分辨率和可操控的颗粒在纳米水平，因此也称作纳米显微技术。


医学细胞生物学 三、其他显微技术 （一）扫描隧道显微镜可直接观察到大分子的三维结构扫描隧道显微镜(scann i ng tunneling microscope, STM)是利用量子力学的隧道贯穿理论设计制造的，它使用一个直径为原子尺度的精密的探针在观察标本的表面进行扫描，探针尖不接触所研究样品的表面，与样品之间保持大约1nm的微小的间隙，在针尖和样品间施加一定电压，就会产生所谓的隧道效应，即在两者之间出现以一个根据观测表面形貌变化的隧道电流。当探针在平行千样品表面的恒定高度移动并扫描时（恒高方式），同步记录隧道电流的变化，就可以获得所观察物体表面的原子水平的微观信息。也可以通过反馈系统的调节，使探针尖随样品表面的变化上下移动扫描并保持恒定的隧道电流，此时记录针尖和样品表面的距离变化就可以得到表面的形貌特征（恒流方式）。


医学细胞生物学 三、其他显微技术 扫描隧道电镜的主要优点是有非常高的分辨率（侧分辨率为0l~02nm，纵分辨率0.001nm),而且可以在大气和液体等非真空状态下工作，避免了其他电镜采用的高能电子束对样品的辐射和热损伤作用，因此在细胞生物学、分子生物学和日益发展的纳米生物学的研究中得到非常广泛地应用。迄今已经直接用扫描隧道显微镜观察到自然状态下DNA分子双螺旋结构中的大沟和小沟以及大肠杆菌的环状DNA的结构。 （二）原子力显微镜可对单个分子进行操控 原子力显微镜(atomic force microscope, AFM)是在扫描隧道显微镜基础之上发展起来的新型扫描探针显微镜，与扫描隧道显微镜相比，原子力显微镜的一个突出的优点是不需要所检测的样品具有导电性，它通过分析探针尖与样品之间的原子间作用力来获取所观察表面的微观信息，这对研究通常不导电的生物材料是一项非常有意义的革新。


医学细胞生物学 （二）原子力显微镜可对单个分子进行操控 原子力显微镜的探针被置于一个弹性系数很小的微悬臂的一端，微悬臂的另一端固定。探针尖和被检测的样品表面轻轻的接触，针尖的原子和样品表面的原子之间的微弱的排斥力使对力的变化非常敏感的微悬臂的游离端发生弯曲，经过光学透镜准直和聚焦后投射在微悬臂背面的一束激光及其监测器能将这种微弱的曲度的变化转换为电流的变化。通过移动样品平台使探针在被检测材料的表面逐点作快速扫描时，样品表面的微细结构特征的三维坐标数据就被转换为图像信息并准确地呈现在屏幕上。


医学细胞生物学 （二）原子力显微镜可对单个分子进行操控 原子力显微镜的工作范围与扫描隧道显微镜相似，可以在三态（固态、气态和液态）状况下工作，但其分辨率不及后者，目前主要用于活细胞表面及生物大分子空间伸展及其结晶体表面的观测，例如肌动蛋白聚合动力学中自组织纤维的多态性分析。原子力显微镜可以对单个分子进行操作，通过检测操作后引发的生物化学反应来研究生物大分子和大分子复合物的功能，即进行所谓的分子手术(mo lecular surgery)。以扫描隧道显微镜和原子力显微镜为代表的纳米显微技术实现了人们直接观察和操控原子的梦想，也使纳米技术进入到生命科学的研究中。纳米技术与生命科学相结合，产生了21世纪最典型的交叉学科—纳米生物学。纳米生物学的发展使人们对生物大分子复合物和细胞生理活动的认识进入到前所未有的领域。 第二节细胞的分离和培养 几乎所有高等生物（包括动物和人）的组织都是由许多种不同类型细胞组成的。了解某一种细胞的生命活动过程，常需要大量的同一种细胞。这就要求从组织中分离和纯化目的细胞，并能够在体外进行培养。细胞的分离和培养是细胞生物学的基本研究技术，也是细胞生物学前沿领域（如干细胞、细胞工程等）研究和应用的实验基础。


医学细胞生物学 —、不同类型细胞的分离 利用细胞的物理学和生物学特性以及实验目的的不同，可将目的细胞从实体或悬液组织中分离出来。从实体组织中分离活细胞的第一步是将组织制备成游离的细胞悬液。通常将组织剪成小块，然后联合或独立应用机械方法（如细切、通过筛网、用力吹打等）和酶解方法，即可得到游离细胞悬液。酶解方法主要是用胰蛋白酶、胶原酶消除细胞间的连接和细胞外基质，用金属离子鳌合剂（如EDTA和EGTA)除去细胞黏着所依赖的钙离子。酶解方法在操作过程中必须遴守以下基本原则：心分离体系所用的溶液必须是等渗的，要具有缓冲性的离子强度；＠分离体系应保持低温，以降低细胞的代谢活动；＠无菌操作，以备进一步用于细胞培养和分离纯化某些成分；＠所用的试剂、器皿需要高压灭菌或过滤除菌。


医学细胞生物学 —、不同类型细胞的分离 （一）利用细胞的物理和生物学特性可简单有效地分离和筛选细胞有些类型的细胞只有黏着在培养皿表面才能进行良好的生长和增殖；有些细胞不需黏附在培养皿表面，而只是悬浮在培养基中就可以进行良好地生长增殖，即细胞具有贴壁或悬浮生长的特性。利用贴壁生长的特性，可以有效地将上皮、内皮、成纤维、骨骼肌等类型的细胞与血液细胞和操作过程中形成的死细胞分离；利用细胞悬浮生长的特性可以有效地分离出生长于血液、腹水或胸水等悬液组织中的细胞。利用细胞的密度特性也可有效分离不同的细胞。血浆白蛋白使血浆具有一定的黏稠度和密度，是一种天然的密度介质。外周血中的白细胞密度介千血浆和红细胞之间。2500g离心10分钟即可将外周血分成三层，白细胞层位于血浆层（上层）和红细胞层（下层）之间，从而将白细胞分离。在离心力的作用下，细胞可沉降于与自身密度相同的密度平衡点。因此，使用能够形成精细密度梯度的介质，如Percoll（胶体硅）等，可对密度差异较小的细胞进行精细分离。


医学细胞生物学 —、不同类型细胞的分离 分离细胞不一定需要复杂的设备，综合利用细胞本身的物理和生物学特性能够对某些特定类型的细胞进行有效分离。一般来说分离细胞采用的步骤越少，越能提高细胞的存活率和分离产量，并保护细胞原本的生活状态。此外，选择性培养和克隆化培养也是精细分离不同类型细胞的有效手段（详见第十八章细胞工程）。


医学细胞生物学 （二）流式细胞术精确分选荧光标记的细胞 流式细胞仪(flow cytometer)，也称荧光激活细胞分选仪（伽orescence activated cell sorter, FACS)是从多细胞悬液中分离目的细胞的精密仪器。流式细胞仪一般由液流系统、激光发器件、信号检测和控制系统四部分组成。通常用氢离子激光发出的激光束为激发光，通过调节液压，迫使悬浮细胞排成单第三章细胞生物学的研究方法列，按重力方向流动，当细胞通过激光束检一喷嘴振荡器测区时，细胞被激光束照射而向各个方向发出散射光，若经荧光染色的细胞，就会发.．｀—一细胞悬液出一定强度的荧光。仪器的检测系统可逐个对细胞的散射光和荧光强度进行测定，并将测得的光信号转变成电信号，由电子控制台放大和显示。因此，流式细胞仪具有更广泛的用途。在用千细胞分离上，其特点是用带有荧光的特异抗体标记待分离的细胞，然后在流式细胞仪中从未标记的细胞中分选出标记细胞。当一个有荧光抗体标记的细胞液滴通过激光检测器时，将被带上负电，不含荧光标记的细胞被带上正电，这些带电细胞液滴通过电场时将偏习－—没有荧光的离原来流动的方向，分别收集带正、负电荷液滴带正电的细胞即可得到想要分离的细胞（图3-6)。 粒，外包一层聚苯乙烯或聚氯乙烯等高分子材料。在外部磁场作用下，磁性微球可 迅速从介质中分离出来，当外部磁场撤离收集不带电的液滴的烧瓶后，微球又可重悬千介质中。由于微球的图3-6流式细胞仪原理图解外表面为聚乙烯性质的高分子材料，很容监测通过激光束的细胞的荧光。根据细胞是否带有荧光，易包被不同类型的单克隆抗体。因此利用含有单个细胞的液滴被带上负电或正电。在电场的作用下将带有不同电荷的液滴分别收集于各自的细胞收集器。注带有特定单抗的免疫磁珠与靶细胞特异结意要将细胞浓度调整到大多数液滴不含细胞并且能够流合的特点，能快速地从多细胞悬液中将目入废液缸的细胞分离出来。在操作过程中，首先将待分离细胞与包被有特定单抗的免疫磁珠混合孵育，并将分离柱安装于磁场中，然后将磁珠－细胞混合液缓慢过柱，此时在柱外磁场的作用下，与磁珠结合的细胞被磁场吸附，未结合的细胞从柱中流出，进一步洗去未结合的细胞后，去除磁场，回收目的细胞。免疫磁珠法操作简便，特异性强，具有很好的细胞回收率，同时磁珠颗粒对细胞无影响。连续两次过柱分选可进一步提高分选细胞纯度，通常可达95%-99%。（四）激光捕获显微切割技术能从组织切片中精确分离单一细胞激光捕获显微切割技术(Laser capt ure microdissection, LCM)虽然不能用千分离活细胞，但其突出优点是能够从组织切片中精确地分离单一的细胞。其一般过程是：制备组织切片（通常是冰冻切片），在显微镜下将组织切片稷以特制的透明薄膜，用激光束切割所需的细胞区域，覆膜在激光束经过的地方被溶化，并与下面的细胞紧密连在一起，然后再用另一激光束将其弹出到细胞收集管（图37)。分离的细胞可用于生化与基因组分析等研究。激光捕获显微切割技术将形态学观察与分子水平研究有机结合起来，特别适用于待分离细胞在组织（切片）中的数蜇较少或呈散在分布的情况。目前第一篇细胞生物学概论迅速发展的激光捕获显微切割技术正在与高通量的基因芯片技术结合，将在生物医学领域中得到广泛应用。 激光束切割所需部位肿瘤组织切片第二束激光使被切割的组织弹出到容器中玻璃显微锐玻片 图3-7激光显微切割技术激光显微切割允许从组织切片中选择分离细胞。这种方法使用激光束切割所需部位并将其弹出到容器中，因此即使单个细胞也可以从组织样品中分离细胞培养(cell culture)是指细胞在体外的培养技术，即无菌条件下，从机体中取出组织或细胞，模拟机体内正常生理状态下生存的基本条件，让它在培养器皿中继续生存、生长和繁殖的方法。通过细胞培养可以获得大谥的、性状相同的细胞，以便千研究细胞的形态结构、化学组成及功能和机制。(—)细胞培养的全过程必须在无菌的环境下进行细胞培养的全过程必须在无菌的环境下进行。为避免环境中的微生物及其他有害物质的影响，需要特殊的无菌室。无菌室应包括操作间和缓冲间两部分。操作间要求有供无菌操作的超净工作台、观察培养细胞的倒置显微镜、离心细胞的小型离心机、及复苏细胞和预热培养基的水浴锅等。培养细胞所需要的氧和二氧化碳由接有二氧化碳钢瓶的培养箱提供。培养箱中充填二氧化碳的目的是用来缓冲和维持细胞培养基的pH，提供适宜细胞生长的酸碱度。细胞生长的营养物质由培养基供给。目前常用基础培养基有Eagle氏培养基、RPMl-1640、DMEM及F l2培养基等。这些基础培养基虽然组成不尽一致，但都含有细胞所需要的氨基酸、维生素和微温元素等成分。基础培养基只能提供细胞生长的简单营养物质，细胞实际培养时，还需要添加一些天然的生物成分，其中主要是血清。血清含有许多生长因子，促进细胞贴壁和增殖。不同的细胞培养需要选择不同的培养基。


医学细胞生物学 激光束切割所需部位肿瘤组织切片第二束激光使被切割的组织弹出到容器中玻璃显微锐玻片  （二）细胞培养的主要方式是原代与传代培养 体外培养的细胞可分为原代细胞和传代细胞。直接从体内获取的组织或细胞进行首次培养为原代培养(primary cul ture)；当原代细胞经增殖达到一定密度后，将细胞分散，从一个培养器以一定比例移到另一个或几个容器中的扩大培养，为传代培养(secondar-y culture)。传一次习惯上就称为一代。用这种方法可以重复传代数周、数月以至数年。但若反复传代，不仅会消耗大址的培养皿和培养基，而且传代次数的增加、在体外环境中的生长时间过长也会引起细胞特性的逐渐变化，特别是大部分组织来源的细胞不能在体外“永生”，因此，需要将培养的细胞及时冷冻在－196气的液氮中长期保存，待需要时将细胞复苏后再培养。


医学细胞生物学 （二）细胞培养的主要方式是原代与传代培养 （三）来源于体内的细胞可以在体外建系多数原代培养的脊椎动物细胞，在体外经过有限次数的传代培养之后就会死亡。来源千人和动物正常组织的细胞，在体外传代次数一般不超过50代。例如，从胎儿中分离到的成纤维细胞可传50贫o··,，代，来源千成人肺组织的成纤维细胞只能传20余代。通常来源千恶性肿瘤组织的细胞能够在体外无第三章细胞生物学的研究方法限繁殖、传代，称为细胞系(cell line)。例如来源于宫颈癌组织的HeLa细胞系，于1951年建立，至今仍在世界各地的实验室应用，成为“永生“细胞。正常组织培养的细胞在某些特殊条件下，如放射线照射、化学致癌物处理或癌基因转染等，也能形成“不死”的变异细胞，成为具有肿瘤细胞系性质的细胞。


医学细胞生物学 （二）细胞培养的主要方式是原代与传代培养 在细胞建系过程中，无论是自肿瘤组织中分离的细胞，还是正常组织细胞经特殊诱导后产生的“不死“细胞，均需对其生物学特性加以鉴定。还可以用细胞克隆化(cloning)的方法进一步改善细胞系的均一性，即分离出单个细胞使之增殖形成细胞群(colony)。由此产生的细胞群称为细胞株(cell strain)，它来源于一个克隆(clone)，是一个具有相同性质或特征的培养细胞群体。迄今世界上所建立的各种能连续传代的细胞系和细胞株达5000余种。许多国家的研究机构均设有细胞库，随时可以供研究者使用。产孛..一经典实验：Hela细胞的建系


医学细胞生物学 [背景知识 :20世纪50年代，组织培养技术已经有近五十年的历史，嗤齿动物肿瘤细胞已在多年前由W. Lew i s培养成功并保持着稳定的生长状态。当时的肿瘤学家非常渴望得到能够在体外无限生长的人类肿瘤细胞。有了这样的细胞就可以对肿瘤进行细致的可重复的观察，并可以用它为材料进行在人体无法进行的实验研究。当时肿瘤学家相信，荻得人类的肿瘤细胞就可以找到治愈肿瘤的方法。尽管人们为此进行了大量的尝试，人类肿瘤细胞的培养在当时还没有荻得成功。这种状况在G. Gey得到Henrietta Lacks的宫颈癌组织之后发生了根本转变。实验内容1951年2月1日，已有5个幼子的黑人妇女Lacks由于绝经并有出血来到马里兰州巴尔的摩的霍普全斯医院，为其进行桧查的H. Jones医生发现Lac ks的宫颈有一个柔软的、微紫色的肿瘤，取活组织进行病理诊断后确定为恶性。8天后Lacks来到霍普全斯医院进行放射治疗，在治疗前她的肿瘤组织再次被取下了一些，这些组织被送到了霍普全斯医院组织培养研究负责人G. Gey的实验室。当时的组织培养实验室与现在迥然不同，没有超净工作台，Gey和他的合作者，他的妻子M. Gey，只能在本生灯（类似煤气灯）火焰下的无菌区工作。没有商品化的合成培养基和已过滤除菌的不同类型的动物血清，Gey进行组织培养前要去屠宰场从鸡心脏抽血以制备血浆，然后再去屠宰场取牛胚胎用来制备组织匀浆孜，还要去产房吸取人肵带血，用这些混合物制备成培养基来支持组织细胞的体外生长。在Gey的妻子M. Gey极其小心谨慎地日复一日地养护下，Lack s的肿瘤细胞开始在试管中生长，并表现出了旺盛的生命力。这些肿瘤细胞吸附在试管壁上，消耗看浸润着它们的培养液，由它们形成的细胞层越来越厚。肿瘤细胞的这些特性是已经进行了近20年人类细胞培养研究的Gey前所未见的。在使用胰蛋白酶消化，进行扩大培养后，Lacks的肿瘤细胞持续性生长。1951年10月4日Lacks辞世的那一天，Gey在电视中宣布他荻得了笫一株可在体外培养条件下持续生长的人类的肿瘤细胞细胞系，这株细胞系的名称就是Henrietta Lacks的头两个字母的组合—HeLa。


医学细胞生物学 [背景知识  后续影响 小鼠胚胎干细胞系的建立，已经对小鼠遗传学和小鼠的生长发育，以及与人类健康相关的许多医学问题等方面的研究产生了重要的影响。后未的大量研究，也都证明了小鼠胚胎干细胞在被移植入小鼠裳胚后确实可以参与小鼠的正常发育。特别是基因转移、基因定点突变以及干细胞转化后的双向选择等技术体系在胚胎干细胞中的成功应用，使得基因工程小鼠（如基因剔除小鼠、基因替换小鼠以及大片段转基因小鼠等）的产生有了可能。基因工程小鼠的出现，为进行基因功能研究提供了一个完美的研究体系。当然，1998年建立的人胚胎干细胞系，对生物医药领域的影响也是巨大的，因为它的增殖和分化特性，为人类疾病治疗方法的发展带来了新的希望。


