生物化学与分子生物学 410第四篇医学生化专题 另一类生长因子受体定位于细胞质，当生长因子与胞内相应受体结合后，形成生长因子－受体复合物，后者亦可进入胞核活化相关基因促进细胞生长。原癌基因表达产物有的属千生长因子或生长因子受体；有的属千胞内信息传递体亦或核内转录因子。发生突变的原癌基因可能生成上述产物的变异体，后者的生成及过量表达会导致细胞生长、增殖失控，进而引起癌变。（四）原癌基因编码的蛋白质涉及生长因子信号转导的多个环节目前已知，原癌基因编码的蛋白质涉及生长因子信号转导的多个环节。依据它们在细胞信号转导系统中的作用分为四类（表22-2)。


生物化学与分子生物学 类别癌基因名称作用细胞外生长因子SIS PDGF-2INT-2FGF同类物，促进细胞增殖跨膜生长因子受体EGFR EGF受体，促进细胞增殖HER2EGF受体类似物，促进细胞增殖FMS CSF-1受体，促进增殖KIT SCF受体，促进增殖TRK NGF受体细胞内信号转导分子SRC、ABL与受体结合转导信号RAF MAPK通路中的重要分子RAS MAPK通路中的重要分子 核内转录因子MYC促进增殖相关基因表达FOS、JUN促进增殖相关基因表达EGFR:epidermal growth factor recep tor，表皮生长因子受体；CSF-1:colony stimulating factor1，集落刺激因子I; SCF:stem cell factor，干细胞因子1细胞外生长因子生长因子是细胞外增殖信号，它们作用千膜受体，经各种信号通路，如MAPK通路等，引发一系列细胞增殖相关基因的转录激活。这些因子的过度表达，势必连续不断作用于相应的受体细胞，造成大量生长信号的待续输入，从而使细胞增殖失控。


生物化学与分子生物学 类别癌基因名称作用细胞外生长因子SIS PDGF-2INT-2FGF同类物，促进细胞增殖跨膜生长因子受体EGFR EGF受体，促进细胞增殖HER2EGF受体类似物，促进细胞增殖FMS CSF-1受体，促进增殖KIT SCF受体，促进增殖TRK NGF受体细胞内信号转导分子SRC、ABL与受体结合转导信号RAF MAPK通路中的重要分子RAS MAPK通路中的重要分子 已知人的原癌基因C-SIS编码PDGF的B链，作用于PDGF受体，激活PLC-IP/DAG-PKC途径（见第十七章），促进肿瘤细胞增殖。此外，C-SIS表达产物还能促进肿瘤血管的生长，为肿瘤进展提供有利环境。目前已知与恶性肿瘤发生和发展有关的生长因子有PDGF、EGF、TGF-13、FGF、IGF-1等。


生物化学与分子生物学 类别癌基因名称作用细胞外生长因子SIS PDGF-2INT-2FGF同类物，促进细胞增殖跨膜生长因子受体EGFR EGF受体，促进细胞增殖HER2EGF受体类似物，促进细胞增殖FMS CSF-1受体，促进增殖KIT SCF受体，促进增殖TRK NGF受体细胞内信号转导分子SRC、ABL与受体结合转导信号RAF MAPK通路中的重要分子RAS MAPK通路中的重要分子 2跨膜生长因子受体第二类原癌基因的产物为跨膜受体，它们接受细胞外的生长信号并将其传入细胞内。跨膜生长因子受体的膜内侧结构域，往往具有酪氨酸特异的蛋白激酶活性。这些受体型酪氨酸激酶通过多种信号通路，如MAPK通路、PI3K-AKT通路等，加速增殖信号在胞内转导。许多恶性肿瘤如非小细胞型肺癌、乳腺癌等均出现EGF/EGFR的过度表达，EGF/EGFR的过度表达或者异常活化常能引起细胞恶性转化，而这与多种肿瘤的发生发展、恶性程度以及预后具有密切相关性。另外，表皮生长因子还参与了肿瘤的血管生成作用，因此其过表达或异常活化会促进肿瘤进展。


生物化学与分子生物学 类别癌基因名称作用细胞外生长因子SIS PDGF-2INT-2FGF同类物，促进细胞增殖跨膜生长因子受体EGFR EGF受体，促进细胞增殖HER2EGF受体类似物，促进细胞增殖FMS CSF-1受体，促进增殖KIT SCF受体，促进增殖TRK NGF受体细胞内信号转导分子SRC、ABL与受体结合转导信号RAF MAPK通路中的重要分子RAS MAPK通路中的重要分子 3细胞内信号转导分子生长信号到达胞内后，借助一系列胞内信号转导体系，将接受到的生长信号由胞内传至核内（见第十七章），促进细胞生长。这些转导体系成员多数是原癌基因的产物，或者通过这些基因产物的作用影响第二信使，如cAMP、DAG、Ca正等。作为胞内信号转导分子的癌基因产物包括：非受体酪氨酸激酶SRC、ABL等，丝／苏氨酸激酶RAF等，低分子量G蛋白RAS等。


生物化学与分子生物学 类别癌基因名称作用细胞外生长因子SIS PDGF-2INT-2FGF同类物，促进细胞增殖跨膜生长因子受体EGFR EGF受体，促进细胞增殖HER2EGF受体类似物，促进细胞增殖FMS CSF-1受体，促进增殖KIT SCF受体，促进增殖TRK NGF受体细胞内信号转导分子SRC、ABL与受体结合转导信号RAF MAPK通路中的重要分子RAS MAPK通路中的重要分子 4.核内转录因子另外一些癌基因表达的蛋白质属千转录因子，通过与靶基因的顺式作用元件相结合，直接促进细胞增殖靶基因的转录。EGF促肿瘤的一个重要机制就是通过活化MAPK通路（见第十七章）而使原癌基因FOS活化，FOS蛋白增加。FOS蛋白可与JUN蛋白结合形成AP-1，而第二十二章癌基因和抑癌基因411AP-1是一种广泛存在的高度活化的异源二聚体转录因子，能促进肿瘤的发生发展。 五、癌基因是肿瘤治疗的重要分子靶点 在许多人类肿瘤中都存在某些癌基因的过度活化，从而在肿瘤的发病机制中扮演着重要的角色，也为肿瘤治疗提供了靶位，此处仅以下述3个基因为例进行简要介绍。


生物化学与分子生物学 (-)BRAF是黑素瘤治疗的重要分子靶点 原癌基因BRAF所编码的蛋白质属于丝／苏氨酸激酶，是MAPK信号通路的重要组成分子，在调控细胞增殖、分化等方面发挥重要作用。人类肿瘤中，BRAF基因存在不同比例的基因突变，其中约60％的黑素瘤中BRAF发生突变，其第600位氨基酸从颌氨酸突变为谷氨酸(V600E)最为常见，导致B-RAF的持续激活。已有针对这类V600E突变的分子靶向药物威罗菲尼(vemurafenib)用于临床，该药可阻断突变B-RAF的活性，从而抑制肿瘤生长。 （二）HER2是乳腺癌治疗的重要分子靶点 HER2是表皮生长因子受体家族成员，具有蛋白酪氨酸激酶活性，能激活下游信号通路，从而促进细胞增殖和抑制细胞凋亡。在30％的乳腺癌中HE应基因发生扩增或者过度表达，其表达水平与治疗后复发率和不良预后显著相关。针对其过度表达的单克隆抗体药物赫赛汀(herceptin)已在临床使用。


生物化学与分子生物学 （二）HER2是乳腺癌治疗的重要分子靶点 （三）BCR-ABL是慢性髓性白血病治疗的重要分子靶点慢性髓性白血病(CML)病人的9号染色体与22号染色体之间发生易位，从而融合产生了癌基因BCR-ABL，编码的蛋白质BCR-ABL具有持续活化的蛋白酪氨酸激酶活性，能促进细胞增殖，并增加基因组的不稳定性。在95％的CML病人中都伴随有BCR-ABL融合基因的产生，在一些急性淋巴白血病病人中也有发现。针对BCR-ABL融合蛋白的药物伊马替尼(imatinib)2001年被FDA批准用于临床治疗。 第二节抑癌基因 抑癌基因也称肿瘤抑制基因(tumor suppressor gene)，是防止或阻止癌症发生的基因。与原癌基因活化诱发癌变的作用相反，抑癌基因的部分或全部失活可显著增加癌症发生风险。抑癌基因对细胞增殖起负性调控作用，包括抑制细胞增殖、调控细胞周期检查点、促进凋亡和参与DNA损伤修复等。


生物化学与分子生物学 —、抑癌基因对细胞增殖起负性调控作用 抑癌基因的发现源于20世纪60年代H. Harri s的杂合细胞致癌性研究。他将癌细胞株与正常细胞融合得到的杂合细胞接种动物，发现并不产生肿瘤，提示正常细胞中有能抑制肿瘤发生的基因，即抑癌基因。用化学物质诱发的肿瘤及自发发生的肿瘤的细胞与正常细胞制备杂合细胞也可重复出上述结果，并且与肿瘤的组织起源无关，表明上述结果有普遍意义。将不具致癌性的杂合细胞体外培养传代，可从中分离出具有致癌性的子代细胞。比较两种杂合细胞，发现致癌性的子代杂合细胞丢失了来自正常细胞的一条或几条染色体。将正常人类细胞的单条染色体逐一融合在肿瘤细胞中，也可分离到无致癌性的杂合细胞。这些结果说明细胞中含有各种不同的抑癌基因，分布在不同的染色体上，可以分别抑制不同组织起源的癌细胞的致癌作用。