医学细胞生物学 后续影响 现在已经知道，组织干细胞参与组织器官的生长发育，并持续存在千其个体的整个生命过程。成体组织中的组织干细胞（也称成体干细胞，adu l t stem cell)存在于相应的干细胞巢(stem cell n iche)内，其基本生物学功能是通过有序的增殖与分化，以实现其所在组织中细胞的新旧更替，并维持组织器官结构和功能的稳态(h omeostasi s)。一般认为，在哺乳动物的所有组织中都有组织于细胞的存在。然而，由于不同的组织干细胞都具有各自的时空特性，对于它们的研究通常都需要特定的研究策略和研究方法，这就增加了研究的复杂性。但随着研究的深入，研究手段越来越丰富，入们对组织干细胞的生物学特性的认识也越来越深入和全面，目前人们关注的热点更多地集中在组织千细胞与疾病发生或个体衰老等医学问题的关系上。 第三节细胞组分的分离和纯化技术 细胞生物学研究经常涉及对细胞器或分子进行功能分析，但细胞器或功能分子总是存在千细胞内部的多种结构或混合成分之中，因此需要对细胞器和功能分子进行分级分离。


医学细胞生物学 —、细胞裂解 由于细胞外膜和内膜的分隔作用，使人们不能直接获得亚细胞结构和功能分子，需要进行细胞裂解。细胞裂解导致的渗透压变化及多种水解酶的释放，能够破坏细胞器，失活甚至降解细胞的功能分子，因此需在裂解液中加入渗透压维持剂和蛋白酶抑制剂等成分。尽可能保护各种亚细胞结构固有的功能和细胞功能分子的活性，是细胞裂解的基本原则。使用物理的方法裂解细胞可以避免损伤亚细胞结构，如低渗透压、超声振荡、强制通过微孔、机械破碎或研磨等。这些方法使细胞膜及内质网膜等破裂成为断片，断片立即自我封闭形成小泡，而细胞内的各种亚细胞结构如细胞核、高尔基复合体、线粒体、溶酶体、过氧化物酶体等基本不受损伤。常常把由内质网形成的小泡称做微粒体(microsome)。这些膜性成分与细胞的蛋白、核酸、多糖、离子等功能性分子悬浮在细胞裂解液中，形成浓稠的匀浆(homogenate)。


医学细胞生物学 —、细胞裂解 去垢剂能够溶解细胞的膜性结构，并且破坏蛋白分子之间的疏水相互作用，提高蛋白的溶解性，常用于细胞裂解。去垢剂包括离子型（如阴离子去垢剂十二烧基磺酸钠，SDS)、非离子型（如TritonX100和NP-40)和兼性离子型（如CHAPS)等几类。离子型去垢剂对膜的溶解作用强，细胞裂解充分，但易引起蛋白质变性；非离子型去垢剂作用温和，对细胞裂解不彻底，但在适当浓度下可以选择性地抽提细胞质蛋白；非离子型和兼性离子型去垢剂不影响蛋白的等电点，常用于双向电泳样品制备中。一般根据样品来源和实验目的的不同，单独或联合使用多种类型的去垢剂。尿素、盐酸肌、异硫饥酸｝狐等离液剂(c haotropi c age nt)也广泛应用于细胞裂解。但它们对蛋白和膜脂具有较强的变性作用，常用丁无需保持蛋白活性的样品制备和细胞DNA和RNA的抽提中。


医学细胞生物学 二、细胞器及细胞组分的分级分离 离心方法是分离提取亚细胞结构和功能分子的重要手段。利用细胞内各种颗粒成分的大小、形状和密度不同，采用差速离心或密度梯度离心的方法将其分离。蛋白、核酸等细胞的功能分子存在于亚细胞结构的基质或细胞匀浆离心后形成的上清中，可利用层析技术或离心技术进一步分离纯化。电泳技术可对分离纯化得到的终产物进行初步的鉴定。 （一）差速离心分离体积、质量差别较大的颗粒 差速离心法(differen tial centrifugation)是分离细胞核、线粒体等亚细胞结构常用的方法。在密度均一的介压中，颗粒沉降速度与其直径成正比，颗粒越大沉降越快。低速离心时，大的组分如细胞核和没破坏的细胞很快沉降，在离心管底部形成小的沉降团块；在较高速度时，线粒体沉降成块；在更高彸";1速度加长时间离心，可以先收集封闭小泡，然后收集核糖体（图3-8)。


医学细胞生物学 低速离心第三童细胞生物学的研究方法 由于离心沉降前，各种颗粒在介质中是均匀分布的，因而某些慢沉降颗粒被裹到快沉降颗粒的沉降块中，如此分级分离所得到的分离组分纯度不高，再次悬浮小沉降块中的组分，反复离心可去掉杂质而纯化。应用物理的方法，在等渗缓冲液中裂解细胞，离心后获得的细胞匀浆中含有膜性结构完整的细胞器。这些细胞器的表面分布有特异性的蛋白，如位千线粒体外... 膜参与蛋白转运的TOMM22，过氧化物酶体表面参与蛋白转运的PM70。利用能够识别这些标志的磁珠(mag netic beads)，无需高速离心，即可将膜性细胞器从细胞 匀浆中方便地分离出来。含有整个细胞、 细胞核和细胞骨架用100OOOg将细胞匀浆超速离心，可以将各种细......上清进行中速离心胞器及微粒体沉降下来，上清部分即包含分布于细胞内..t.细胞器之间的液相成分，即细胞质溶胶(cytosol)。细胞•..


医学细胞生物学 质溶胶是细胞内蛋白质合成及其他主要生化反应的场.所，含有RNA及大量的蛋白。（二）速度沉降分离沉降系数不同的颗粒 ..上述差速离心只能将那些大小显著不同的成分分含有线粒体、溶酶体和过氧化物酶体的沉淀开。速度沉降(velocity sedimentation)则可进行更精细..


医学细胞生物学 上清进行高速离心含有微粒体和上清进行超速离心小泡的沉淀含有核糖体、病毒大分子的沉淀 图3-8用离心法进行细胞成分的分级分离逐渐提高离心速度可以使细胞匀浆按成分分离。一般来说，亚细胞成分越小，所需离心力越大。图中所示各步离心的数值如下：低速1000g, JO分钟；中速20OOOg,20分钟；高速80OOOg,1小时；超速150OOOg,3小时的分离。分离方法是在离心管中加入稀盐溶液，将细胞的抽提液在盐溶液上覆一薄层。为防止对流混合，在离心管中制备由顶部到底部逐渐增加的庶糖溶液的密度梯度（通常5%～20%）。离心后混合物中的各成分以不同的速度沉降，形成不同的沉降带，各沉降带可分别收集（图3-9A)。不同组分的沉降速率取决于它们的大小与形状，通常用沉降系数(S)值表示。许多细胞组分，如蛋白质和核酸的沉降系数在1-200S之间。目前超速离心机的转速可以达到85000转／分，产生的离心力为重力的600000倍。在这样巨大的离心力下，即使较小的生物分子，如tRNA分子和简单的酶分子都可根据它们的大小将其分开。超速离心法可以根据生物大分子的沉降系数较精确的测定其分子量。


医学细胞生物学 （三）平衡沉降分离密度不同的颗粒 另一种精密的超速离心分离方法是平衡沉降(equ ilib rium sedimentati on)法，它取决千细胞成分的浮力密度，与大小形状无关。平衡沉降方法是在离心管中制备由顶部到底部高浓度差的庶糖或氯化绝(ces ium chl oride)溶液密度梯度，可把细胞匀浆均匀分布在庶糖或氯化艳介质中后超速离心。匀浆中的不同组分沉降至与自身等密度处时不再移动，形成沉降带，各沉降带再分别收集（图3-9B)。用这种方法可以将摄入与未摄入同位素13C或15N的同一种生物分子离心分开。用氯化绝制备密度梯度，进行平衡沉降方法1957年被开发，因分离细菌中15N标记DNAA B与非标记DNA而直接证明了DNA是半保留复制，使这一实验成为历史性的实验。稳定的（四）非细胞体系有助于确定各种细胞庶糖梯度器及其他细胞成分的功能的荒糖梯度通过对经超速离心分离得到的细胞器及其I他亚细胞成分的研究，可以确定各种细胞器及离心v细胞成分的功能。例如，用离心纯化的线粒体和叶绿体进行实验，得知这些细胞器在能量转换中的重要作用。同样，分离由糙面内质网或光面内质网的断片形成的封闭颗粒，将其作为快沉降成分研究糙、光面内质网功能的模型也取得了很好I的效果。从分级分离得到的具有生物功能的细分级分离i胞抽提物称为非细胞体系(cell free system)，广泛应用于细胞生物学研究。因为只有用这种方法，才能将某个生物过程与细胞中发生的其他高密度成分复杂的反应分割开来，从而确定其详细的分子机制。应用这种方法所取得的早期成果是阐明了蛋白质合成机制。首先发现，细胞粗提物可以从RNA翻译出蛋白质。把粗提物进行分级分离，即可得到与蛋白质合成有关的核糖体、tRNA及各种酶的成分。各种纯化的组分一旦得到后，就可以分别地采取加入或不加入进行对照，弄清楚每个组分在蛋白质合成过程中的图3-9速度沉降和平衡沉降离心的比较确切作用。在确定了蛋白质合成过程中的各在速度沉降(A)中，亚细胞成分样品置于含有庶糖的成分的作用之后，体外非细胞体系蛋白翻译系稀溶液上层，根据其大小与形状以不同速度沉降。为统被成功地用于破译遗传密码，即用已知序列稳定沉降带，离心管内由上至下需制作成5%~20%的合成多核昔酸仵为mRNA，在体外翻译成的连续庶糖梯度；在平衡沉降(B)中，离心形成庶糖密度梯度（用更高浓度的氯化绝分离蛋白与核酸分子效多肤。果更好），亚细胞成分根据自身的密度或升或降，以达到与庶糖同样密度的位置三、蛋白质的分离与鉴定蛋白质是细胞内的最主要成分，它们不仅参与形成细胞的各种结构，还几乎是细胞所用功能的执行者。因此，分离和鉴定各种目的蛋白，也是当今细胞生物学不可缺少的技术。


医学细胞生物学 （三）平衡沉降分离密度不同的颗粒 将蛋白质进行分级分离并最终进行纯化，常常需要综合运用多种分离手段才能够完成，包括盐析、有机溶剂沉淀、各种常规层析、高压液相层析(high performanc e liquid chr omatography, HPLC)等。要根据目的蛋白质在组织或细胞中的含量，蛋白质分子量的大小，蛋白质的理化性质及检测方法来摸索、选择合适的途径。(—)用层析的方法纯化蛋白质分离纯化细胞中某种特定的蛋白质最常用的方法是柱层析(column c h romatography)。可以将细胞匀浆或经过盐析、有机溶剂沉淀等处理的样品在常压或高压下，通过用固体性颗粒充填形成的柱，不同的蛋白质因与颗粒相互作用的不同而被不同程度地滞留。当它们从柱的底部流出时，可被分别收集（图3-10)。


医学细胞生物学 （三）平衡沉降分离密度不同的颗粒 彸妇，根据所选择的充填颗粒的不同，常用的柱层析可以分为：心离子交换层析，充填颗粒带有正电或第三章细胞生物学的研究方法时间分别收集流出的已被分开分子图3-10柱层析法分离蛋白质将含有多种成分的样品添加到充满浸没于溶剂的固体基质的圆形玻璃株或塑料株的顶部，随后，大址溶剂缓慢流过柱子，将底部流出的液体分别收集于不同试管。由于不同样品成分在柱中的移动速率不同，因此可以分离后收集千不同的试管负电，蛋白质按其表面电荷的分布而被分离（图3-llA)；＠凝胶过滤层析，充填颗粒为多孔性的凝胶颗粒，根据蛋白质的大小将其分离（图3-1lB)；＠疏水性层析，将疏水性基团共价结合在充填颗粒上，不同蛋白质表面疏水区域会有强弱的差异，流出柱的速度也不同；＠亲和层析，把能够与蛋白质表面的特定部位进行特异性结合的分子共价连接于惰性多糖类颗粒上，如酶的底物、特异性抗体或抗原（图3-ll C)，根据蛋白质亲和性的不同将其分离。亲和层析分离纯化重组蛋白为最常用的方法。


医学细胞生物学 （三）平衡沉降分离密度不同的颗粒 值得强调的是，由于蛋白质的结构、理化性质的复杂多样性，除了带有特殊标签的人工表达蛋白质以外，很难找到针对某种特定蛋白质的特异性亲和层析法。因此，大部分蛋白质的分离纯化需要多种方法，包括多种柱层析法的组合，才能够达到目的。普通柱层析法由于充填颗粒的不均匀等因素，使通过柱的液相流量不均，导致分离能力下降。高压液相层析是将直径在3~l0µm之间的微小球型树脂（通常为硅胶树脂）用特殊的装置均匀充填在层析柱中。由于颗粒小充填紧密，必须加高压才能使液相流过。高压液相层析所用层析柱多为不锈钢柱，分离时间短、效率高，可用来分析各种大小分子，但所需仪器精密，造价高。各种层析方法包括高压液相层析，多可以维持蛋白质不发生变性，保待蛋白原有的功能。但高压液相层析的反向层析柱常常被用来分离小分子蛋白、用酶或化学试剂切断的蛋白质的多肤混合物，根据多肤亲疏水性特点，流动相采用梯度有机溶剂。


医学细胞生物学 （二）用电泳的方法分析、鉴定蛋白质 由于氨基酸带有正电荷或负电荷，蛋白质往往带有净正电荷或净负电荷。将含有蛋白质的溶液加上电场，蛋白质分子就会按照它们的净电荷多少、大小及形状的不同在电场中移动，这一技术称为电泳(elecu·op h oresis)。最初，用淀粉等多孔性基质为支持体，分离水溶液中的蛋白质混合液。但后来，丙烯酰胺逐渐成为最常用的支待体。1. SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳依据分子量的不同分离蛋白质20世纪60年代中期，利用阴离子表面活性剂十二烧基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate, SDS)进行改良的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS polyo-.


医学细胞生物学 多孔粒子月雹5·．十十．十佥I.干－.．A．离子交换层析B．凝胶过滤层析溶剂流动吆士上勺口沪妇物的粒子c．亲和性层析 图3-11三种常用的层析法工作原理在离子交换层析(A)中，不可溶的基质上的荷电离子阻滞带有相反电荷分子的移动。可溶性分子与基质结合的强度取决于各自的离子强度与溶液的pH；在凝胶过滤层析(B)中，基质是惰性的多孔粒子，能够进入基质的小分子因旅程长而溶出延迟。根据多孔粒子孔径的大小可以分离分子噩500-5xl06的分子；亲和性层析(C)中特异配体，如抗体、酶底物等，被共价连接在基质上以结合特定蛋白。当被固定的底物与酶分子特异结合后，酶分子可以被高浓度的游离底物重新溶出。而与固定抗体结合的蛋白，可以用高盐溶液或高、低pH溶液使抗原－抗体复合物分离而使抗原蛋白溶出。仅通过一个亲和层析柱，常可以得到高纯化蛋白ac1-ylamid gel electrophoresis, SDS-PAGE)，成为常规的蛋白质分析方法。使单体丙烯酰胺交联聚合成聚丙烯酰胺凝胶作为蛋白质在其中移动的支持体，根据需要控制凝胶孔的大小。先将待分离的蛋白质样品置于SDS溶液中，SDS的疏水端与蛋白质的疏水区结合，其带负电荷的亲水端互相排斥，使折叠的蛋白质分子展开成为伸展的多肤链（图3-12)。此外，常常加入2－琉基乙醇(2-mercaptoethanol,2ME)或二硫苏糖醇(dithiothreitol,DIT)类的还原剂，使蛋白质中所有的S-S结合键断裂。SDS加还原剂的处理使蛋白质分子失去与其他蛋白质或脂质成分的联系而游离地溶解于溶液当中，也使蛋白质自身的亚单位之间的连接分开。由于所有蛋白质都带有大量的负电荷，蛋白质自身原有的电荷可以忽视，电场中所有蛋白质都向正极迁移，其中小分子比大分子通过凝胶网孔要容易得多，因而迁移快。结果复杂的蛋白质混合物完全按分子量大小依次被分离，经蛋白质染色后，可以观察到整齐排列的条带（图3-12)。


医学细胞生物学 多孔粒子月雹5·．十十．十佥I.干－.．A．离子交换层析B．凝胶过滤层析溶剂流动吆士上勺口沪妇物的粒子c．亲和性层析 2.等电聚焦电泳依据等电点不同分离蛋白质蛋白质是否带电荷，是带正电荷还是带负电荷，是由溶液的pH决定的。当溶液在某一pH条件下使某一蛋白质不带电荷时，这个pH就是这种蛋白质的等电点(i soelectric point)。所有的蛋白质都有自己特定的等电点，由于不带电荷，在电场中就不会移动。等电聚焦电泳(isoelectric focusing)是在丙烯酰胺凝胶两端形成电场，使含有不同等电点的两性电解质(ampholyte)在电场当中形成pH梯度，样品中所有的蛋白质在电泳时都向自己的等电点处第＝章细胞生物学的研究方法A B平板丙烯酰胺凝胶。


医学细胞生物学 多孔粒子月雹5·．十十．十佥I.干－.．A．离子交换层析B．凝胶过滤层析溶剂流动吆士上勺口沪妇物的粒子c．亲和性层析 图3-12sos－聚丙烯酰胺凝胶电泳(SOS-PAGE)A电泳装置；B单个多肤链与荷负电的SDS分子形成复合物，因此，荷负电的SDS－蛋白复合物在多孔聚丙烯酰胺凝胶中向阳极移动。在这种条件下，多肤的分子量越小，移动速度越大，因此这种技术可被用于确定多肤链和蛋白亚基的分子楹。但是，如果蛋白质含有大批碳水化合物，那么该蛋白在凝胶中的移动速度不规范，用SOS-PAGE测得的表观分子量不准确移动，最后聚集、静止于各自的等电点。等电聚焦电泳分离效果很好（图3-13)。3双向电泳有更好的分离效果单一方向的蛋白质电泳，不管是SDS-PAGE还是等电聚焦，都难免有许多蛋白质由于分子量或等电点的相近或相同而导致相互重叠。把等电聚焦与SDS-PAGE结。 稳定的梯度 低pH时，++等电点(pH6.5)时，十：．＋＋二．蛋白净电荷为零蛋尸尸气产壹i fl.,.++1在电场中不再移动+1I.