生物化学与分子生物学 —、抑癌基因对细胞增殖起负性调控作用 随着20世纪70年代基因克隆技术的建立，RB、TP53等一系列抑癌基因得以克隆和鉴定。必须指出，最初在某种肿瘤中发现的抑癌基因，并不意味其与别的肿瘤无关；恰恰相反，在多种组织来源的肿瘤细胞中往往可检测出同一抑癌基因的突变、缺失、重排、表达异常等，这正说明抑癌基因的变异构成某些共同的致癌途径。抑癌基因产物的功能多种多样，目前已鉴定的一些抑癌基因产物及其功能如表22-3。总体来说，抑癌基因对细胞增殖起负性调控作用，其编码产物的功能有：抑制细胞增殖；抑制细胞周期进程；调控细胞周期检查点；促进凋亡；参与DNA损伤修复。


生物化学与分子生物学 —、抑癌基因对细胞增殖起负性调控作用 TP53:tumor protein p53,肿瘤蛋白p53基因；APC:adenomalouspolyposis co l)，腺瘤性结肠息肉病基因；DCC:deleted m colorectal carcinoma，结肠癌缺失基因；NF:neurofibromalosis，神经纤维瘤；VHL:von Hippel-Lindau tumor suppressor, VHL肿瘤抑制基因；WT：趴lms lumo)，肾母细胞瘤二、抑癌基因有多种失活机制抑癌基因的失活与原癌基因的激活一样，在肿瘤发生中起着非常重要的作用。但癌基因的作用是显性的，而抑癌基因的作用往往是隐性的。原癌基因的两个等位基因只要激活一个就能发挥促癌作用，而抑癌基因则往往需要两个等位基因都失活才会导致其抑癌功能完全丧失。1971年，KnudsonA以视网膜母细胞瘤(retinoblastoma)为模型进行统计学分析研究，发现散发性单侧视网膜母细胞瘤的发病需要抑癌基因（即后来命名为RB的基因）的两次体细胞突变，从而提出二次打击假说(two-hithypothesis)。


生物化学与分子生物学 —、抑癌基因对细胞增殖起负性调控作用 但也有一些抑癌基因只失活其等位基因中的一个拷贝就会引起肿瘤发生，即其一个正常的等位基因拷贝不足以完全发挥其抑癌功能，称为单倍体不足型抑癌基因(haploinsufficient tumor suppr essorgene)，如p27凡／＇基因。还有一些抑癌基因，如TP53基因，当其一个等位基因突变失活后，其表达的p53突变蛋白则能抑制另一个正常等位基因产生的野生型即正常p53蛋白的功能，这种基因突变称为显性负效突变(dominant negat ive mutation)。 抑癌基因失活的方式常见有以下三种。 （一）基因突变常导致抑癌基因编码的蛋白质功能丧失或降低抑癌基因发生突变后，会造成其编码的蛋白质功能或活性丧失或降低，进而导致癌变。这种突变属千功能失去突变(loss-of-function mutation)。最典型的例子就是抑癌基因TP53的突变，目前已经发现TP53基因在超过一半以上的人类肿瘤中发生了突变。


生物化学与分子生物学 （二）杂合性丢失导致抑癌基因彻底失活 杂合性(heterozygosity)是指同源染色体在一个或一个以上基因座存在不同的等位基因的状态。杂合性丢失(loss of heterozygosity, LOH)则是指一对杂合的等位基因变成纯合状态的现象。杂合性丢失是肿瘤细胞中常见的异常遗传学现象，发生杂合性丢失的区域也往往就是抑癌基因所在的区域。杂合性丢失导致抑癌基因失活的经典实例就是抑癌基因RB的失活。1986年，将视网膜母细胞瘤的RB基因成功克隆后就发现，RB等位基因的一个拷贝往往是通过生殖细胞突变遗传给后代，也就是说，此时后代的体细胞中RB等位基因就呈现为杂合子状态，即：一个为突变失活的不具有抑癌功能的RB等位基因，另一个为仍具有抑癌功能的正常RB等位基因。而当因为某些原因导致正常的邸等位基因丢失即杂合性丢失时，抑癌基因RB则彻底失活，失去其抑癌作用，从而导致视网膜母细胞瘤。


生物化学与分子生物学 （三）启动子区甲基化导致抑癌基因表达抑制 真核生物基因启动子区域CpG岛的甲基化修饰对于调节基因转录活性至关重要，甲基化程度与基因表达呈负相关。很多抑癌基因的启动子区CpG岛呈高度甲基化(hypermeth ylation)状态，从而导致相应的抑癌基因不表达或低表达。例如，约70％的散发肾癌病人中存在抑癌基因VHL启动子区甲基化失活现象；在家族性腺瘤息肉所致的结肠癌中，APC基因启动子区因高度甲基化使转录受到抑制，导致APC基因失活，进而引起仕连环蛋白在细胞内的积累，从而促进癌变发生。 三、抑癌基因在肿瘤发生发展中具有重要作用 抑癌基因的失活在肿瘤发生发展中发挥着重要作用，此处以TP53、RB、PTEN三个抑癌基因为例，简要介绍抑癌基因的作用机制。(-)RB主要通过调控细胞周期检查点而发挥其抑癌功能RB基因失活不仅与视网膜母细胞瘤及骨肉瘤有关，在许多散发性肿瘤，如50%-85％的小细胞性肺癌、10%～30％乳腺癌、膀胱癌和前列腺癌中都发现有RB基因失活。


生物化学与分子生物学 三、抑癌基因在肿瘤发生发展中具有重要作用 RB基因位于染色体13q14，有27个外显子，mRNA长4.7kb，编码的蛋白质为105kD。RB蛋白的磷酸化状态及其与其他蛋白质结合，与它的功能密切相关。去磷酸化（或低磷酸化）形式为活性型，能促进细胞分化，抑制细胞增殖。实验表明，将RB基因导入视网膜母细胞瘤细胞或成骨肉瘤细胞，这些恶性细胞的生长受到抑制。


生物化学与分子生物学 三、抑癌基因在肿瘤发生发展中具有重要作用 RB的磷酸化程度受细胞周期中增殖调控蛋白质的直接控制，包括随着细胞周期不同时相的转换，其浓度也随之发生变化的细胞周期蛋白(cyclin)，以及受到这些蛋白质调节的蛋白激酶。这些蛋白激酶被称为细胞周期蛋白依赖性激酶(cycli n-dependent kinase, CDK)。细胞进入GI期时RB处于低磷酸化状态，而低磷酸化的RB使得细胞不能通过Gl/S期检查点(checkpoint)。该检查点是哺乳动物细胞周期的重要检查点，只有通过该检查点后，细胞周期才能进入下一步运转，进行DNA合成和细胞分裂，故又称为限制点(restri ction poin t)，以符号“R”表示。只有在细胞增殖信号通过依赖于cyclin DI的激酶CDK4的活化导致RB磷酸化后，高磷酸化的RB方允许细胞跨过Gl/S期检查点。因此，低磷酸化的RB在GI期特异的磷酸化是细胞从GI期进入S期的关键。


生物化学与分子生物学 三、抑癌基因在肿瘤发生发展中具有重要作用 低磷酸化RB对细胞周期的负调节作用是通过与转录因子E2F-l的结合而实现的（图22-2)。低磷酸化RB的口袋结构域能结合E2F-l并使之失活，S期必需的基因产物如二氢叶酸还原酶、胸甘激酶、DNA聚合酶a等的合成因而受限，细胞周期的进展受到抑制。而高磷酸化的RB不能与E2F-l结合，将导致这些基因的开放，促进细胞通过Gl-S关卡。RB基因的缺失使得细胞丧失了该关卡的“守卫＂，细胞周期进程失控，细胞异常增殖。（二）TP53主要通过调控DNA损伤应答和诱发细胞凋亡而发挥其抑癌功能TP53基因是目前研究最多的、也是迄今发现在入类肿瘤中发生突变最广泛的抑癌基因。50%~60％的人类各系统肿瘤中发现有TP53基因突变。人的TP53基因定位千17pl3，全长16-20kb，含有11个外显子，转录2.8kb的mRNA，编码蛋白为p53，具有转录因子活性。TP53基因是迄今为止发现的与人类肿瘤相关性最高的基因。过去一直把它当成一种癌基因，直至1989年才知道起癌基因作用的是突变的p53，后来证实野生型p53是一种抑癌基因。


生物化学与分子生物学 三、抑癌基因在肿瘤发生发展中具有重要作用 TP53基因的表达产物p53蛋白由393个氨基酸残基构成，在体内以四聚体形式存在。p53蛋白RB蛋白t凡端@气A仁 凋亡，阻止有癌变倾向突变细胞的生成。 p53突变后，则DNA损伤不能得到有效修DNA i损伤i i DNA i损伤!复并不断累积，导致基因组不稳定，进而五玉］基因尸变-巨三五三］导致肿瘤发生（图22-3)。（三）PTEN主要通过抑制Pl3K/, p2f~ax！功能失活AKT信号通路而发挥其抑癌功能I细胞周期阻滞细胞凋亡!DNA损伤不断累积ten gene，第10号j DNA损伤修复,基因组不稳定染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基l细胞周期_____重启_________,____PTEN基因(phosphataseand tensin hornolog deleted on啦omosome