医学细胞生物学 高pH时，蛋白带负电荷。e)图3-13等电点电泳分离蛋白质 低pH（高H＋浓度）时，蛋白质的狻基倾向千不带电荷(—COOH)，含氮碱性基团带正电荷（如：－NH3+），使大部分蛋白质净电荷为正。高pH时，蛋白质的狻基带负电荷(—COO-），碱性基团倾向于不带电荷（如：—NH2)，使大部分蛋白质净电荷为负。在一个蛋白质的等电点时，正负电荷平衡，所带净电荷为零。因此，电场中管状凝胶形成一个固定pH梯度时，每种蛋白质都移动至它的等电pH，聚集成一条带第一篮细胞生物学概论合进行双向电泳能够产生十分好的分离效果。方法是先在长条状凝胶介质中进行等电聚焦电泳，然后将凝胶条横放千聚合好的平板SDS－丙烯酰胺凝胶上再进行垂直电泳。普通的实验室自制的凝胶进行双向电泳可以辨认千种以上不同的蛋白质，使用商业化的条状等电点疑胶及平板SDS丙烯酰胺凝胶加上相应的仪器设备，可以使分辨数量及效果大大增加。双向电泳法在蛋白质分析技术不断进步的今天，仍然被广泛应用，特别是在初步筛选、分析正常与异常组织、细胞中蛋白质表达情况方面仍有不可替代的作用。


医学细胞生物学 高pH时，蛋白带负电荷。e)图3-13等电点电泳分离蛋白质 双向电泳显现的差异蛋白质条带或点(spot)，常常用质谱技术进行进一步鉴定。单向或双向后的SDS-PAGE也可以进一步通过蛋白质印迹(Western blotting)技术检测特定目的蛋白质分子（见本章第五节）。 四、核酸的分离纯化与鉴定(—)差速离心沉淀是核酸分离纯化的常用方法 DNA和RNA是细胞重要的功能分子。无论DNA还是RNA，它们在细胞中总是与蛋白质结合，以复合物的形式存在千细胞中。进行核酸分离纯化的过程就是使核酸与细胞内的其他组分分离，去除纯化试剂的污染，并保持核酸一级结构的完整性。细胞中的DNA分子主要存在千细胞核和线粒体中，RNA分子在细胞核和细胞质中广泛存在。细胞核中的染色体DNA是长的线性分子，相对稳定，纯化过程中产生的机械剪切力即可使其断裂。线粒体DNA是环形分子，一般需以线粒体为起始材料，才能获得高纯度的线粒体DNA。RNA分子较不稳定，且RNA酶广泛存在，防止降解是RNA分子纯化过程中的主要注意事项。


医学细胞生物学 四、核酸的分离纯化与鉴定(—)差速离心沉淀是核酸分离纯化的常用方法 核酸的高负电荷磷酸骨架使其比蛋白、脂类、多糖等细胞内其他组分具有更高的亲水性，可通过选择性沉淀和差速离心使核酸与它们分离。在纯化过程中一般加入对应的核酸酶，而选择性地保留DNA或RNA分子。异硫氝酸胀等离液剂可使膜脂、蛋白变性，释放出细胞内的核酸分子，是核酸抽提液的主要成分。纯化过程中加入氯仿，可去除细胞内的脂类，并使更多的蛋白变性，易于核酸分离纯化。同RNA相比，DNA分子量高，易千集聚。在细胞裂解后进行高速离心，RNA分子能够保留在上层水相中，使RNA与DNA分离。蛋白酶K能够水解细胞内的蛋白和膜蛋白，能使DNA酶和RNA酶失活，也具有裂解细胞的作用，并且蛋白酶k不易失活，在65°C仍能保持活性，常添加在DNA的抽提液中。


医学细胞生物学 四、核酸的分离纯化与鉴定(—)差速离心沉淀是核酸分离纯化的常用方法 通过离心沉淀的方式可获得保留在水相中的核酸分子。钠离子可中和磷酸骨架的负电荷，在酸性条件下可促进DNA的疏水复性，加入乙醇后，低温孵育，可有效沉淀DNA分子。异丙醇可降低水溶液的极性，一般用来沉淀RNA分子。另外，硅胶膜可有效地吸附溶液中的核酸分子，巳广泛地应用到了全自动核酸纯化技术中，适应了后基因组时代大样本核酸分析的需求。 （二）凝胶电泳是核酸分离鉴定的主要方法 经离心沉淀分离纯化的核酸(DNA和RNA)分子，通过凝胶电泳可直接判定核酸的纯度、完整性及片段大小。核酸电泳常用的支持体为琼脂糖(agai·ose)与丙烯酰胺(ac1-ylamide)。与蛋白质电泳相比，核酸电泳更简单。因为核酸分子中的每个单核昔酸都带有一个负电荷，在碱性条件下向阳极移动，故可以按照其构成碱基数的多少被有效地分离。


医学细胞生物学 （二）凝胶电泳是核酸分离鉴定的主要方法 琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可直接进行电泳，结果观察方便。但琼脂糖凝胶电泳分辨率相对较低，不适合分离100碱基以下的核酸分子。可根据待测核酸分子的大小调节琼脂糖浓度。丙烯酰胺凝胶电泳分辨率高，一般多用于500碱基以下的DNA分子片段的分离与测序，可以将两条仅相差一个碱基的DNA片段分开。建立在琼脂糖凝胶电泳基础之上的印记杂交技术，如Southern印迹杂交(Southern blot)和;1Northern印迹杂交(Northern blot)技术，是分子细胞生物学研究的常用方法（见本章第五节）。


医学细胞生物学 第三章细胞生物学的研究方法第四节细胞化学和细胞内分子示踪技术 形态与功能相结合是细胞生物学研究的突出特点，显示细胞内大分子、小分子甚至是无机离子在细胞内分布的分子示踪技术对细胞生物学的研究尤为重要。目前实验室普遍应用的细胞内分子示踪技术是基千光镜和电镜的细胞化学技术。细胞化学技术(cytochemistry techniq u e)是一类将细胞形态观察和组分分析相结合的分析方法，是在保持组织原有结构的情况下利用生物大分子、小分子、无机离子的物理、化学特性来研究它们在细胞内的分布、数量及动态变化，包括酶细胞化学技术、免疫细胞化学技术、原位杂交技术、放射自显影技术等。随着检测分析仪器的进步和以荧光染料为代表的活体染料的广泛使用，细胞内的分子示踪技术已经能够对活细胞内的分子进行实时的动态观察。


医学细胞生物学 一、酶细胞化学技术 酶是细胞绝大多数生命活动过程的最终执行分子，细胞内各种酶的分布和活性变化，如蛋白激酶、蛋白酶、过氧化物酶等，反映了细胞的生理状态和病理状态的变化。酶细胞化学技术(Enzyme cytoc h e mis t1y)就是通过酶对特异底物的反应并显色来检测酶在器官、组织和细胞内的分布及酶活性强弱的一种技术。酶细胞化学反应的基本原理是将酶与其底物共同孵育，然后使产物与显色剂反应生成荧光分子、有色可溶性化合物、有色沉淀或高电子密度沉淀，最后通过光度计、光镜、电镜等进行检测和观察。


医学细胞生物学 二、免疫细胞化学技术 抗体对抗原的严格特异性使之成为细胞生物学的一种有力工具。免疫细胞化学技术(immunocytochem istry, ICC)是利用免疫学中抗原抗体特异性结合的原理来定性和定位研究器官、组织和细胞中的生物活性大分子的技术。用荧光染料标记的抗体，在荧光显微镜下，可以对细胞中的特殊分子进行定位。将电子密度高的胶体金标记抗体，则可在电镜下高分辨观察特定分子的分布情况。为了提高检测其灵敏度，可以将荧光物质或酶类标记与一级抗体结合的抗体（二级抗体），而不是标记与抗原直接反应的抗体（一级抗体）。每个一级抗体上可以结合多个二级抗体，因此进行荧光检测或酶与底物的显色反应，可大大增加信号的强度。


医学细胞生物学 三、放射自显影技术 天然存在的元素，大多是同位素的混合物。同位素间尽管核重品不同，但核外电子数相同，化学性质也相同。放射性同位素(radioi sotope)的核不稳定，随机衰变成为另一种原子的同时，释放出B或丫射线。放射性同位素很少天然存在，需在原子炉中用高能粒子轰击原子产生。生物学研究中常用的放射性同位素有32p、Ill I、35S、'4c、“Ca、3H等。放射线可以用几种不同方法检测。如果是B粒子可以用盖革计数器或液体闪烁计数器定量计数。常常用这种方法对生物样品中放射性同位素标记的某种分子进行定性或定量检测。


医学细胞生物学 三、放射自显影技术 放射性自显影技术(autoradi ography)是用放射性同位素标记生物样品中的大分子或其前体物质，然后通过乳胶感光（卤化银还原成为银原子），显示出被标记物在组织和细胞内的位置、数址及其变化。在放射性同位素实验中常用的“S、'4c、3H是弱放射性同位素，32p是强放射性同位素。实验中常切H亮氨酸和35S蛋氨酸标记蛋白质，用3且岩藻糖和3H－甘露醇标记糖类，3H－胸腺瞪唗脱氧核昔、3H－胸昔或3且尿甘标记核酸。放射性自显影技术的具体操作步骤是：首先，用注射、掺入、脉冲标记等方法将放射性化合物渗入活细胞，培养不同时间后取样固定，制备光、电镜切片；在暗盒中把感光乳胶裂盖在切片上存放数日。由千放射性同位素衰变使乳胶感光（自显影过程），经过显影和定影，根据银盐颗粒所在位置即可知道细胞中放射性物质的分布情况。例如，用放射性前体3H－胸昔，3H－尿昔分嘘{t:i别脉冲渗入培养细胞，显示DNA是在细胞核中合成并保留在核内，而RNA最初在细胞核内合成，然后很快积累于细胞质中。放射自显影是一种很灵敏的技术，在适宜的条件下几乎能检测出放射性原子的每次衰变，在细胞生物学研究领域中曾经发挥并且还在发挥着重要的作用。 四、活细胞内分子示踪 普通的细胞化学技术虽然能反映出细胞内生物分子的存在位置及其与细胞功能的关系，但这种技术在应用过程中通常是观察固定后的细胞内的分子分布情况，与活细胞中分子的分布存在一定距离。活细胞内的分子示踪则克服了这一缺点，近些年来被广泛应用于细胞的生理功能研究。 (—)离子探针进行细胞内离子的实时检测 细胞内离子有着重要的生理功能，它们有的是信号转导的信使（如钙离子），有的是酶催化所必需的（如钠、钾、钙、镁、铜、铁、锌、猛等离子），有的通过离子通道跨膜转运影响膜电位（如钠、钾等离子），有的则促进膜的融合（如钙离子）。细胞内离子的实时检测将揭示一些生理过程的机制。一些染料专一地与某种离子结合后会产生荧光或改变本身荧光的发射波长与强度，从而通过荧光检测可以显示该离子的量。通常称这些染料为离子探针。如果将它们导入细胞内，就能在时间与空间上显示活细胞内某种离子的动态变化。（二）绿色荧光蛋白常被用千显示特定蛋白质在细胞内的定位绿色荧光蛋白（驴·een fluor esce nt protein, GFP)是应用最广泛的研究蛋白质亚细胞内定位的报告分子。GFP最初从水母中分离，含有238个氨基酸残基，是一种构象很稳定的蛋白质。它不含辅基，也不需要辅助因子，在蓝色光源(450~490nm)的激发下，发射出绿色荧光(520nm)。GFP基因可以很容易地导入到其他种类的细胞当中去表达。构建绿色荧光蛋白基因与目的蛋白基因的融合基因表达载体，转染特定的细胞，可以在荧光显微镜或者是共聚焦显微镜下观察目的蛋白质在细胞内的位置及随时间变化情况。在大部分情况下，所表达的融合蛋白的状态是由目的蛋白决定的，也就是说融合蛋白中的GFP仅仅是一个标记物，不影响另一部分目的蛋白在细胞内的真实定位（图3-14)。通过点突变的方法研究GFP的结构与功能，发现一些突变蛋白的光吸收与荧光行为发生改变，由此开发出多种不同颜色“GFP”。目前常用的有不同激发光与发射光谱的“GFP“包括GFP、黄色荧光蛋白(YFP)、青色荧光蛋白(CFP汃蓝色荧光蛋白(BFP)等。此外还有相应的荧光强度较大的增强绿色荧光蛋白(EGFP)、增强黄色荧光蛋白(EYFP)、增强青色荧光蛋白(ECFP)等，其中EGFP与GFP的不同在于有F64L和S65T两个点突变。细胞的信号传递过程、酶的失活或激活过程、受体和配体的结合等重要的分子事件都依赖于蛋白与蛋白的相互作用。虽然GFP的融合蛋白能够提供许多信息，也可以研究几种蛋白质的细胞内共图3-14辅酶II依赖性视黄醇脱氢－还原酶选择定位，但不能给出蛋白与蛋白有直接相互作用的证性剪接体亚型(NRDRB1)在Hela细胞中的据。此时，荧光共振能量转移就有了广泛应用。定位（三）荧光共振能量转移可实时观察细胞内蛋图中绿色荧光显示了N－末端与GFP融合的NRDRBl在HeLa细胞内的分布，红色荧光是特异白质与蛋白质相互作用性标记的过氧化物酶体，两种颜色的荧光重叠处细胞内蛋白质发挥功能的主要方式之一是不发出黄色荧光。该图说明NRDRBl仅有部分与过同蛋白质之间的相互作用并形成复合物，荧光共振伈3氧化物酶体重叠，从而定位到过氧化物酶体能量转移是检测蛋白质之间相互作用的新方法。 第五节细胞功能基因组学研究技术 现代细胞生物学强调在基因与蛋白质等分子水平上理解细胞的功能。基因表达水平的变化与细胞行为的变化密切相关。提高或降低某一基因在细胞内的表达，观察与之相应的细胞行为的变化，是确定基因功能的主要方法。在入类基因组计划获得的理论和技术突破的推动下，细胞生物学研究已经能够在全基因组的水平考察细胞功能和特性的变化，进入了功能基因组学时代。 —、基因表达的定量分析 基因功能性产物（包括蛋白、RNA分子）含量的变化是真核细胞尤其是哺乳动物细胞基因表达调控的主要方面。定最地确定基因表达水平的变化，是现代细胞分子生物学研究的基本要求。(—)印迹杂交技术是定量检测基因表达变化的基本方法20世纪80年代后相继建立了能够定量检测RNA和蛋白质分子的Northern、Western印迹分析技术(Blotting）。其基本过程都包括：电泳分离待检测分子，将待检测分子转移到可方便操作的硝酸纤维素膜或PVDF膜上，然后将带有报告基团的探针（或抗体）与膜杂交（或孵育），最后通过同位素或化学发光试剂显示目的分子的条带，通过条带的深浅可判断目的分子的含噩和分子蜇大小。North ern印迹分析是检测组织或细胞中特异性mRNA的方法。它以带有放射性或非放射性物质标记的单链cDNA、RNA片段或寡核昔酸为探针，检测RNA分子，不仅能够定橄检测基因表达水平(mRNA)的变化，而且能够提供基因不同转录本的转录长度信息。对小的RNA分子，如长度约20nt的miRNA分子，Northern印迹分析也能有效地检测。在进行检测时，首先从组织或细胞中提取总RNA或mRNA，在琼脂糖凝胶电泳之前需要对RNA样品进行变性处理，以破坏RNA分子中的局部双螺旋结构，使整个RNA分子呈单链（便千分子杂交）。常用变性剂为甲醒或戊二酪。Western印迹分析检测的是蛋白质分子，它是在蛋白质水平定量检测基因表达改变的主要方法，首先将经细胞裂解而获得的蛋白质样品进行SDS-PAGE分离，然后依次经过印记、抗体孵育和显示蛋白质条带等步骤。Wes tern印迹分析以抗体分子作为检测分子，不仅能够识别细胞中不同种类的蛋白分子，而且能够识别同一种蛋白分子的不同修饰方式，如磷酸化、甲基化、泛素化等，是考察蛋白质含盎、大小和活性状态的重要方法。印迹分析是低通量的检测技术，步骤较繁琐，花费时间长。但印迹分析检测不需昂贵设备，结果准确，少有假象，也常被用于验证生物芯片等高通罹研究方法获得的结果。 （二）原位杂交可提供基因表达的时空信息 组织细胞中基因的表达不仅存在量的差异，而且还存在表达时间和空间的变化。核酸原位杂交技术(in situ hybridization, ISH)是在RNA水平检测这些变化的基本方法。原位杂交以短的单链cDNA、RNA片段或寡核背酸为探针，将探针与经过固定并提高了通透性的细胞、组织切片或胚胎进行杂交，以荧光分子或显色酶为报告基团，显示特定RNA(mRNA)分子在组织或细胞内分布，通过荧光信号或显色的强弱可以判断含量的变化。原位杂交没有组织和细胞的裂解步骤，并通过固定的方法将RNA分子保持在组织和细胞内的原位，因此展示细胞和组织内特定基因表达的时间和空间变化。（三）荧光实时定量PCR技术是检测基因表达变化的常规方法聚合酶链式反应(polymerase chajn reaction, PCR)能够在体外对特定DNA序列进行重复性复制（扩增）。其反应体系包括：模板DNA、耐热的DNA聚合酶、引物、4种脱氧核昔酸(dNTP)及适当的反应缓冲液。PCR反应一般分为变性、退火、延伸三步骤进行：首先在95"C进行DNA双链解离；然后在50~65"C之间进行引物与DNA链的互不结合，即退火；最后在72"C由耐热DNA聚合酶合成与模板互补的新的DNA链。此三步骤重复20~30个循环即可完成扩增反应。普通PCR反应可以对目的DNA片段进行高效地克隆，能够非常灵敏地检测目的DNA片段。但由千PCR高效的指数扩增过程，在扩增结束后不同含量的初始模板都具有几乎相同量的终产物，因此不能对初始模板进行定盘。荧光实时定量PCR(fluorescence real-time quantitative PCR, qPCR)技术在PCR反应体系中加入与DNA双链结合后能够发出荧光的荧光染料，或能够与靶序列结合并带有荧光报告基团的探针。在PCR反应过程中，每次反应循环后，都会检测反应管中的荧光强度。以反应管中荧光强度达到阔值时所需的PCR反应循环个数(Cp值），表示模板中目的片段的初始含量。由于是在PCR反应进行过程中的检测，而不是在PCR反应结束时的终点检测，因此荧光实时定量PCR技术能够进行目的DNA片段的定量分析。在检测组织细胞中基因表达时，首先需要将分离提取的RNA(mRNA)反转录(reverse transcription)为cDNA，然后再行荧光实时定量PCI从因之，qPCR也常称为荧光实时定量RT-PCR，是检测基因表达改变的简便方法。 二、基因表达的上调和下调技术 为确定基因的功能，常需要在细胞和个体中对基因进行方向相反的两个操作，即提高基因表达水第三章细胞生物学的研究方法平（上调）和降低基因表达水平（下调）。与个体水平的基因操作技术相比，在细胞水平很容易对目的基因的表达水平进行控制。熟练掌握基因的克隆技术是进行基因表达上调和下调研究的前提。基因克隆，通常指cDNA克隆(cDNA cloning)，即将mRNA逆转录形成的cDNA或通过体外聚合酶链式反应得到的基因片段，插入到能进行自我复制的载体（通常是质粒，plasmid)，实现在受体细菌内大量扩增的过程。克隆过程中用到的载体被称为克隆载体(clon in g vector)。为开展基因表达的上调和下调研究，需要借助适当的限制性核酸内切酶(restriction nuclease)，从含有目的基因片段的克隆载体中酶解出目的基因DNA，转移到能够启动目的基因表达的表达载体(expression vector，通常是质粒或病毒载体）中。（一）外源性基因在细胞中的过表达是上调基因表达的主要方式通过脂质体包裹的基因转染(transfection)或病毒介导的感染等技术（详见本书第十八章），就可以将带有外源性基因的表达载体导入动物和人类细胞。在表达载体启动子的驱动下，外源基因将获得过表达(over-expression)，从而实现上调细胞中的目的基因表达。（二）RNA干扰技术是下调基因表达的常用方法近年建立的RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术可比较简便地在低等生物（如线虫）或哺乳动物细胞水平对特定基因进行降低或功能丧失的操作。RN儿的基本原理：一定数址的外源性双链RNA(dsRNA)进入细胞后，被类似千核糖核酸酶皿的Dicer酶切割成短的21-23bp的双链小干扰RNA(small interferencing RNA, siRNA), siRNA与解旋酶和其他因子结合，形成RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex, RISC)。激活RISC需要一个依赖ATP的将小分子RNA解双链的过程。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3'端12个碱基的位置切割mRNA。尽管切割的确切机制尚不明了，但每个RISC都包含一个siRNA和一个不同千Dicer的RNA酶。因此，siRNA能够以序列同源互补的mRNA为靶点，通过促使特定基因的mRNA降解来高效、特异地阻断体内特定基因表达，诱发细胞呈现出特定基因表达降低(knock down)表型。RN儿技术操作简便，主要步骤是：首先人工化学合成或酶促合成RNA双链，然后直接通过脂质体包裹、或克隆到特殊的表达载体等技术将其转染到体外培养的哺乳动物细胞，主要用于基因功能研究。也可以根据靶基因设计短发卡RNA(short hairpin RNA, shRNA)，克隆到表达载体。转染后的表达载体可以表达由环拌连接的正反义互补的短干扰RNA序列，行使RN儿的作用。另外，利用慢病毒构建的shRNA载体，与化学合成的siRNA和基于瞬时表达载体构建的shRNA相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，可用于感染依靠传统转染试剂难以转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。 （三）CRISPR/Cas9基因编辑技术 CRISPR的全称为：成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regulru-ly interspaced short palindromic repeats); Cas是CRISPR连接蛋白(CRISPR associated prote in)。CRISPR序列构成了决定切割位点特异性的非编码RNA,Cas基因编码的Cas蛋白具有核酸酶活性。CRISPR序列转录产生两个非编码RNA分子，依靠重复序列互补形成异二聚体，再与Cas蛋白结合。Cas蛋白能够将异二聚体RNA剪切加工成为一端为有20个碱基向导序列的成熟RNA分子(gRNA)。这段向导序列能够特异识别基因组DNA分子的互补序列，而Cas蛋白再次利用核酸酶活性将DNA分子切断。在向导序列的3'端，Cas识别的DNA位点还必须有一个PAM(protospacer adjacent motif)区域。在酿脓链球菌的CRISPR系统里，紧跟于靶序列后的PAM序列是5'-NGG。而Cas识别位点的特异性就由20个碱基的向导序列和3个碱基的PAM序列共同决定。现在商家已经直接将异二聚体RNA构建成一个有向导序列和与Cas蛋白结合序列的融合RNA(s ingle-guide RNA, sgRNA)，从而将CRISPR/Cas系统简化成Cas蛋白和sgRNA两个组分（图3-15)。切割后对DNA断点附近的序列进行编辑，同样是非同源末端连接修复机制和同源重组的方式进行。目前，巳发现了三种类型的CRISPR/Cas系统，II型CRISPR/Cas系统在发挥功能时仅需要一种蛋白，即Cas9核酸酶参与。因此，CRISPR/Cas9系统得到了广泛应用。