生物化学与分子生物学 凋亡，阻止有癌变倾向突变细胞的生成。 i+I-~~}因）是继TP53基因后发现的另一个与肿i+I'}瘤发生关系密切的抑癌基因。人的PTEN图22-3p53的结构及其功能基因定位于10q23.3，共有9个外显子和8个内含子，编码5.15kb的mRNA,PTEN蛋白由403个氨基酸残基组成，分子量约为56kD。PTEN主要包括3个结构功能域。1. N端磷酸酶结构区由N端1~185位氨基酸残基组成，第5外显子编码，与蛋白酪氨酸磷酸酶及蛋白质丝／苏氨酸磷酸酶催化区的核心模体(HCXXGXGRXG)同源，是PTEN发挥肿瘤抑制活性的主要功能区。PTEN的N－端175个氨基酸序列可与整合素、酪氨酸激酶、黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)等形成复合物，共同参与细胞生长的调节。此外，PTEN还能与肌动蛋白纤维细丝局部黏附，在肿瘤浸润、转移、血管生成中也起一定作用。


生物化学与分子生物学 凋亡，阻止有癌变倾向突变细胞的生成。 2. C2区由186~351位氨基酸残基构成，介导蛋白质与脂质的结合。PTEN通过C2区结合于膜磷脂，参与PTEN在胞膜的有效定位和胞内细胞信号转导。与其他信号蛋白不同，这一结合过程不需要Ca“参与。磷酸酶区和C2区之间有广泛的相互作用界面，提示C2区可能具有催化作用。已有实验证实，对C2区进行诱变，可导致PTEN的肿瘤抑制活性降低。3. C端区由狻基端的50个氨基酸残基组成，包括PDZ(PSD-95/Dlg/ZOI同源区）结合序列(Thr/Ser-X-Val-COOH)和2个PEST序列(350~375,376~396)，对于调节自身的稳定性和酶活性具有重要作用。研究表明PEST序列与蛋白质降解有关，PDZ结合位点与细胞生长调控有关。PDZ区在肿瘤的发生中也可以缺失突变，虽不影响磷酸酶功能，但对肿瘤细胞铀定非依赖性生长的抑制作用显著降低。


生物化学与分子生物学 凋亡，阻止有癌变倾向突变细胞的生成。 PTEN是迄今发现的第一个具有双特异(dual specificity)磷酸酶活性的抑癌基因，其编码产物PTEN具有磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸3-磷酸酶活性，催化水解磷脂酰肌醇－3,4,5－三磷酸(PIP3)的3磷酸成为PIP2，而PIP3是胰岛素、表皮生长因子等细胞生长因子的信号转导分子，从而抑制PI3K/AKT信号通路，起到负性调节细胞生长增殖的作用（图22-4)。PTEN也能催化黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)的去磷酸化反应，而抑制由整联蛋白(integrin)介导的细胞铺展和迁移，因而PTEN的失活也与肿瘤细胞的转移密切相关。 生长因子等细胞外信号细胞膜 胞生长增殖等四、肿瘤发生发展涉及癌基因和抑癌基因的共同参与目前普遍认为肿瘤的发生、发展是多个原癌基因和抑癌基因突变累积的结果，经过起始、启动、促进和癌变几个阶段逐步演化而产生。


生物化学与分子生物学 (—)肿瘤发生发展涉及多种相关基因的改变 在基因水平上，或通过外界致癌因素，或由于细胞内环境的恶化，突变基因数目增多，基因组变异逐步扩大；在细胞水平上则要经过永生化、分化逆转、转化等多个阶段，细胞周期失控细胞的生长特性百{t:逐步得到强化。结果是相关组织从增生、异型变、良性肿瘤、原位癌发展到浸润癌和转移癌。例如，结肠癌的发生发展过程涉及数种基因的变化（图22-5)：心上皮细胞过度增生阶段：涉及家族性腺瘤性息肉基因FAP(familial adenomatous polyposis)、结肠癌突变基因MCC(mutated in colorectal carcinoma)的突变或缺失；＠早期腺瘤阶段：与DNA的低甲基化有关；＠中期腺瘤阶段：涉及K-RAS基因突变；＠晚期腺瘤阶段：涉及结肠癌缺失基因DCC的丢失；＠腺癌阶段：涉及TP53基因缺失；＠转移癌阶段：涉及NM23(nonmetastatic protein23)基因的突变、血管生长因子基因表达增高等。


生物化学与分子生物学 APC基因K-RAS DC嘎因双拷贝失活基因突变双拷贝丢失TP53丢失其他改变正常结肠早期腺瘤中期腺瘤晚期腺瘤肿瘤转移上皮细胞（仍为良性）昙 （二）细胞周期和细胞凋亡的分子调控是肿瘤进展的关键1.原癌基因和抑癌基因是调控细胞周期进程的重要基因细胞周期调控体现在细胞周期驱动和细胞周期监控两个方面，后者的失控与肿瘤发生发展的关系最为密切。细胞周期监控机制由DNA损伤感应机制、细胞生长停滞机制、DNA修复机制和细胞命运决定机制等构成。细胞一旦发生DNA损伤或复制错误，将会启动DNA损伤应激机制（见第十三章），经由各种信号转导途径使细胞停止生长，修复损伤的DNA。如果DNA损伤得到完全修复，细胞周期可进入下一个时相，正常完成一个细胞分裂周期；倘若DNA损伤修复失败，细胞凋亡机制将被启动，损伤细胞进入凋亡，从而避免DNA损伤带到子代细胞，维持了组织细胞基因组的稳定性，避免肿瘤发生的潜在可能。