医学细胞生物学 （三）CRISPR/Cas9基因编辑技术 CRISPR/Cas9技术是近年来出现的一种革命性技术，被广泛用于基因的敲除、点突变和外源性基因的插入等。


医学细胞生物学 基因组DNA:l酶切断 lI IIlll I||l||||l|ll Il lllIlIlIlIlIll ll llI IlIlIllll IlIlIllIl IIll Il|||ll Il|IIl ll l|IIIIIIIIIIIIlIl ll lI'IIl Ill'II1TIIIIIIIIII l l l II l l I l II l l II l11|III l l l l l Il l I Il IIl l I IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII l l ll l l l,Il IIIIIIIII错配修复，导致基因功能消失插入的目的片段可以是基因，也可以是导致原基因功能丧失的突变序列图3-15CRISPR/Cas9技术sgRNA是由与D NA互补的向导序列和与Cas9蛋白结合的重复互补序列组成。Cas9蛋白具有核酸酶活性。在向导序列的3'端，Cas9识别并切割的DNA位点还必须有一个PAM区域。特异切割后对DNA断点附近的序列进行修复，可以是非同源末端连接修复和同源重组的方式进行此外，在动物和人类细胞中过表达特定基因编码蛋白的部分功能域缺失或基因突变体，也是研究基因功能的常用方法。


医学细胞生物学 三、蛋白质相互作用的研究技术 蛋白质是细胞功能的主要执行者。在许多情况下，一个细胞功能的实现是多个蛋白质分子相互作用的结果。细胞的生命活动，如细胞的信号转导、基因转录、蛋白转运、蛋白质修饰和降解等，都依赖于蛋白质之间的相互作用。研究蛋白质相互作用是理解细胞生命过程的关键。实验室中常用的蛋«?Q1白质相互作用研究技术包括免疫沉淀、酵母双杂交等方法。 第三章细胞生物学的研究方法（一）免疫沉淀可验证蛋白质－蛋白质相互作用 免疫沉淀(immuno-prec ipitation, IP)的主要过程是：首先用耦联在凝胶颗粒或磁珠上的目的蛋白的抗体将细胞匀浆或裂解液中的目的蛋白沉淀出来，在此过程中能够与目的蛋白发生相互作用的蛋白会被同时沉淀下来，然后用SDS-PAGE、免疫印迹或生物质谱对沉淀出来的蛋白进行鉴定。免疫沉淀方法简便易行，是实验室最常用的方法，但是它属千体外(in vitro)实验方法，不能给出细胞内蛋白相互作用的动态结果，同时细胞内本来没有相互作用的蛋白质在破碎细胞时可能发生凝聚，因此免疫共沉淀还存在假阳性的问题。


医学细胞生物学 第三章细胞生物学的研究方法（一）免疫沉淀可验证蛋白质－蛋白质相互作用 （二）酵母双杂交用千筛选存在相互作用的蛋白质酵母双杂交(yeast two-hybridization)的基本原理是：将目的蛋白与报告基因的DNA结合结构域构建成融合蛋白［目的蛋白通常称作诱饵(bai t)］，将被筛选的蛋白与报告基因的转录激活结构域构建成融合蛋白［被筛选的蛋白通常称作俘获物(prey)］，如果目的蛋白和筛选的蛋白在酵母细胞中存在相互作用，则报告基因就会在酵母中进行表达，然后从阳性酵母菌落中分离出阳性蛋白的质粒就可以确定阳性蛋白的编码序列。酵母双杂交能快速检测蛋白相互作用，包括相应的结构域，并找到相应的编码基因，是一种被广泛采用的，在体内(in vivo)条件下研究蛋白质相互作用的方法。但是酵母双杂交只能说明两个蛋白质之间有相互作用的结构基础，并不表示这两个蛋白质在细胞内一定会相遇或这种相互作用在活细胞确实存在，因此酵母双杂交确定的实验结果通常需要用免疫共沉淀进行验证。另外，酵母双杂交只是个筛选系统，并不能直接将蛋白质相互作用与特定的细胞功能联系起来。


医学细胞生物学 （三）噬菌体展示可筛选存在相互作用的蛋白质 噬菌体展示(phage di splay)是一种体外筛选蛋白质与蛋白质相互作用的技术，其基本原理是：将被筛选蛋白与噬菌体的衣壳蛋白构建成融合蛋白，使被筛选蛋白在噬菌体的表面进行表达；然后将目的蛋白固定在平板或小珠上，与展示不同筛选蛋白的噬菌体文库进行孵育；孵育后洗去未结合噬菌体，然后分离特异性结合的噬菌体；分离出的噬菌体经体内扩增，再重复上述结合分离过程，使那些能展示与目的蛋白发生最特异结合的筛选蛋白的噬菌体得到逐步的富集，一般需经过三轮筛选／扩增循环，最后经过DNA测序鉴定所得噬菌体中筛选蛋白的编码基因。与其他技术相比，噬菌体展示技术的主要优点是容易对库容最较大的文库（多样性大千109)进行筛选。


医学细胞生物学 四、蛋白质与核酸相互作用的研究技术 蛋白质与核酸(DNA和RNA)的相互作用是基因表达调控的基础。基因表达调控是细胞对外部或内部刺激发生应答的方式，可以发生在转录水平、转录后水平、翻译水平和翻译后水平。转录水平的调控涉及基因组DNA与一系列结合蛋白的相互作用，也就是多种转录因子与多个基因转录调控区域的特异性结合；而转录后水平和翻译水平的调控涉及多种RNA结合蛋白(RNA binding protein, RBP)参与，也即多种RNA分子与多种RBP之间的特异结合，以完成RNA加工、修饰、转运、定位和降解等过程。掌握DNA与蛋白质、RNA与蛋白质相互作用的研究方法，对深入研究基因表达调控的分子机制有重要帮助。随着基因组学、生物信息学和测序技术的进步，我们已经可以在全基因组水平对细胞的基因表达调控进行分析。（一）染色质免疫沉淀技术研究DNA与蛋白质相互作用染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipitation, C hIP)是一种在体内研究DNA与蛋白质相互作用的方法。其基本过程是：在生理状态用甲醒将细胞内的DNA与蛋白质交联在一起，用适度的超声波处理将交联复合体打断成含500-IOOObp DNA的片段，然后用所要研究的目的蛋白的特异抗体沉淀交联复合体片段，只有与目的蛋白结合的DNA片段才能够被沉淀下来，最后经过去交联和DNA纯化步骤，即可以对与目的蛋白结合的DNA片段进行分析（图3-16)。


医学细胞生物学 第一篇细胞生物学概论用甲醋交联染色质中的DNA与蛋白质收集并裂解细胞释放出的染色质超声振荡或酶解使染色质片段化窃幸44心片段化的染色质500-lOOObp......寄生


医学细胞生物学 第一篇细胞生物学概论用甲醋交联染色质中的DNA与蛋白质收集并裂解细胞释放出的染色质超声振荡或酶解使染色质片段化窃幸44心片段化的染色质500-lOOObp......寄生 i用针对特定蛋白（如TFIIB)或氨基酸4妇残基修饰方式（如H3K4me3)的抗体与片段化的染色质结合{t~Ll与特定蛋白交联的DNA片段被结合在磁珠上，并被沉淀下来图3-16染色质免疫沉淀如图所示，分离得到DNA以后，通过PCR扩增并结合DNA测序即可判定与特定蛋白结合的基因序列；通过qPCR可以获得特异蛋白与DNA的结合是否有转录促进作用；通过基因芯片分析，既可获得与特定蛋白结合的基因序列，也能了解到特异蛋白与基因序列的结合是否有转录促进作用，该方法被称为染色质免疫沉淀芯片(ChIP-chip)；分离得到的DNA也可直接通过高通噩测序获得基因序列信息，该方法被称为ChIP-seq第三章细胞生物学的研究方法同研究DNA与蛋白质相互作用的其他方法相比，如电泳迁移率变动分析(electrophoretic mob山ty shift assay, EMSA)、酵母单杂交系统(yeast one-hybrid system)等，C hIP是一种体内(in vivo)研究方法，能够捕捉到发生在染色质上的基因表达调控的瞬时事件，反映细胞内基因表达调控的真实情况。染色质免疫沉淀技术可以用千低通猛的研究，如验证某个特定的转录因子能否与某个或多个基因的启动子区域结合，或者验证某个蛋白结合的DNA区域是否是启动子区域等。染色质免疫沉淀也可用于高通量的基因组水平的研究，如以Oct4和Nanog为目的蛋白分别对胚胎干细胞和已分化细胞进行免疫沉淀，然后应用表达谱芯片或高通量测序技术分析获得的DNA片段，可以在全基因组水平发现胚胎干细胞和已分化细胞的基因表达调控的差异和特性。由于抗体可以区分同一蛋白的甲基化、乙酰化、磷酸化等不同的修饰状态，染色质免疫沉淀在以组蛋白修饰为主要内容的表观遗传学研究中有广泛的应用。（二）紫外交联免疫沉淀研究RNA与RNA结合蛋白相互作用在染色质免疫沉淀的最后步骤中，如果不纯化DNA而是纯化RNA，逆转录后分析沉淀下来的RNA片段，则可以考察与特定转录因子或组蛋白结合的RNA分子，这种方法适于研究染色质中存在的功能性RNA分子。如果考察整个细胞内与特定RNA结合蛋白(RBP)结合的RNA分子，一般用紫外交联免疫沉淀技术(ultraviolet crosslinking and immunoprecipitation, CLIP)。CLIP的基本原理是：用254nm紫外线照射使细胞中RNA分子与RNA结合蛋白发生共价结合，以RNA结合蛋白的特异性抗体将RNA－蛋白质复合体沉淀之后，回收其中的RNA片段，经过逆转录后对RNA分子进行测序，进而发现RNA分子与RBP分子之间的相互作用关系。应用带有限制性酶切位点和识别序列(barcode)的引物进行逆转录，可以识别出在交联碱基处被截断的cDNA的单核甘酸序列，从而使CLIP的分辨率达到单个碱基水平，即）CLIP(ind ividual nucleotide resolution CLIP)。CLIP能够在全基因组水平揭示RNA与RNA结合蛋白相互作用，是研究RNA与蛋白相互作用的有力工具。但在实际应用中存在一些不足，如交联效率低、难以区分结合与非结合RNA序列、254nm紫外线照射可诱发细胞DNA损伤并合成新的RBP等。CLIP重要的改良技术之一，光活化核糖核背增强的交联免疫沉淀技术(photoactivatable ribonucleoside enhanced crosslinking and immunoprecipitation, PAR-CLIP)可克服以上不足，并能够比较准确地确定RNA分子中与RBP结合的序列（详见本章后面的推荐读物）。CLIP通常与高通证测序技术联合应用，称为HITS-CLIP(high-throughput sequencing CLIP)或CLIP-seq。其测序结果经过生物信息学分析，可深入揭示全基因组水平RNA结合蛋白与RNA分子的调控作用及其生物学意义，极大地促进了细胞基因表达凋控的研究。 五、生物芯片技术 生物芯片(biochip)是20世纪90年代初期发展起来的一门由生物学、微电子学、物理学、化学和计算机科学等多学科交叉融合而成的高新技术。主要包括基因芯片和蛋白质芯片。基因芯片(gene chip)技术是一种特殊类型的核酸杂交技术，其特点是，用于杂交的探针被固定在固相支持物（如玻璃片、硅片、硝酸纤维素膜）上，在每个支持物表面固定有大量（通常每平方厘米高于400)的特定基因片段或霖核节酸探针，这些探针有规律地排列成二维DNA阵列，故又称为DNA微阵列芯片(DNA microarray)。基因芯片与带有荧光标记样品DNA分子按碱基配对原理进行杂交，通过检测杂交的荧光强度就可获取样品分子的数量和序列信息。基因芯片主要技术流程是：芯片的设计与制备，靶基因的标记，芯片杂交，杂交信号检测。芯片的制备主要是应用DNA点样仪将化学合成的寡核昔酸探针或PCR扩增的特异性基因片断点在经特殊处理的固相支持物表面。靶基因的标记通常采用荧光标记法，即在由mRNA反转录成cDNA时，应用荧光素标记其中一种核昔酸，这样便能合成带有荧光素标记的cDNA。例如要检测实验组和对照组中的基因表达变化，如果实验组以红色荧光素标记，则对照组要以绿色荧光素标记。基因芯片与靶基因的杂交和一般的分子杂交过程基本相同，通常是将自等量总RNA或mRNA反转录成的经荧光素标记的实验组和对照组cDNA与一个芯片同时杂交。荧光观察结合计算机进行，如果芯片上的荧光点为黄色，则说明该基因在实验组和对照组中均有表达，并且表达扯相同；若荧光点为红色则表明实验组中该基因高表达，荧光点为绿色表明对照组中该基因高表达。基因芯片技术同时将大量探针固定于支持物上，可对样品中数以千计的核酸序列进行一次性的快速检测和分析，常用于组织细胞的基因表达谱测定、基因多态性与基因突变分析等方面。在基因功能研究中，基因芯片技术常用于筛选候选基因。蛋白质芯片(protein chip)技术是指将大量蛋白质或多肤固化于固相支持物表面，通过蛋白质—蛋白质间的相互作用（如抗原抗体反应、受体配体识别等），对样品中靶蛋白分子进行高通扯检测的一种技术。蛋白质芯片的工作原理与基因芯片类似，也多是把荧光标记的待检样品与芯片上的蛋白质探针反应，洗脱未反应成分后检测特异的反应信号。 六、蛋白质组学技术 蛋白质组(proteome)是指在特定时空条件下某种细胞、组织或器官所含有的全部蛋白质。与此相对应，蛋白质组学(proteomics)是以特定时空条件下某种细胞、组织或器官所含有的全部蛋白质的存在及其活动方式为研究对象的学科。目前蛋白质组学研究技术已成为确定基因功能的有效手段，是基因组学研究进入功能基因组时代的主要标志，是功能基因组时代生命科学研究的核心内容。其中，亚细胞器蛋白质组和器官蛋白质组研究日益成为蛋白质组学研究领域的热点。蛋白质组学最初应用蛋白质双向电泳和质谱技术研究不同组织细胞中蛋白表达谱，是蛋白质组学研究的基本技术，在此简要介绍。来源于细胞或亚细胞结构的蛋白质样品在双向电泳中，先在第一向的高压电场下进行等电聚焦(IEF)，然后再进行第二向的SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。目前等电聚焦电泳采用固相pH梯度(IPG)胶条，避免了因载体两性电解质引起的聚焦时间延长、pH梯度不稳定、阴极漂移等现象，其分辨率达已到1万多个蛋白质点，但对过千偏酸或偏碱、高分子量、微猷蛋白质、及难溶性蛋白质的分辨仍感困难。由千双向疑胶电泳对批僵蛋白质可实现一次性分离，具有高灵敏度和高分辨率、便于计算机进行图像分析处理、可以很好地与质谱分析等鉴定方法匹配的优点，因而成为目前分离蛋白质组分的核心技术。基于双向凝胶电泳的蛋白质组研究会产生大量数据，传统的微扯蛋白质测序、氨基酸组成分析等蛋白质鉴定方法费时、费力、不易实现高通量分析。因此一种新的蛋白质鉴定技术——质谱法(mass spectrometry)受到了人们的重视和应用，其基本原理是样品分子离子化后，根据离子间质荷比(m/z)的差异来分离并确定样品的分子质量。目前用千蛋白质鉴定的质谱主要有两种：电喷雾电离质谱(electrospray ionization mass spectrometry, ESI-MS)和基质辅助激光解吸／电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization/time-of-flight,MALDI-TOF-MS)。蛋白质的质谱测序通常借助串联质谱(tandem mass spectrometry, MS/MS)，即质谱联用技术，测定肤片段的序列结构。串联质谱将每个酶解短肤经第一级质谱或色谱分离进入碰撞室，与氮气或氨气碰撞，沿着碳骨架断成不同长度的霖肤；第二级质谱测定由第一级质谱产生的寡肤的分子质量，一系列寡肤的分子质量差异对照各种氨基酸残基的分子质量，如此对号入座即可解读出肤段的氨基酸序列（图3-17)。串联质谱在测定氨基酸序列方面具有灵敏度高、耗时短、样品不需纯化的特点。