生物化学与分子生物学 APC基因K-RAS DC嘎因双拷贝失活基因突变双拷贝丢失TP53丢失其他改变正常结肠早期腺瘤中期腺瘤晚期腺瘤肿瘤转移上皮细胞（仍为良性）昙 肿瘤细胞的最基本特征是细胞的失控性增殖，而失控性增殖的根本原因就是细胞周期调控机制的破坏，包括驱动机制和监控机制的破坏。监控机制破坏可发生在损伤感应、生长停滞、DNA修复和凋亡机制的任何一个环节上，结果将导致细胞基因组不稳定，突变基因数量增加，这些突变的基因往往就是癌基因和抑癌基因。同时，很大一部分的原癌基因和抑癌基因又是细胞周期正常细胞调控机制的组成部分。因此，在肿瘤发展过程中，监控机制的异常会使细胞周期调控机制进一步恶化，并导致细胞周期驱动机制的破坏，细胞周期的驱动能力异常强 DNA修复DNA损伤 A修复DNA修复缺陷化，细胞进入失控性生长状态，从而细胞出基因失活失败千——－抑癌基因缺陷体细胞基因突变 现癌变性生长。2.原癌基因和抑癌基因还是调控细


生物化学与分子生物学 现癌变性生长。2.原癌基因和抑癌基因还是调控细 -l-`胞凋亡的重要基因细胞除了生长、增殖`和分化等之外，还存在细胞死亡现象，如程序性细胞死亡或凋亡。有些抑癌基因的过量表达可诱导细胞发生凋亡，而与细胞生l存相关的原癌基因的激活则可抑制凋亡，细胞增殖＞细胞死亡细胞凋亡异常与肿瘤的发生发展密切相关肿瘤细胞（图22-6)。现已明确，细胞凋亡在肿瘤发吓己生、胚胎发育、免疫反应、肿瘤免疫逃逸、神图22七促进正南细胞向肿瘤细胞转化的因素经系统发育、组织细胞代谢等过程中起重要作用。值得注意的是，近年来的研究也发现，一些非编码RNA，如miRNA，在肿瘤发生过程中也具有重要作用。总之，肿瘤分子生物学的进展已经深刻地改变了人们对肿瘤发生和生命现象的认识，并使肿瘤研究从以揭示肿瘤病因和寻找肿瘤治疗方法为目的的单项研究，转变为以研究整个生命现象和全面揭示生命分子机制为目的的综合性系统研究。肿瘤分子生物学必将在整个生命医学研究中发挥越来越重要的作用。


生物化学与分子生物学 现癌变性生长。2.原癌基因和抑癌基因还是调控细 癌基因是能导致细胞发生恶性转化和诱发癌症的基因。绝大多数癌基因是细胞内正常的原癌基因突变或表达水平异常升高转变而未，某些病毒也携带癌基因。在物理、化学及生物因素的作用下，从原癌基因转变为具有促进细胞恶性转化（癌变）的致癌基因的过程称为原癌基因活化。原癌基因活化主要有基因突变、基因扩增、染色体易位、启动子或增强子获得等机制。生长因子是一类由细胞分泌的、类似于激素的信号分子，主要为肤类或蛋白质类，通过受体跨膜信号转导途径调节细胞的生长与分化，与多种生理及病理状态（如肿瘤、心血管疾病等）有关。不少生长因子已经应用于临床疾病的治疗。原癌基因编码的蛋白质涉及生长因子信号转导的多个环节。抑癌基因，也称肿瘤抑制基因，是防止或阻止癌症发生的基因，抑癌基因的部分或全部失活可显著增加癌症发生风险。抑癌基因对细胞增殖起负性调控作用，包括抑制细胞增殖、调控细胞周期栓查点、促进凋亡和参与DNA损伤修复等。抑癌基因的失活机制包括基因突变、杂合性丢失和启动子甲基化等。肿瘤的发生发展是多个原癌基因和抑癌基因突变累积的结果，经过起始、启动、促进和癌变几个阶段逐步演化而产生。


生物化学与分子生物学 l.什么是癌基因？原癌基因的活化方式有哪些？2.什么是生长因子？简述原癌基因与生长因子信号转导的关系？3什么是抑癌基因？抑癌基因的失活方式有哪些？（卜友泉）第五篇医学分子生物学专题 本篇介绍几项与医学相关的重要分子生物学技术原理和作为目前研究热点的组学。包括DNA重组和重组DNA技术、常用分子生物学技术、疾病相关基因检测、基因诊断和基因治疗以及组学和医学，共五章。疾病和基因的关系始终是医学最为关注的问题。20世纪40年代，L. Pauling提出了“分子病”的概念，1956年，V. Ingram发现血红蛋白B链第六位的谷氨酸突变为继氨酸是导致锁状细胞贫血的原因，J. Lejeune发现Down综合征是由于21号染色体三倍体异常所致，此后，一系列染色体疾病的病因得到解析。随着人类基因组计划的完成，新的DNA标记的发现，使研究常见病的遗传因素成为了可能。2005年，首次用全基因组关联分析(GWAS)，确定了老年性黄斑变性的相关基因，此后，一系列的常见多发疾病基因的GWAS研究，丰富了人们对常见疾病病因和发病机制的认识，同时也为分子诊断、分子靶向干预提供了靶点。


生物化学与分子生物学 l.什么是癌基因？原癌基因的活化方式有哪些？2.什么是生长因子？简述原癌基因与生长因子信号转导的关系？3什么是抑癌基因？抑癌基因的失活方式有哪些？（卜友泉）第五篇医学分子生物学专题 疾病和基因关系的确定，依赖于分析基因结构和功能的方法。F. Sanger分别在1958年和1980年，建立了蛋白质氨基酸序列和DNA核昔酸序列的测定技术，开启了对蛋白质和基因一级结构的认识过程。1975,E. Southern建立了印迹技术，随后衍生出了多种定性和定量的印迹技术、杂交技术和芯片技术等。1983年，E. Mullis建立了聚合酶链反应技术，解决了难以获得大量特异目的DNA的技术瓶颈。1972年，P. Berg获得了第一个重组DNA分子，此后，分子克隆技术得到了广泛的应用。


生物化学与分子生物学 l.什么是癌基因？原癌基因的活化方式有哪些？2.什么是生长因子？简述原癌基因与生长因子信号转导的关系？3什么是抑癌基因？抑癌基因的失活方式有哪些？（卜友泉）第五篇医学分子生物学专题 精准诊断、精准治疗和精准预防依赖于分子水平的诊治。1961年，R. Guthrie建立新生儿苯丙酮尿症的诊断方法，由于早期的确定诊断，避免了苯丙氨酸摄入，使患儿可以健康成长。1978年，华裔科学家简悦威(Kan YW)应用DNA多态性的标记，成功地在产前诊断了锁状细胞贫血，开启了基因诊断的先河。1990年，F. Anderson将正常腺昔脱氨酶(ADA)基因，以逆转录病毒为载体导入到患儿的淋巴细胞中，回输患儿，免疫功能得到持续的恢复，成为真正意义的基因治疗。随着对基因治疗载体等深入了解，加之诸如以CRISPR/Cas9为代表基因编辑技术的发展，人们对基因治疗寄予厚望。


生物化学与分子生物学 （吕社民）第二十三章DNA重组和重组DNA技术 DNA重组(DNA recombination)是指DNA分子内或分子间发生的遗传信息的重新共价组合过程，包括同源重组、位点特异性重组和转座重组等类型，广泛存在千各类生物，构成了生物的基因变异、物种进化或演变的遗传基础；体外通过人工DNA重组可获得重组体DNA，是基因工程中的关键步骤。重组DNA技术(recombinant DNAtechnology)是指通过体外操作将不同来源的两个或两个以上DNA分子重新组合，并在适当细胞中扩增形成新的功能分子的技术。重组DNA技术可组合不同来源的DNA序列信息，从而创造自然界以前可能从未存在过的遗传修饰生物体，为在分子水平上研究生物奥秘提供了可操作的活体模型。


生物化学与分子生物学 第一节自然界的DNA重组和基因转移 DNA重组是两个或两个以上DNA分子重新组合形成一个DNA分子的过程；而自然界中的基因转移泛指DNA片段或基因在不同生物个体或细胞间的传递过程，其中通过繁殖使DNA或基因在亲代和子代间的传递称作基因纵向转移，打破亲缘关系以直接接触、主动摄取或病毒感染等方式使基因在不同生物个体或细胞间、细胞内不同细胞器间的传递称作基因横向（水平）转移。自然界不同物种或个体之间的DNA重组和基因转移是经常发生的，这增加了群体的遗传多样性，也通过优化组合积累了有意义的遗传信息。DNA重组和基因转移的方式有多种，包括同源重组、位点特异性重组、转座重组、接合、转化和转导等，其中前三种方式在原核和真核细胞中均可发生，后三种方式通常发生在原核细胞。新近研究发现细菌还有一种DNA整合机制，称作成簇规律间隔短回文重复(clustered-regulru·ly interspaced palindromic repeats, CRISPR)I Cas系统。