医学细胞生物学 六、蛋白质组学技术  八、单细胞测序技术 是在单细胞水平对全基因组或转录组等进行扩增与测序的一项新技术。其原理是将分离的单个细胞的微量全基因组DNA或转录组RNA进行扩增，获得高覆盖率的完整的基因组或转录组后进行高通量测序，用千揭示细胞群体的时空差异和细胞进化关系等。每个细胞都是独一无二的，但我们之前的研究对象往往是细胞群体，忽略了这些细胞之间的异质性。正因如此，单细胞基因组学和转录组学研究受到了越来越多的关注。一个细胞里的DNA或RNA仅仅处在皮克(picograms)级的水平，这么少的量远远达不到现有测序仪的最低上样需求。因此科学家们必须先对单细胞内的微量核酸分子进行扩增，而且必须保证尽可能少地出现技术误差，以便开展后续的测序及其他研究。单细胞测序技术取得突破主要与下面几个方面有关：技术进步使全基因组及转录组扩增的效率大幅度提高；高通量测序技术使得测序的效率更高，成本更低；微流体技术(microfluidcs)或微孔板技术(microwell technology)以及更高精密的荧光活化细胞分选技术(fluorescence-acti vated cell sorting)等高效分离单细胞技术的不断涌现。


医学细胞生物学 八、单细胞测序技术 使用单细胞测序技术，能够解决：CD样本珍贵，能够利用的材料稀少的问题；＠揭示出每一个细胞的基因组都是独一无二的，同一样组织本中的单细胞基因组存在异质性；＠单细胞的基因组可以随着时间和空间进行随机的改变。单细胞测序技术在医学领域里也有着广泛的应用前景，比如各种肿瘤和许多疾病的研究和诊断，孕妇胎儿的产前诊断等。 九、模式动物个体水平的基因操作技术 在细胞生物学研究中，除开展大蜇的体外(in vitro)实验研究之外，特别强调体内(in vivo)研究结果的价值。体内研究主要在模式动物上进行。生物医学研究中常用的模式动物有果蝇(Drosoph ila)、秀丽隐杆线虫(C. elegans)、斑马鱼(Zebrafish)、爪蟾(Xenopus)和小鼠等。基千模式动物个体水平的基因操作技术，特别是基因敲除(gene knock-out)技术在细胞的功能性基因研究中非常重要。


医学细胞生物学 九、模式动物个体水平的基因操作技术 小鼠与医学的关系极为密切。研究基因的功能，常需要在小鼠中引入一个额外的基因或对基因进行改变，来观察其效应。进行这种基因操作的小鼠被称为转基因(transgeni c)小鼠。目前用于制备转基因小鼠的主要方法有两种，一是把待研究的基因DNA直接注射到受精卵的细胞核中；另一是在培养的胚胎干细胞(embryonic stem cell, ES细胞）基因组中改变或者加入一个基因，随后把有基因改变的ES细胞注入胚泡，使其成为内细胞团的一部分。后者是基因敲除的常用方法。


医学细胞生物学 九、模式动物个体水平的基因操作技术 可以通过同源重组(h omologous recomb i nation)的方法，使导入ES细胞的外源性载体DNA插入到一个特定的预定位点。同源重组是两个DNA分子在某相似序列的特定位点上的重组。因此，导入的第三章细胞生物学的研究方法DNA必须包含足够的靶基因同源序列，才能保证其至少在一小部分培养的细胞基因组中的预定位点插入外源性基因。这些带有特定基因突变或缺失的ES细胞被导入胚泡的内细胞团之后，在小鼠的后代中将产生一个携带特定基因突变或缺失的转基因小鼠（图3-18)。一般地，通过这种方法获得的Fl代小鼠通常为嵌合体。一旦突变基因进入生殖细胞，突变小鼠的杂合子可以通过杂交产生纯合体，当小鼠是失活基因纯合体的时候就称为基因敲除。由此，基因敲除被定义为利用DNA同源重组原理、借助于遗传操作手段使有机体的某一特有基因完全失活。通过观察基因敲除后动物的表型，即可明确基因的功能。


医学细胞生物学 外显子L-J_＿克隆基因抗药基因外显子打靶载体外显子L,I…己．一月打靶载体X勹尸显.$干X的靶基因染色体上突变的染色体三声三嵌合鼠（生殖系中的突变基因） 图3-18基因敲出策略示意图如图所示，在外显子中插入抗药基因是便于后续过程中的筛选、鉴定CRISPR/Cas9基因编辑及相关技术的出现和发展，使得在胚胎干细胞基因组中敲除或者加入一个基因更加简易和高效。


医学细胞生物学 外显子L-J_＿克隆基因抗药基因外显子打靶载体外显子L,I…己．一月打靶载体X勹尸显.$干X的靶基因染色体上突变的染色体三声三嵌合鼠（生殖系中的突变基因） 基因改变的杂合子小鼠通过杂交可产生能存活的纯合体或纯合致死体。胎死腹中的小鼠难以观察到表型，事实上一个基因可以在个体多种组织中甚至是不同发育时期表达。因此，为研究基因的特定功能，需要在特定组织和（或）在发育的特定时间里敲除靶基因。这种性质的基因敲除可通过CreloxP系统实现。靶基因首先被插入到两个loxP序列（有34个碱基对）之间，把这个基因的转基因小鼠与另一个品系的携带Cre重组酶的转基因小鼠交配，loxP序列被Cre识别，2个loxP位点之间的所有DNA被切除3在小鼠后代中，如果Cre在所有的细胞中表达，那么所有细胞的靶基因均被切除。然而，如果Cre基因的表达受控千组织特异性启动子，例如，它只在心脏组织中表达，靶基因将只在心脏组织中被切除，造成靶基因只在心脏组织中被敲除。如果Cre基因被连在可诱导的启动子控制区之下，可以通过将小鼠暴露于诱导刺激条件下，随时切除靶基因。


医学细胞生物学 外显子L-J_＿克隆基因抗药基因外显子打靶载体外显子L,I…己．一月打靶载体X勹尸显.$干X的靶基因染色体上突变的染色体三声三嵌合鼠（生殖系中的突变基因） 尚须指出的是，很多单基因敲除的小鼠没有明显的表型异常或产生比预期少而轻的异常，这说明其他基因可以代替敲除基因的一些功能。基因敲除技术在一般实验室中难以达到，通常是从专业实验室订购。在获得基因敲除鼠之后特别是在后续的小鼠杂交过程中，常需要对后代小鼠进行验证。主要的验证或鉴定方法是PCR和Southern印迹杂交(So u thern blot)。Southern印迹杂交技术是检测基因组中特异DNA序列的方法：提取的DNA分子用一种或几种限制性内切酶消化成若干片段、并在琼脂糖凝胶电泳上分离，然后将变性处理后的凝胶中的单链核酸序列片段转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上，将印迹有单链核酸序列片段的硝酸纤维素膜或尼龙膜与目的基因探针杂交，通过显影观察条带的大小，就可对基因敲除小鼠的基因突变或缺失等进行鉴定。


医学细胞生物学 （黄东阳）第二篇细胞的结构与功能第四章细胞膜与物质的穿膜运输 细胞膜(cell membrane)是包围在细胞质表面的一层薄膜，又称质膜(plasma membrane)。细胞膜将细胞中的物质与外界环境隔开，维持细胞特有的内环境。在原始生命物质进化过程中，细胞膜的形成是关键的一步，没有细胞膜的形成，细胞形式的生命就不能存在。除质膜外，细胞内还有丰富的膜结构，它们形成了细胞内各种膜性细胞器，如内质网、高尔基复合体、溶酶体、各种膜泡等，称为细胞内的膜系统。这些膜与质膜在化学组成、分子结构和功能活动方面具有很多共性。目前把质膜和细胞内膜系统总称为生物膜(biomembrane)。电子显微镜下，生物膜呈“两暗夹一明”的形态结构，又称为单位膜(unit membrane)（图4-1)。


医学细胞生物学 ｀总会；； 图4-1细胞膜的结构A单位膜的电镜照片；B细胞膜三维结构模式图细胞膜不是一种机械屏障，它不仅为细胞的生命活动提供了稳定的内环境，还行使着物质转运、信号传递、细胞识别等多种复杂功能，并且与生命科学中的许多基本问题，如细胞的增殖、分化、细胞的识别黏附、代谢、能量转换等密切相关，是细胞之间、细胞与细胞外环境之间相互交流的重要通道。细胞膜的改变与多种遗传病、神经退行性疾病、恶性肿瘤等的发生相关。因此，正确认识细胞膜的结构与功能对揭示生命活动的奥秘具有重要意义。目前，对细胞膜的研究已深入到分子水平，对其化学组成和各组分的作用及不同组分间的相互作用有了新的认识，细胞膜的研究已成为当前细胞生物学和分子生物学的重要研究领域之一。本章主要介绍细胞膜的化学组成、分子结构、细胞膜特性及其主要功能等。由于细胞膜的许多特性和功能是各种生物膜所共有的，所以通过对细胞膜的了解，亦可对各种生物膜有一个基本认识。


医学细胞生物学 第一节细胞膜的化学组成与生物学特性 对从多种细胞分离获得的纯净质膜及各种内膜的化学分析表明，不同类型的细胞其细胞膜的化学组成基本相同，主要由脂类、蛋白质和糖类三种物质组成。脂类排列成双分子层即脂双层，构成膜的基本结构，形成了对水溶性分子相对不通透的屏障；蛋白质以不同方式与脂类结合，是膜的功能主体；糖类多分布于膜外表面，通过共价键与膜的某些脂类或蛋白质分子结合形成糖脂或糖蛋白。此外，细胞膜中还含有少量水分、无机盐与金属离子等。细胞膜具有多种复杂而重要的功能，主要是由于构成膜的三种主要成分各自具有特定的分子结构和生物学特性，并且三种成分之间有着巧妙的相互作用。近年来日益广泛应用的新技术不断揭示有关膜结构和功能的新信息，如结构生物学能够解析膜蛋白的立体构象、活性结构域；分子生物学、基因组学和生物信息学等手段有助于预测或重构膜蛋白的结构。


医学细胞生物学 —、细胞膜的化学组成(—)膜脂构成细胞膜的结构骨架 细胞膜上的脂类称为膜脂(membrane lipid)，约占膜成分的50%，一个动物细胞的质膜中大约含有109个膜脂分子，在lµmxlµm脂双层范围内，大约有5xl06个膜脂分子。它们主要有三种类型：磷脂(phospholipid)、胆固醇(cholesterol)和糖脂(glycolipid)，其中以磷脂含量为最多。1磷脂是膜脂的主要成分大多数膜脂分子中都含有磷酸基团，被称为磷脂，约占膜脂的50%以上。磷脂又可分为两类：甘油磷脂(phosphoglycerides)和鞘磷脂(sphingomyelin, SM)。甘油磷脂主要包括磷脂酰胆碱（卵磷脂）(phosphatidylcholine, PC)、磷脂酰乙醇胺（脑磷脂）(phosphatid ylethanolamine,PE)和磷脂酰丝氨酸(phosphalidylserine, PS)。此外，还有一种磷脂是磷脂酰肌醇(phosphatidylinosital, PI)，位于质膜的内层，在膜结构中含扯很少，但在细胞信号转导中起重要作用。这些甘油磷脂主要在内质网合成。甘油磷脂有着共同的特征：以甘油为骨架，甘油分子的l、2位胫基分别与脂肪酸形成酷键，3位轻基与磷酸基团形成酣键。如果磷酸基团分别与胆碱、乙醇胺、丝氨酸或肌醇结合，即形成上述4种类型磷脂分子。这些亲水的小基团在分子的末端与带负电的磷酸基团一起形成高度水溶性的结构域，极性很强，被称为头部基团(head group)或亲水头。磷脂中的脂肪酸链长短不一，通常由l4~24个碳原子组成，一条经链不含双键（饱和链），另一经链含有1~2个顺式双键（不饱和链），顺式双键处形成一个约30°角的弯曲。磷脂分子逐个相依地整齐排列构成细胞膜的骨架结构。脂肪酸链是疏水的，无极性，称疏水尾。由千磷脂分子具有亲水头和疏水尾，被称为两亲性分子(amphipathi c molec ule)或兼性分子（图4-2)。


医学细胞生物学 —、细胞膜的化学组成(—)膜脂构成细胞膜的结构骨架 鞘磷脂(sphingomyelin, SM)是细胞膜上唯一不以甘油为骨架的磷脂，在膜中含量较少，但在神经元细胞膜中含植较多，主要在高尔基复合体合成。如神经鞘磷脂是丰度最高的一种鞘磷脂，它以鞘氨醇代替甘油，长链的不饱和脂肪酸结合在鞘氨醇的氨基上；分子末端的一个胫基与磷酸胆碱(phos phocholine)结合，另一个游离胫基可与相邻脂分子的极性头部、水分子或膜蛋白形成氢键（图4-3)。目前研究发现，鞘磷脂及其代谢产物神经酰胺、鞘氨醇及l－磷酸鞘氨醇参与各种细胞活动，如细胞增殖、分化和凋亡等。


医学细胞生物学 —、细胞膜的化学组成(—)膜脂构成细胞膜的结构骨架 2.胆固醇能够稳定细胞膜和调节膜的流动性胆固醇是细胞膜中另一类重要的脂类，分子较小，散布在磷脂分子之间。动物细胞膜中胆固醇含量较高，有的膜内胆固醇与磷脂之比可达I:I，植物细胞膜中胆固醇含昼较少，约占膜脂的2%。胆固醇也是两亲性分子：极性头部为连接千固醇环（肖环）上的轻基，靠近相邻的磷脂分子的极性头部；中间为固醇环，连接一条短的疏水性胫链。疏水的固醇环扁平富有刚性，固定在磷脂分子邻近头部的经链上，对磷脂的脂肪酸链尾部的运动具有干扰作用。疏水的尾部经链埋在磷脂的疏水尾部中（图4-4)。胆固醇分子对调节膜的流动性、加强膜的稳定性具有重要作用。例如，一种中国仓鼠卵巢细胞突变株(M19)，不能合成胆固醇，体外培养时细胞会很快解体，只有在培养基中加入适量胆固醇并掺入到质膜中后，脂双层趋千稳定，细胞才能生存。不同生物膜有各自特殊的脂类组成，如哺乳动物细胞膜上富含胆固醇和糖脂，而线粒体膜内富含心磷脂；大肠杆菌质膜则不含胆固醇。而且不同类型的脂分子具有特定的头部基团及脂肪酸链，这赋予膜不同的特性。


医学细胞生物学 —、细胞膜的化学组成(—)膜脂构成细胞膜的结构骨架 3糖脂主要位千质膜的非胞质面糖脂也是亲水脂分子，由脂类和寡糖构成。糖脂普遍存在千原核和真核细胞膜表面，含量占膜脂总噩的5％以下。对千细菌和植物细胞，几乎所有的糖脂均是甘油磷脂的衍生物，一般为磷脂酰胆碱衍生的糖脂；动物细胞膜的糖脂几乎都是鞘氨醇的衍生物，结构似鞘磷脂，称为鞘糖脂。糖脂的极性头部可由1~15个或更多个糖残基组成，两条经链为疏水的尾部（图4-5)。，U气t;极性（亲水头）


医学细胞生物学 尸，霍扂尸吼，霍震盓鹭言严吼，3细血杻芦霍：键双比＼非极性（疏水尾）出比比－2庐一人脂肪酸尾)人脂肪酸尾)脂肪酸尾)3几八脂肪酸尾忙仁庐。脂肪酸尾)3八八八磷脂酰乙醇胺磷脂酰丝氨酸磷脂酰胆碱鞘磷脂第四章细胞膜与物质的穿膜运输半乳糖脑昔酷人脂肪酸尾)人脂肪酸尾)GM1神经节节酣 膜上胆固醇分子亲水的头部朝向脂双层的外表A半乳糖脑昔脂；B. G人1，神经节昔脂面，而大部分结构嵌入磷脂的脂肪酸尾部中。Gal：半乳糖；Cle：葡萄糖；GalNAc:N－乙酰半胆固醇分子在脂双层间倾向千均匀分布乳糖胺；NANA:N－乙酰神经氨酸目前已发现40余种糖脂，它们的主要区别在于其极性头部不同。最简单的糖脂是脑昔脂，其极性头部仅有一个半乳糖或葡萄糖残基，它是髓鞘中的主要糖脂。比较复杂的糖脂是神经节昔脂，其极性头除含有半乳糖和葡萄糖外，还含有数目不等的唾液酸（也叫做N－乙酰神经氨酸，NANA)。不同的细胞所含糖脂的种类不同，如神经节昔脂在神经元的质膜中最为丰富，占总脂类的5%～10%，人红细胞膜中含有ABO血型糖脂。


医学细胞生物学 尸，霍扂尸吼，霍震盓鹭言严吼，3细血杻芦霍：键双比＼非极性（疏水尾）出比比－2庐一人脂肪酸尾)人脂肪酸尾)脂肪酸尾)3几八脂肪酸尾忙仁庐。脂肪酸尾)3八八八磷脂酰乙醇胺磷脂酰丝氨酸磷脂酰胆碱鞘磷脂第四章细胞膜与物质的穿膜运输半乳糖脑昔酷人脂肪酸尾)人脂肪酸尾)GM1神经节节酣 所有细胞中，糖脂均位于脂双层的非胞质面单层，糖基暴露于细胞表面。据此推测，糖脂的作用与细胞同外环境的相互作用有关，可能作为细胞表面受体，参与细胞的识别、黏附及信号转导等。


医学细胞生物学 尸，霍扂尸吼，霍震盓鹭言严吼，3细血杻芦霍：键双比＼非极性（疏水尾）出比比－2庐一人脂肪酸尾)人脂肪酸尾)脂肪酸尾)3几八脂肪酸尾忙仁庐。脂肪酸尾)3八八八磷脂酰乙醇胺磷脂酰丝氨酸磷脂酰胆碱鞘磷脂第四章细胞膜与物质的穿膜运输半乳糖脑昔酷人脂肪酸尾)人脂肪酸尾)GM1神经节节酣 膜脂都是两亲性分子，由千极性头部能与水分子形成氢键或静电作用而溶千水，非极性尾部不能与水分子产生相互作用而疏水。所以当这些脂质分子被水环境包围时，它们就自发地聚集起来，使疏水的尾部藏在内部，亲水的头部露在外面与水接触。实验中出现两种存在形式：O形成球状的分子团(micelle儿把尾部包藏在里面；＠形成脂双层(lipid bilayer)。脂质分子在水环境中排列成双层，两层分子的疏水尾部被亲水头部夹在中间。为了避免双分子层两端疏水尾部与水接触，其游离端往往能自动闭合，形成充满液体的球状小泡称为脂质体(liposome)（图4-6)。所谓的脂质体是根据磷脂分子在水相中形成稳定的脂双层的现象制备的人工膜。人工合成脂质体的直径约在25nm~1µm之间。


医学细胞生物学 72第二篇细胞的结构与功能 脂质体可以用单一的或混合的磷脂来制备，同时还可以嵌入不同的膜蛋白。作为膜研究的实验模型，将蛋白质插入脂质体中，可以在比天然膜更简单的环境中研究其功能；脂质体也可以作为运载体，把药物或DNA包含在其中，转移进细胞以研究其生物学作用；如果将相应的抗体构建到脂质体膜上，脂质体可选择性地结合到靶细胞膜表面，使药物定向作用于靶细胞。大多数磷脂和糖脂在水溶液中自动形成脂双层结构。脂双层具有作为生物膜理想结构的特点：O构成分隔两个水溶性环境的屏障。脂双层内为疏水性的脂肪酸链，不允许水溶性分子、离子和大多数生物分子自由通过，保障了细胞内环境的稳定。©脂双层是连续的，具有自相融合形成封闭性腔室的倾向，在细胞内未发现有游离边界，形成广泛的连续膜网。当脂双层受损伤时通过脂分子的重新排布可以自动再封闭。＠脂双层具有柔性是可变形的，如在细胞运动、分裂、分泌泡的出芽和融合及受精时都涉及膜的可变形特性。


医学细胞生物学 （二）膜蛋白以多种方式与脂双分子层结合 虽然脂双层组成细胞膜的基本结构，但细胞膜的不同特性和功能却是由与细胞膜相结合的膜蛋白(membrane protein)决定的。如膜蛋白中有些是运输蛋白，转运特定的分子或离子进出细胞；有些是结合于质膜上的酶，催化与其相关的生化反应；有些起连接作用，连接相邻细胞或细胞外基质成分；有些作为受体，接受周围环境中各种化学信号，并转导至细胞内引起相应的反应。膜蛋白的量很大，人体内30％的蛋白质位于质膜上。不同生物膜上膜蛋白的含撞及类型有很大差异，功能越复杂的膜其蛋白质含显越高。如线粒体内膜上有电子传递链，氧化磷酸化相关蛋白位于其中，故膜蛋白质含量较高，约占75%。而髓鞘主要起绝缘作用，膜蛋白的含蜇低于25%。一般的细胞膜中蛋白质含量介千两者之间，约占50％左右。


医学细胞生物学 （二）膜蛋白以多种方式与脂双分子层结合 根据膜蛋白与脂双层结合的方式不同，膜蛋白可分为三种基本类型：内在膜蛋白(intrin sic membrane protein)或整合膜蛋白(in tegral membrane prote i n)、外在膜蛋白(extrin si c memb团ne protein)和脂铀定蛋白(lipid anc hored prote i n)（图4-7)。图4-7膜蛋臼在膜中的几种结合方式A~C穿膜蛋白，以一次或多次穿膜的Q螺旋或B筒形式；D位于胞质侧，通过暴露于蛋白质表面的Q－螺旋的疏水面与胞质面脂单层相互作用而与膜结合；E位于胞质侧的脂铺定蛋白，以共价键直接与胞质面脂单层中的脂肪酸链结合；F位千质膜外表面的脂铀定蛋白GPI;G、H膜外在蛋白，与膜脂的极性头部或内在蛋白亲水区以非共价键相互作用间接与膜结合1内在膜蛋白又称穿膜蛋白(tr·ansmembrane protein)，占膜蛋白总噩的70%~80%，也是两亲性分子。分为单次穿膜（图4-7A)、多次穿膜（图4-7B)和多亚基穿膜蛋白三种类型。单次穿膜蛋白的肤链只穿过脂双层一次，穿膜区一般含有20~30个疏水性氨基酸残基，以a－螺旋构象穿越脂双层的疏水区。因为a－螺旋构象允许在肤链的相邻氨基酸残基中形成最大数蜇的氢键，从而形成稳定性高的结构；亲水的胞外区和胞质区则由极性氨基酸残基构成，它们暴露在膜的一侧或两侧，可与水溶性的物质（如激素或其他蛋白质）相互作用。如细胞表面受体是穿膜蛋白，他们在细胞外侧与信号分子结合，在内侧又激活细胞内不同的信号分子。一般肤链的N端位于细胞膜外侧，但也有相反定位的例@b,子（如转铁蛋白受体）。多次穿膜蛋白含有多个由疏水性氨基酸残基组成的穿膜序列（可多达140。


医学细胞生物学 （二）膜蛋白以多种方式与脂双分子层结合  第四章细胞膜与物质的穿膜运输 自我保护。第一个被鉴定的真核细胞ABC蛋白来自对肿瘤细胞和抗药性培养细胞的研究。这些细胞高水平表达一种多药抗性运输蛋白(multidrug resistance protein, MDR)，这种蛋白能利用水解ATP的能量将多种通过质膜进入细胞的脂溶性药物泵到细胞外，减轻了药物对肿瘤细胞的毒性作用，使细胞对肿瘤化疗中常用的多种化疗药物同时发生抵抗。研究表明该蛋白在各种肿瘤细胞中过度表达，有多达40％的人类恶性肿瘤可发生固有的或获得性的多药耐药，这成为肿瘤治疗的一大障碍。ABC转运体在哺乳动物免疫监视中具有重要作用，来自细菌、病毒或其他病原微生物的蛋白降解产物，可被位于内质网膜上的ABC转运体转运至内质网腔，然后被递呈(present)在细胞膜表面作为抗原被细胞毒性T淋巴细胞识别。


医学细胞生物学 第四章细胞膜与物质的穿膜运输 2协同运输细胞所建立的几种浓度梯度，如Na+,K+和W浓度梯度，是储存自由能的一种方式。储存在离子浓度梯度中的势能可以供细胞以多种途径来做功。协同运输(cotransport)是一类由Na三代泵（或甘泵）与载体蛋白协同作用，间接消耗ATP所完成的主动运输方式。物质穿膜运动所需要的直接动力来自膜两侧离子的电化学梯度中的能量，而维持这种离子电化学梯度是通过Na+-K+泵（或W泵）消耗ATP所实现的。若用药物抑制Na十－K＋泵活动，相应的协同运输也逐渐减弱或消失。动物细胞的协同运输是利用膜两侧的N旷电化学梯度来驱动，植物细胞和细菌是利用打电化学梯度来驱动。根据溶质分子运输方向与Na十或甘顺电化学梯度转移方向的关系，又可分为共运输(symport)与对向运输(anti port）。(1)共运输：是载体蛋白介导的两种溶质分子相同方向的联合转运。在这种方式中，物质的逆浓度梯度穿膜运输与所依赖的Na十或W顺浓度梯度的运输两者方向相同。如葡萄糖在小肠黏膜上皮的吸收和在近端肾小管上皮的重吸收都是通过Na+－葡萄糖转运体(Na+-glucose cotransporter)进行的。在小肠中酶把多糖水解成单糖，小肠黏膜上皮细胞游离面上的Na+－葡萄糖转运体在质膜外表面分别结合2个Na十和1个葡萄糖分子，当Na勹顶浓度梯度进入细胞时，葡萄糖就利用N旷电化学梯度差中的势能，与Na十相伴随逆浓度梯度进入细胞。转运体在A和B两种构象间转换，当Na十在胞质内释放后转运体蛋白构象发生改变，失去对葡萄糖的亲和性而与之分离，转运体蛋白构象又恢复原状，可反复工作（图4-18)。研究表明N旷和葡萄糖在转运体上的结合是协同的，即其中一种的结合诱发转运体构象的改变，大大增加对另一种的亲和力，缺乏一种另一种无法结合到转运体上。因为细胞外N旷浓度很高，葡萄糖也就很容易在A状态结合到转运体上。进入细胞的Na十被Na+-K+-ATP酶泵出细胞外，以保持Na+的跨膜浓度梯度。由此可见，这种运输所消耗的能量，实际上是由ATP水解间接提供的。Na+－葡萄糖转运体在小肠是以2个Na+1个葡萄糖联合转运，在肾小管上皮则是以1个Na+1个葡萄糖联合转运的。体内多种细胞的质膜上都有依赖N旷的同向转运体，各自负责运送一组特异糖类（如葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖）、氨基酸、水溶性维生素进入细胞。如小肠黏膜上皮中参与氨基酸和维生素吸收的Na+－氨基酸、Na+－维生素（维生素B!、维生素B2、维生素B6、维生素PP)同向转运体；肾小管上皮细胞的Na+-HC03-、Na+-K+-2C厂Na+-Ci-,K+-c1-同向转运体；甲状腺上皮细胞摄取I的Na十－I一同向转运体等都属于N旷驱动的共运输形式。


医学细胞生物学 第四章细胞膜与物质的穿膜运输 (2)对向运输：同一种转运体将两种不同的离子或分子分别向膜的相反方向的运输过程，由离子浓度梯度驱动。脊椎动物细胞中有多种对向运输转运体：心Na+-Ca2+交换体。几乎所有细胞都存在Na+-Ca2＋转运体，以转入3个N旷排除1个Ca2+的化学计晕联合转运。心肌细胞在兴奋－收缩偶联过程中流入的Ca2＋主要通过Na+-Ca2＋转运体将其排除细胞；在小肠黏膜上皮细胞和肾近端小管细胞底侧膜Na+-Ca2＋转运体转运Ca2＋进入组织液然后入血，是Ca2＋吸收的重要载体蛋白。(2)Na+-H'交换体。这种交换蛋白偶联1个N旷顺浓度梯度流进与1个W泵出，可清除细胞代谢过程中产生的过多的H十以调节胞质内pH(=7.2)；肾近端小管的Na+－甘交换体向小管液中排出W以利于HC03一被重吸收，在排出固定酸和维持机体酸碱平衡中起重要作用。＠Ci--HC03一交换体。在细胞内HC03一升高时，将HC03运出细胞同时将Cl运入，从而介导HC03一和CO2的输出这在破骨细胞和胃泌酸活动中发挥基底面/Na+）/(Na+－K泵｝细胞外液体图4-18`小肠上皮细胞定向转运葡萄糖入血示意图小肠上皮细胞顶部质膜中的Na+－葡萄糖同向转运体，输入2N旷同时偶联转运l个葡萄糖分子进入细胞，使胞质内产生高葡萄糖浓度；底侧部质膜上的葡萄糖易化扩散载体蛋白顺浓度梯度转运葡萄糖离开细胞进入肠壁组织液然后入血，形成葡萄糖的定向转运；底侧膜上的Na+-K+泵将运人进胞内的Na十泵出细胞以维持Na十跨膜浓度梯度。不同运输蛋白的特异性分布及上皮细胞间的紧密连接是葡萄糖定向转运的结构基础作用，红细胞中携带的CO2也是通过这种方式迅速排至血液。人和其他哺乳动物胃液中的盐酸(HCl)也称为胃酸(gastric acid)，使胃液呈强酸性(pH0.91.5)，可杀灭随食物进入胃内的细菌、使蛋白质变性有利于水解、为胃蛋白酶功能活性提供合适的酸性环境。盐酸是由胃腺中的壁细胞(pari etal cells)分泌，壁细胞邻近胃腔的顶部质膜含有H+-K+泵，把W逆巨大的浓度梯度主动转运至胃腔中，同时驱动k十进入细胞。但由于细胞内[W]x[OH-］为常数，所以“多余的“OH一与从血液中扩散进入的CO2在碳酸酐酶的催化下结合形成HC03-,HC03一通过壁细胞底部质膜上的Cl--HC03一交换体顺浓度梯度运出细胞，而Cl一被反向转运进入细胞。壁细胞顶部质膜上的钾通道和氯通道开放，细胞内的K勹顶浓度梯度进入胃腔，进入细胞内的C「通过氯通道进入胃腔，并与W形成HCl。壁细胞底部质膜上的Cl--HC03一反相偶联载体就这样配合H十－K＋泵的活动参与胃酸的分泌（图4-19)。治疗胃溃疡的药物奥美拉嗤因能与H+-K+泵特异性结合抑制其活性，成为常用的抑酸剂。综上所述，细胞的许多功能活动包括肾小管和肠黏膜上皮细胞的吸收功能，需要多种转运蛋白的协同作用，而且不同转运蛋白在细胞膜上的不对称分布是定向转运的结构基础。


医学细胞生物学 第四章细胞膜与物质的穿膜运输 上述各种“主动运输”方式的特点是：心主动运输为小分子物质逆浓度或电化学梯度穿膜转运；＠需要消耗量，可直接利用水解ATP或利用来自离子电化学梯度提供能量；＠需要膜上特异性载体蛋白介导，这些载体蛋白不仅具有结构上的特异性（特异的结合位点），而且具有结构上的可变性即通过蛋白构象进行物质转运。细胞根据生理活动的需要，通过各种不同的方式协同完成各种小分子物质的穿膜转运。现将部分载体蛋白种类与功能总结于表4-1。


医学细胞生物学 74第二篇细胞的结构与功能 十二烧基磺酸钠(SDS)为常用的离子型去垢剂，它是两亲性的脂质样分子，有一个带电的亲水区和一个疏水区（经链）。当用高浓度的去垢剂与膜混合时，去垢剂分子的疏水区替代磷脂分子与穿膜蛋白的疏水区结合，也与磷脂分子的疏水尾部结合，由此把穿膜蛋白与磷脂分开。由于SDS的极性端带电荷（离子型）更易溶于水，所以形成了去垢剂一蛋白质复合物进入溶液中而将膜蛋白分离出来。蛋白质经分离、纯化后，就可以用多种手段进行分析，确定其相对分子量、氨基酸组成、氨基酸序列等。SDS对蛋白质的作用较强烈，能使蛋白质解折叠引起变性，不利千对其进行功能研究。为获得有功能的膜蛋白，可采用非离子型去垢剂。Triton X-100是非离子型去垢剂，它的极性端不带电荷，它与SDS对膜蛋白的作用方式类似，也可使细胞膜崩解，但对蛋白质的作用比较温和。它不仅用千膜蛋白的分离与纯化，也用于去除细胞内膜系统，以便对细胞骨架和其他蛋白质进行研究。


医学细胞生物学 （三）膜糖类覆盖细胞膜表面 细胞膜中含有一定量的糖类，由于种属和细胞类型不同，糖类约占质膜重量的2%～10%。如红细胞膜中的糖类占膜总重量的8%。膜糖(membrane c扣·bohydrate)中93%的糖以低聚糖或多聚糖链形式共价结合千膜蛋白上形成糖蛋白，糖蛋白上的糖基化主要发生在天冬酰胺（N－连接），其次是在丝氨酸和苏氨酸（O－连接）残基上，并且经常几个位点同时发生糖基化。7％的膜糖以低聚糖链共价结合于膜脂上形成糖脂。大部分暴露千细胞表面的膜蛋白都带有多个寡糖侧链，而脂双层外层中每个糖脂分子只带1个寡糖侧链，质膜上所有的糖链都朝向细胞表面。自然界中存在的单糖及其衍生物有200多种，在动物细胞膜中主要有7种：D－葡萄糖、D－半乳糖、D－甘露糖、L－岩藻糖、N－乙酰半乳糖胺，N－乙酰葡萄糖胺及唾液酸。由于寡糖链中单糖的数瘟、种类、排列顺序以及有无分支等不同，低聚糖或多聚糖链出现了千变万化的组合形式。如人类ABO四种血型抗原的差别就是血型糖蛋白在红细胞质膜外表面寡糖链的组成结构决定的。唾液酸常见千糖链的末端，真核细胞表面的净负电荷主要由它形成。


医学细胞生物学 （三）膜糖类覆盖细胞膜表面 在大多数真核细胞表面有富含糖类的周缘区，称为细胞外被(cell coat)或糖萼(glycocalyx)，用重金属染料钉红染色后，在电镜下可显示其为厚约10~2Onm的结构，边界不甚明确。细胞外被中的糖类主要包括与糖蛋白和糖脂相连的低聚糖侧链，同时也包括被分泌出来又吸附于细胞表面的糖蛋白与蛋白聚糖的多糖侧链。这些吸附的大分子是细胞外基质的成分，所以细胞膜的边缘与细胞外基质的界限是难千区分的。现在细胞外被一般用来指与质膜相连接的糖类物质，即质膜中的糖蛋白和糖脂向外表面延伸出的寡糖连部分，因此，细胞外被实质上是质膜结构的一部分。而把不与质膜相连接的细胞外狻盖物称为细胞外物质或胞外结构。


医学细胞生物学 （三）膜糖类覆盖细胞膜表面 细胞外被的基本功能是保护细胞抵御各种物理、化学性损伤，如消化道、呼吸道等上皮细胞的细胞外被有助于润滑、防止机械损伤，保护黏膜上皮不受消化酶的作用。糖链末端富含带负电荷的唾液酸，能捕集Na\Ca2＋等阳离子并吸引大量的水分子，使细胞周围建立起水盐平衡的微环境。糖脂及糖蛋白中低聚糖侧链的功能大多还不清楚，但根据寡糖链的复杂性及其所处的位置提示它们参与细胞间及细胞与周围环境的相互作用，如参与细胞的识别、黏附、迁移等功能活动。 二、细胞膜的生物学特性 细胞膜是由脂双分子层和以不同方式与其结合的蛋白质构成的生物大分子体系，它不仅具有包围细胞质，形成＂屏障＂的作用，还执行物质运输、信号传递、细胞识别和能量转换等多种重要功能。这和细胞膜的分子结构和组成特性有关，细胞膜的主要特性是膜的不对称性和流动性。（一）膜的不对称性决定膜功能的方向性膜的不对称性(membrane asymmet ry)是指细胞膜中各种成分的分布是不均匀的，包括种类和数量上都有很大差异，这与细胞膜的功能有密切关系。


医学细胞生物学 另外，不同膜性细胞器中脂类成分的组成和分布不同。 25脂双层外层如质膜中一般富含鞘磷脂、磷脂酰胆碱和胆固醇等；核膜、内质网膜和线粒体外膜则富含磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇；线粒体内膜富含心磷脂。由于鞘磷脂在高尔基复合体中合成，所以其膜中鞘磷脂的含量约是内质网膜中的6。倍。正是由于存在膜脂各组分分布的差异，使细胞内的生物膜具有不同的特性和功能。


医学细胞生物学 另外，不同膜性细胞器中脂类成分的组成和分布不同。 膜脂组分不对称性分布的生物学意义尚不完全明确，但已知不同的膜脂组分应与膜的特定功能相一致。例如具有极性的小肠吸收上皮细胞，在细胞底侧面(basolateral s urface)的25脂双层内层质膜中，鞘脂与甘油磷脂、胆固醇之比是0.5:l.5:1，大致与非图4-8人红细胞膜中几种膜脂的不对极性细胞膜中的比值相同，但在朝向肠腔的游离面质膜中，称分布这三种膜脂之比为1:1:1。其中鞘脂比例的增加，可能是鞘SM：鞘磷脂；PC：磷脂酰胆碱；PS：磷脂酰氨醇分子中自由胫基间广泛形成的氢键有利于增加膜的稳丝氨酸；PE：磷脂酰乙醇胺；PI：磷脂酰肌醇；CL：胆固醇定性，因为游离面质膜易受更多的刺激。脂双层中的一些脂类分子（如磷脂酰肌醇）可以为特定蛋白质提供结合位点，对保持膜蛋白在脂双层中的正确定位和极性有重要作用。另外，膜脂的不对称分布使脂双层内、外两层流动性有所不同。


医学细胞生物学 另外，不同膜性细胞器中脂类成分的组成和分布不同。 2膜蛋白的不对称性膜蛋白分布是绝对不对称的，各种膜蛋白在质膜中都有一定的位置。如血影蛋白分布千红细胞膜内侧面，酶和受体多位于质膜的外侧面，如5I-~亥昔酸酶、磷酸酣酶、激素受体生长因子受体等，而腺背酸环化酶则位于质膜的内侧胞质面。穿膜蛋白穿越脂双层都有一定的方向性，这也造成其分布的不对称性。例如，红细胞膜上的血型糖蛋白肤链的N端伸向质膜外侧，C端在质膜内侧胞质面；带3蛋白肤链的N端则在质膜内侧胞质面。膜蛋白的不对称性还表现在穿膜蛋白的两个亲水端，其肤链长度、氨基酸的种类和顺序都不同，有的在膜外侧有活性位点，有的在膜内侧有活性位点。3膜糖的不对称性膜糖类的分布具有显著的不对称性。细胞膜糖脂、糖蛋白的寡糖侧链只分布于质膜外表面（非胞质面），而在内膜系统，寡糖侧链都分布于膜腔的内侧面（非胞质面）。


医学细胞生物学 另外，不同膜性细胞器中脂类成分的组成和分布不同。 膜脂、膜蛋白及膜糖分布的不对称性与膜功能的不对称性和方向性有密切关系，具有重要的生物学意义，膜结构上的不对称性保证了膜功能的方向性和生命活动的高度有序性。如红细胞膜表面糖脂的寡糖链决定了ABO血型；许多激素的受体位于质膜的外侧，接受细胞外信号并向细胞内传递；当细胞发生凋亡时（如衰老的淋巴细胞），原本位千脂双层内层的磷脂酰丝氨酸翻转到外层，成为巨噬细胞识别并吞噬凋亡细胞的信号。


医学细胞生物学 另外，不同膜性细胞器中脂类成分的组成和分布不同。 （二）膜的流动性是膜功能活动的保证膜的流动性(flu心ty)是细胞膜的基本特性之一，也是细胞进行生命活动的必需条件。膜是一个动态的结构，其流动性主要是指膜脂的流动性和膜蛋白的运动性。1脂双层为液晶态二维流体细胞内外的水环境使得膜脂分子不能自脂双层中逸出，在温和的温度下(37°C），膜脂分子在脂单层(lipid leafle t)平面内可以前后左右运动和彼此之间交换位置，脂类是以相对流动状态存在，但分子长轴基本平行排列保持一定方向，此时的膜可以看作是二维流体。研·qi作为生物膜主体的脂双层，它的组分既有固体分子排列的有序性，又有液体的流动性，这一两种特性兼有的居于晶态和液态之间的状态，即液晶态(liquid-c1-ystal s tate)是细胞膜极为重要的特性。


医学细胞生物学 另外，不同膜性细胞器中脂类成分的组成和分布不同。 在生理条件下，膜大多呈液晶态。在温度下降到一定程度(<25气），到达某一点时，脂双层的性质会明显改变，它可以从流动的液晶态转变为“冰冻＂的晶状凝胶，这时磷脂分子的运动将受到很大限制；当温度上升至某一点时又可以熔融为液晶态。所以，把这一临界温度称为膜的相变温度。由千温度的变化导致膜状态的改变称为”相变”(phase transi tion)。在相变温度以上，膜处于流动的液膜的流动性是膜功能活动的保证。如果膜是一种刚性、有序的结构则无法产生运动；而一个完全液态，亳无黏性的膜会使各种膜成分无序排列，无法组织成结构，也不能提供机械支持。膜的液晶态在这两者之间达到完美折中。除此之外，有了膜的流动性，膜蛋白可以在膜的特定位点聚集形成特定结构或功能单位，以完成如细胞连接建立、信号转导等多种功能活动。许多基本的生命活动，包括细胞的运动、生长分裂，物质转运、分泌和吞噬等作用，都取决千膜组分的运动。如果膜是一种刚性、非液态结构，这些行为都不可能发生。


医学细胞生物学 另外，不同膜性细胞器中脂类成分的组成和分布不同。 2.膜脂分子的运动方式20世纪70年代，对人工合成的脂双层膜的研究证明，膜脂的单个分子能在脂双层平面自由扩散。应用差示扫描量热术、磁共振、放射性核素标记等多种技术检测膜脂分子的运动，结果表明，在高于相变温度的条件下，膜脂分子具有以下几种运动方式（图4-9)。(I)侧向扩散(lateral diffusion)：侧向扩侧向扩散散是指在脂双层的单分子层内，脂分子沿膜平面侧向与相邻分子快速交换位置，交换频\\率约107次／s。侧向扩散运动是膜脂分子主I l翻转运动要的运动方式，实验表明，处千液晶态的脂双II层在30"C时其脂类分子的侧向扩散系数(D)/l约为I0-8cm2/s，此数值说明一个磷脂分子可以在1s内从细菌的一端扩散到另一端弯曲运动旋转运动(lµm)或在20s内迁移大约一个动物细胞直图4-9膜脂分子的几种运动方式径这样的距离。这种运动始终保持脂类分子的排列方向，亲水的头部基团朝向膜表面，疏水的尾部朝向膜的内部。


医学细胞生物学 另外，不同膜性细胞器中脂类成分的组成和分布不同。 (1)脂肪酸链的饱和程度：相变温度的高低和流动性的大小决定于脂类分子排列的紧密程度。已知磷脂分子疏水尾部间的范德华力和疏水性相互作用使得它们相互聚集。磷脂分子长的饱和脂肪酸链呈直线形，具有最大的聚集倾向而排列紧密成凝胶状态；而不饱和脂肪酸链在双键处形成折屈呈彷1，弯曲状，干扰了脂分子间范德华力的相互作用，所以排列比较疏松，从而增加了膜的流动性。可以看第四章细胞膜与物质的穿膜运输77出，脂双分子层中含不饱和脂肪酸越多，膜的相变温度越低，其流动性也越大。一些受外界环境温度影响的细胞，主要通过代谢来调节其膜脂脂肪酸链不饱和程度，如当环境温度降低时，细胞通过一种去饱和酶(desaturases)催化将单键去饱和形成双键，或通过磷脂酶和脂酰转移酶在不同磷脂分子间重组脂肪酸链以产生含两个不饱和脂肪酸链的磷脂分子，这是细胞适应环境温度变化而调节其流动性的主要途径。


医学细胞生物学 另外，不同膜性细胞器中脂类成分的组成和分布不同。 (2)脂肪酸链的长短：脂肪酸链的长短与膜的流动性有关。脂肪酸链短的相变温度低，流动性大。这是因为脂肪酸链越短则尾端越不易发生相互作用，在相变温度以下，不易发生凝集而增加了流动性；长链尾端之间不仅可以在同一分子层内相互作用，而且可以与另一分子层中的长链尾端作用，使膜的流动性降低。(3)胆固醇的双重调节作用：动物细胞膜含较多的胆固醇，与磷脂分子数相近，对膜的流动性起重要的双重调节作用。当温度在相变温度以上时，由于胆固醇分子的固醇环与磷脂分子靠近极性头部的经链部分结合限制了这几个CH2的运动，起到稳定质膜、增加有序性的作用。当温度在相变温度以下时，由于胆固醇位于磷脂分子之间隔开磷脂分子，可有效地防止脂肪酸链相互凝聚，干扰晶态形成，动物细胞膜中的胆固醇可以有效地防止低温时膜流动性的突然降低。


医学细胞生物学 另外，不同膜性细胞器中脂类成分的组成和分布不同。 (4)卵磷脂与鞘磷脂的比值：哺乳动物细胞中，卯磷脂和鞘磷脂的含量约占膜脂的50%，其中卵磷脂的脂肪酸链不饱和程度高，相变温度较低，鞘磷脂则相反，其脂肪酸链饱和程度高，相变温度也高，且范围较宽(25~35"C)。在37"C时，卵磷脂和鞘磷脂二者均呈流动状态，但鞘磷脂的黏度却比卵磷脂大6倍，因而鞘磷脂含量高则流动性降低。在细胞衰老过程中，细胞膜中卯磷脂与鞘磷脂的比值逐渐下降，其流动性也随之降低。(5)膜蛋白的影响：膜脂结合膜蛋白后对膜的流动性有直接影响。膜蛋白嵌入膜脂疏水区后，使周围的脂类分子不能单独活动而形成界面脂（嵌入蛋白与周围脂类分子结合而形成），嵌入的蛋白越多，界面脂就越多，膜脂的流动性越小，但膜脂与某些内在蛋白的结合是可逆的。另一方面，在含有较多内在蛋白的膜中，存在由内在蛋白分割包围的富脂区(lip吐rich region)，磷脂分子只能在一个富脂区内自由扩散，而不能扩散到邻近的富脂区。用荧光素标记磷脂分子，研究磷脂分子在成纤维细胞质膜中的运动清况，发现大多数磷脂只能在直径约为0.5µm范闱的富脂区内自由运动。


医学细胞生物学 另外，不同膜性细胞器中脂类成分的组成和分布不同。 除上述因素外，膜脂的极性基团、环境温度、pH、离子强度等均可对膜脂的流动性产生一定影响。如环境温度越高，膜脂流动性越大，在相变温度范围内，每下降10"C，膜的黏度增加3倍，因而膜流动性降低。4膜蛋白的运动性分布在膜脂二维流体中的膜蛋白也有发生分子运动的特性，其主要运动方式是侧向扩散和旋转运动。这两种分子运动方式与膜脂分子相似，但移动速度较慢。


医学细胞生物学 另外，不同膜性细胞器中脂类成分的组成和分布不同。 (1)侧向扩散：许多实验证明，膜蛋白在膜脂中可以自由漂浮和在膜表面扩散。1970年，霍普金斯大学的L. Frye和M. Edidin用细胞融合和间接免疫荧光法证明，膜抗原（即膜蛋白）在脂双层二维平面中可以自由扩散。他们把体外培养的入和小鼠的成纤维细胞进行融合，观察入－小鼠杂交细胞表面抗原分布的变化（图4-10)。融合前，用发绿色荧光的荧光素标记小鼠成纤维细胞的特异性抗体，入成纤维细胞的特异性抗体用发红色荧光的荧光素标记。被标记的抗体分别与小鼠和人成纤维细胞膜上的抗原相结合。用灭活的仙台病毒介导两种细胞融合，刚发生融合时膜抗原蛋白只限于各自的细胞膜部分，人细胞一侧呈红色荧光，小鼠细胞一侧呈绿色荧光。37"C继续培养40分钟后，两种颜色的荧光在整个杂交细胞膜上均匀分布。这说明膜抗原蛋白在膜平面内经扩散运动而重新分布。但在低温条件下(1"C），膜抗原则基本停止运动。


医学细胞生物学 另外，不同膜性细胞器中脂类成分的组成和分布不同。 目前测定膜蛋白的侧向扩散常采用荧光漂白恢复(fluorescence photobleaching recove1-y, FPR)技术。这种技术是研究膜蛋白和膜脂流动性的基本实验方法。用荧光素标记膜蛋白或膜脂，然后用高能激光束照射细胞表面某一区域，使该区域内标记的荧光分子发生不可逆的埣灭，称为光漂白(photobleaching)，由于侧向扩散，周围带有荧光的膜蛋白或膜脂不断向漂白区迁移，漂白区的荧光强度又恢复到原有水平。可用其恢复速度计笲膜蛋白或膜脂的侧向扩散速度。不同膜蛋白其扩散速率不同，扩散常数(D)约为S xl0-9~Sxl0-11cm2/s。所以一个分子巅为lOOkD的内在蛋白，其扩散系数仅为膜脂扩散系数的1/2左右。(2)旋转运动(ro tational diffusion)：或称旋转扩散，膜蛋白能围绕与膜平面相垂直的轴进行旋转运动，但旋转运动的速度比侧向扩散更为缓慢。不同膜蛋白旋转速率也有很大差异，这与其分子结构及所处不同的微环境有关。 只父父只父昂父 实际上不是所有的膜蛋白都能自由运动，有些细胞只有部分膜蛋白(30%~90%）处千流动状态。


医学细胞生物学 只父父只父昂父 运输、细胞识别、信息转导等功能都与膜的流动性有密切关系。生物膜各种功能的完成是在膜的流动状态下进行的，若膜的流动性降低，细胞膜固化、黏度增大到一定程度时，许多穿膜运输中断，膜内的酶丧失活性，代谢终止，最终导致细胞死亡。 三、细胞膜的分子结构模型 前面已介绍了膜脂、膜蛋白的分子结构特点，但它们是如何排列和组织的？这些成分之间如何相互作用？这些对阐明膜的功能活动及机制十分重要。在分离质膜以前，有关膜的分子结构理论是根据间接材料提出的。1890年，苏黎世大学的E. Overton发现溶于脂肪的物质容易穿过膜，非脂溶性的物质不易穿过细胞膜，他据此推测细胞的表面有类脂层，初步明确了细胞膜的化学组成。1925年，E. Gorte1和F. Grendel从“血影”中抽提出磷脂，在水面上铺成单分子层，测得其所占面积与所用红细胞膜总面积之比在l.8:1至2.2:1之间，他们猜测实际的比值应该是2:1，因此，他们认为红细胞膜是双层脂分子组成。这样就第一次提出了脂双分子层是细胞膜基本结构的概念。脂双层的概念为后来大部分膜结构模型所接受，并在这一基础上提出了许多种不同的膜分子结构模型，现介绍几种主要的膜结构模型。


医学细胞生物学 （一）片层结构模型具有三层夹板式结构特点 1935年，H. Davson和J. Danielli发现细胞膜的表面张力显著低于油－水界面的表面张力，已知脂滴表面如吸附有蛋白成分则表面张力降低，因此他认为，细胞膜不是单纯由脂类组成，推测质膜中含有蛋白质成分，并提出“片层结构模型”(lamella structure model)。这一模型认为，细胞膜是由两层磷第四章细胞膜与物质的穿膜运输脂分子构成，磷脂分子的疏水经链在膜的内部彼此相对，而亲水端则朝向膜的外表面，内外侧表面还裂盖着一层球形蛋白质分子，形成蛋白质－磷脂－蛋白质三层夹板式结构。后来，为了解释质膜对水的高通透性，Davson和Dani elli对其模型进行了修改，认为质膜上有穿过脂双层的孔，小孔由蛋白质分子围成，其内表面具有亲水基团，允许水分子通过。这一模型的影响达20年之久。


医学细胞生物学 （二）单位膜模型体现膜形态结构的共同特点 前面所介绍的对质膜化学性质与结构的认识，都是根据分析实验数据间接推论出来的，缺少直观资料。由于细胞膜非常菏，在光学显微镜下无法直接观察清楚。1959年，J. D. Robertson使用电子显微镜观察各种生物细胞膜和内膜系统，发现所有生物膜均呈“两暗一明”的三层式结构，在横切面上表现为内外两层为电子密度高的暗线，中间夹一条电子密度低的明线，内外两层暗线各厚约2nm，中间的明线厚约3.5nm，膜的总厚度约为7.5nm，这种“两暗一明”的结构被称为单位膜。因此，他们在片层结构模型基础上提出了“单位膜模型”(unit membrane model)。


医学细胞生物学 （二）单位膜模型体现膜形态结构的共同特点 这一模型认为磷脂双分子层构成膜的主体，其亲水端头部向外，与附着的蛋白质分子构成暗线，磷脂分子的疏水尾部构成明线。这个模型与片层结构模型不同，认为脂双分子层内外两侧的蛋白质并非球形蛋白质，而是单条肤链以B片层形式的蛋白质，通过静电作用与磷脂极性端相结合。单位膜模型提出了各种生物膜在形态结构上的共同特点，即把膜的分子结构同膜的电镜图像联系起来，能对膜的某些属性做出解释，在超微结构中被普遍采用，名称一直沿用至今。但是这个模型把膜作为一种静态的单一结构，无法说明膜的动态变化和各种重要的生理功能，也不能解释为何不同生物膜的厚度不同。


医学细胞生物学 （三）流动镶嵌模型是被普遍接受的模型 20世纪60年代以后，由于新技术的发明和应用，对质膜的认识越来越深入。例如，应用冰冻蚀刻技术显示膜中有蛋白质颗粒存在；应用示踪法表明膜的结构形态不断发生流动变化；应用红外光谱、旋光色散等技术证明膜蛋白主要不是B－片层结构，而是a－螺旋的球形结构。这些事实都对单位膜模型提出了修正，此阶段又相继提出了许多新的模型，其中受到广泛支持的是S. J. Singer和G. L Nicolson在1972年提出的“流动镶嵌模型”(fluid mosaic mod el)（动画4-1“细胞膜流动锁嵌模型”)。这一模型认为膜中脂双层构成膜的连贯主体，它具有晶体分子排列的有序性，又具有液体的流动性；膜中蛋白质分子以不同形式与脂双分子层结合，有的嵌在脂双层分子中，有的则附着在脂双层的表面。它是一种动态的、不对称的具有流动性结构，其组分可以运动，还能聚集以便参与各种瞬时的或非永久性的相互作用。流动镶嵌模型强调了膜的流动性和不对称性，较好地解释了生物膜的功能特点，它是目前被普遍接受的膜结构模型（图4-11)。


医学细胞生物学 流动镶嵌模型可以解释许多膜中所发生的现象，但它不能说明具有流动性的质膜在变化过程中怎样保持膜的相对完整性和稳定性，忽视了膜的各部分流动性的不均匀性等，因此又有人提出了一些新的模型。如1975年Wallac h提出了一种“晶格锁嵌模型” (crys tal mosaic model)，认为生物膜中流动的 脂类是在可逆地进行无序（液态）和有序（晶 限制作用。镶嵌蛋白和其周削的脂类分子形成膜中晶态部分（晶格），而具有“流动性”的脂类呈小片的点状分布。因此脂类的“流动性”是局部的，并非整个脂类双分子层都在进行流动，这就比较合理地说明了生物膜既具有流动性、又具有相对完整性及稳定性的原因。1977年，Jain和White又提出了＂板块镶嵌模型”(block mosaic model)，认为在流动的脂双层中存＼儿{t:在许多大小不同、刚性较大的能独立移动的脂类板块（有序结构的＂板块”)，在这些有序结构的板块之间存在流动的脂类区（无序结构的＂板块”)，这两者之间处于一种连贯的动态平衡之中，因而生物膜是由同时存在不同流动性的板块镶嵌而成的动态结构。


医学细胞生物学 脂类是在可逆地进行无序（液态）和有序（晶 事实上，后两种模型与流动镶嵌模型并无本质区别，不过是对膜流动性的分子基础进行了补充。（四）脂筏模型深化了对膜结构和功能的认识脂双层近似一个二维流体，里面镶嵌有许多的蛋白质，而在真实的细胞膜上，脂双层不是一个完全均匀的二维流体，一些脂质分子可以形成相对稳定的凝胶状态或液态有序状态。近来发现膜质双层内含有由特殊脂质和蛋白质组成的微区(m i crodomain)，微区中富含胆固醇和鞘脂，其中聚集一些特定种类的膜蛋白。由于鞘脂的脂肪酸尾比较长，因此这一区域比膜的其他部分厚，更有秩序且较少流动，被称为脂筏(lipid raft s)（动画4-2"脂筏＂）。其周围则是富含不饱和磷脂的流动性较高的液态区。近年发现脂筏不仅存在千质膜上，亦存在于高尔基复合体膜上。认为脂筏最初可能在高尔基复合体上形成，最终转移到细胞质膜上（图4-12)。


医学细胞生物学 脂筏糖脂 脂双层具有不同的脂筏结构：外层的微区主要含有鞘脂、胆固醇及CPI－铀定蛋白，由于鞘脂含有长链饱和脂肪酸，流动性较差，而邻近的磷脂区其脂肪酸多不饱和，所以出现相分离；内层也有类似的微区，但与外层的脂质不完全相同，主要是在此区有许多酰化的铀定蛋白，特别是信号转导蛋白，如Src、G蛋白的Ga亚基、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)等。这种由鞘脂和胆固醇富集的微区，如同漂浮在脂双层上的＂脂筏“同时承载着执行特定生物学功能的膜蛋白。据推测，一个直径100nm的脂筏可载有600个蛋白质分子。从结构及组分分析认为，脂筏在膜内形成一个有效的平台，许多蛋白质聚集在脂筏内，便于相互作用；脂筏提供一个有利于蛋白质变构的环境，形成有效的构象。目前比较公认的脂筏的功能是参与信号转导、受体介导的胞吞以及胆固醇代谢运输等。从当前的研究来看，脂筏功能的紊乱已涉及HIV、肿瘤、动脉粥样硬化、Alzhe i mer病、疯牛病及肌营养不良等疾病。对脂筏结构和功能的研究不仅加深了对许多重要的生命现象和病理机制的了解，而且也有助于了解细胞膜的结构和功能，将给膜生物学带来更多的信息与启示。


医学细胞生物学 第二节小分子物质和离子的穿膜运输 细胞是生命的基本单位，它们在进行各种生命活动中必然要与外环境进行活跃的物质交换，通过质膜从环境中获取需要的营养物质和02，并将CO2等代谢产物排至细胞外。物质从膜的一侧向另一侧的运输叫做“穿膜运输"(transmembran e tran sport)。细胞膜作为细胞与细胞外环境间的半透性屏障，对穿膜运输的物质有选择和调节作用，以维持细胞相对稳定的内环境。质膜的基本骨架是脂双分第四章细胞膜与物质的穿膜运输子层，其固有的疏水性对于大多数极性和水溶性分子构成了一道屏障，只有那些脂溶性、非极性或不带电的小分子物质能自由扩散通过质膜，而对带电的溶质分子和离子是高度不通透的，它们的穿膜转运由质膜上特殊的膜运输蛋白完成。目前把小分子和离子通过脂双层的穿膜运输分为简单扩散、离子通道扩散、易化扩散和主动运输四种方式。另外，细胞膜通过胞吞和胞吐作用进行大分子和颗粒物质的运输。


医学细胞生物学 —、膜的选择性通透和简单扩散 物质穿膜运输通透性的高低决定于质膜固有的脂溶性和物质本身的特性。在研究细胞膜对小分子和离子的通透性中常采用人工脂双层膜方法。运用实验手段在水槽分隔板的小孔上覆盖人工脂双分子层，然后检测该脂双层两侧溶液中某种溶质的含量，可以测定这个模拟脂双层的通透性。实验表明，如果给予足够长的时间，实际上任何不带电小分子都可以从高浓度向低浓度方向通过人工脂双层简单扩散(simple d i ffusion)是小分子物质穿膜运输的的脂双层最简单方式。小分子的热运动可使分子以自由扩散的方图4-13人工脂双层对不同溶质的式从膜的一侧进入到另一侧，但必须满足两个条件：一是相对通透性溶质在膜两侧保持一定的浓度差，二是溶质必须能透过膜。脂溶性物质如醇、苯、肖类激素以及02、CO心凡等就是通过简单扩散方式穿过细胞膜。在简单扩散时，溶质分子通过膜脂分子间隙向低浓度一侧进行跨膜扩散，这一过程中，无生物学机制参与，无需代谢耗能，所需要的能霾来自浓度差本身的势能，故也称为被动扩散(passive diffusion)。这种物质从高浓度向低浓度方向的穿膜运动，符合物理学上的简单扩散规律，最终消除两个区域间的浓度差。物质经简单扩散转运的速率取决千被转运物质在膜两侧的浓度差和物质本身的特性。另外，物质所在溶液的溫度愈高、膜的有效面积愈大，转运速度也愈高。


医学细胞生物学 —、膜的选择性通透和简单扩散  二、膜运输蛋白介导的穿膜运输 如上所述，只有脂溶性、非极性或不带电的小分子可以通过简单扩散方式穿膜转运。对于大多数极性和水溶性物质细胞是通过膜上存在的特殊蛋白质进行跨膜转运的。这类蛋白质称为膜运输蛋白(membrane transport protein)。膜运输蛋白的分子数可占所有膜蛋白总数的15%-30%。膜运输蛋白都是多次穿膜蛋白，通常每种膜运输蛋白只转运某一特定类别的溶质（如离子、单糖或氨基酸）。


医学细胞生物学 二、膜运输蛋白介导的穿膜运输 根据介导物质运输的形式不同，膜运输蛋白分为两类：一类为载体蛋白(carrier protein)，也称为转运体(transporter)，另一类是通道蛋白(channel protein)。载体蛋白的特点是与所运输的溶质分子专一结合，通过自身构象改变而运送该溶质过膜。通道蛋白则形成一种水溶性通道贯穿脂双层，当通道受调控开放时允许特定的溶质（一般是无机离子）穿越细胞膜。通道蛋白和某些载体蛋白介导溶质穿膜转运时不消耗能量，称其为被动运输(passive transport）。在被动运输中，如果转运的溶质是不带电的非电解质，膜两侧的浓度梯度即膜两侧的浓度差，决定溶质的转运方向（顺浓度梯度）；如被转运的物质是电解质，其转运方向取决千该物质在膜两侧的浓度差和电位差，某物质在膜两侧的电位差和浓度差两个驱动力的代数和，称为该物质的电－化学驱动力(electrochemical driving force)。另外，有机体所有细胞膜都具膜电位，因为在膜的外表面有一薄层正离子，内表面有一薄层负离子，形成了细胞膜两侧内负外正相对平稳的电位差（静息电位）。所以膜电位通常有利于带正电的离子进入而不利于带负电的离子进入。细胞也需要逆电化学梯度转运一些物质，这不仅需要运输蛋白的参与，还需要消耗能量（多数是ATP)。这种由载体蛋白参与、消耗代谢能驱动物质逆电化学梯度的跨膜转运称为主动运输(acti ve transport)。载体蛋白既可介导被动运输（易化扩散），也可介导逆电化学梯度的主动运输；而通道蛋白只能介导顺电化学梯度的被动运输（图4-14)。 被转运的分子。三。。一c蛋白1载体蛋白I T•-V浓度梯度脂双层简单扩散通道介导。。被顽转运 膜运输蛋白的活性和在细胞膜上的数目决定其物质转运能力。载体蛋白的构象改变影响它们与所运物质的结合；通道蛋白的构象改变决定其开放或关闭状态。因此，对载体蛋白活性的调节本质上是对蛋白构象改变的调控。例如，依赖ATP直接供能的Na十－K泵、Ca2＋泵等就是经过磷酸化修饰后改变构象完成转运的。细胞外的调控因素包括激素、神经递质、被运物质的电化学梯度等。一些天然和人工小分子化合物可以激活或桔抗膜运输蛋白的活性；细胞内的询控因素包括酶、G蛋白、信号蛋白等。对于离子通道而言，膜电位的变化是其最重要的调控因素之一。膜运输蛋白的数目显然影响运输速率。膜运输蛋白都是整合于来自高尔基复合体成熟面的膜泡的膜上，基础状态下膜泡停留在胞质中，在受到某种信号分子作用时，膜泡与质膜融合将膜运输蛋白转运至质膜上，这一过程被称为“上膜"(trafficking to the membrane）或“入膜"(inserting into the membrane)。相反，位千质膜上的运输蛋白也可以通过胞吞被回收(retrieved)入细胞，随即被送到内体一溶酶体途径被降解，这种“下膜”或“内化”(internalization)的机制被用以负性调控质膜上运输蛋白的数目。例如，抗利尿激素与肾脏集合管主细胞膜上的受体结合后促进水通道蛋白的表达和上膜；阻断抗利尿激素与其受体的结合可增加水通道蛋白的内吞。抗利尿激素就是通过改变水通道蛋白的数量实现对原尿中水的重吸收。


医学细胞生物学 被转运的分子。三。。一c蛋白1载体蛋白I T•-V浓度梯度脂双层简单扩散通道介导。。被顽转运  (—)易化扩散是载体蛋臼介导的被动运输 一些非脂溶性（或亲水性）的物质，如葡萄糖、氨基酸、核昔酸以及细胞代谢物等，不能以简单扩散的方式通过细胞膜，但它们可在某些载体蛋白的介导下，不消耗细胞的代谢能量，顺物质浓度梯度.(.1或电化学梯度进行转运，这种方式称为易化扩散(facilitated d iffus ion)或帮助扩散。由千易化扩散不第四章细胞膜与物质的穿膜运输消耗细胞的代谢能，这一点与简单扩散相同，二者都是被动运输。易化转运蛋白可以在两个方向上同等介导物质的穿膜运输，净通量的方向取决于物质在膜两侧的相对浓度。但在易化扩散中，转运特异性强，转运速率也非常快。


医学细胞生物学 (—)易化扩散是载体蛋臼介导的被动运输 目前对载体蛋白在分子水平上如何发挥作用的细节还不清楚，一般认为，载体蛋白对所转运的溶质具有高度专一性，可以借助千其上的结合位点与某一物质进行暂时的、可逆的结合。当载体蛋白一侧表面的特异结合位点，同专一的溶质分子结合形成复合体，即可引起载体蛋白发生构象变化，通过一定的易位机制，将被运送的溶质分子从膜的一侧移至膜的另一侧。同时，随构象的变化，载体对该物质的亲和力也下降，于是物质与载体蛋白分离，溶质顺着浓度梯度从这里扩散出去，载体蛋白又恢复到它原有的构象（图4-15)。 溶质~入状态A贰声状态B细胞外胞质溶胶介导被动转运结合溶质的载体蛋白的部位 易化扩散具有以下特点：(1)结构特异性：每种易化扩散载体蛋白对其所运分子有一个或多个结合位点，只能识别具有特定化学结构的一种或一类底物。