生物化学与分子生物学 —、同源重组是最基本的DNA重组方式 同源重组(homologous recombination)是指发生在两个相似或相同DNA分子之间核昔酸序列互换的过程，又称基本重组(general recombination)。在哺乳动物配子发生的减数分裂过程中，同源重组可产生DNA序列的新重组，标示着后代的遗传变异；不同种属的细菌和病毒也在水平基因转移中用同源重组互换遗传物质。具有同源序列的两条DNA链通过断裂和再连接引起DNA单链或双链片段的交换。同源重组的缺陷与人类癌症高度相关，例如，两个相似的抑癌基因brcal和brca2编码的蛋白质BRCA l和BRCA2与同源重组的发生有关，BRCA2的功能是帮助同源重组的起始，缺乏brcal和brca2的细胞同源重组率减少，对电离辐射的敏感性增加，因此，缺乏brcal和brca2的个体易于患乳腺癌和卵巢癌等。利用同源重组的原理进行基因敲除或基因敲入（也称基因打靶），是将遗传改变引入靶生物体的一种有效方式。为了便于读者理解基本的同源重组原理，下面主要介绍Holliday模式的同源重组，并以细菌的RecBCD同源重组作为Holliday同源重组的例子。


生物化学与分子生物学 (—)Holliday模型是最经典的同源重组模式 同源重组作为自然界最基本的DNA重组方式，不需要特异DNA序列，而是依赖两分子之间序列的相同或相似性。R. Holliday于1964年提出Holliday模型，对于认识同源重组起着十分重要的作用。在这一模型中，同源重组主要经历四个关键步骤（图23-1):CD两个同源染色体DNA排列整齐；＠－个DNA的一条链断裂，与另一个DNA对应链连接，在这个过程中形成了十字形结构，称作Holliday连接(Holl iday j u nction)；＠通过分支移动(branch migration)产生异源双链DNA(heteroduplex DNA)，也称Holliday中间体(inter-mediate)；@）将Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA。Holliday中间体切开方式不同，所得到的重组产物也不同：如果切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA，称为片段重组体(patch recombinant)；如果切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA，称为拼接重组体(splice recombinant)。 \"口｝两个同源DNA分子j切除正5'－端DNA序列断裂口3'－端侵入正常同源双链中Holliday连接a j DNA连接酶封口Holliday中间体水平分离垂直分离I片段重组体拼接重组体422第五篇医学分子生物学专题 （二）RecBCD模式是大肠埃希菌的Holliday同源重组目前对大肠埃希菌(E. coli)的DNA同源重组分子机制了解最清楚。参与细菌DNA同源重组的酶有数十种，其中最关键的是RecA蛋白、RecBCD复合物和RuvC蛋白。1参与细菌RecBCD同源重组的酶细菌的RecBCD同源重组由以下酶和酶复合物催化完成2. E coli的RecBCD同源重组过程E. co li的RecBCD同源重组过程如图23-2:RecBCD复合物识别双链断裂的断裂口平端或近似平端，然后向上游边移行边解链；当遇到C加位点时，在3I单链上切开产生单链切口；RecA蛋白催化3仁单链DNA对另一双链DNA的侵入，并与其中的一条链交叉，继而交叉分支移动，待相交的另一链在RecBCD内切酶活性催化下断裂后，由DNA连接酶交换连接缺失的远末端，形成Holliday中间体；此中间体再经RuvC切割和DNA连接酶的连接，最后完成重组。二、位点特异性重组是发生在特异位点间的DNA整合位点特异性重组(si te specific recombinati on)是指发生在至少拥有一定程度序列同源性片段间DNA链的互换过程，也称保守的位点特异性重组(conservative site-specific recombination)。位点特异性重组酶(site-specific recombinase, SSR)通过识别和结合DNA短序列（位点）使DNA片段发生重排。该类重组广泛存在于各类细胞中，起着十分重要的作用，如某些基因表达的调节、发育过程中程序性DNA重排以及有些病毒和质粒DNA复制循环过程中发生的整合和切除等。以下是位点特异性重组的例子。 (-)入噬菌体DNA可与宿主染色体DNA发生整合 入噬菌体DNA的整合是在入噬菌体的整合酶催化下完成的，是入噬菌体DNA与宿主染色体DNA特异靶位点之间的选择性整合（图23-3)心噬菌体DNA的重组位点att P与大肠埃希菌基因组DNA的重组位点att B之间有15bp核心序列相同，在整合酶(In t)和整合宿主因子(IHF)作用下可发生整合，由Xis参与切除过程。通常这种由整合酶催化的DNA整合是十分特异而有效的。逆转录病毒整合酶可特异地识别、整合逆转录病毒cDNA的长末端重复序列(lo n g terminal repeat, LTR)。（二）基因片段倒位是细菌位点特异性重组的一种方式以鼠伤寒沙门菌H抗原编码基因中H片段重组为例。鼠伤寒沙门菌的H抗原有两种，分别为H1和H2鞭毛蛋白。在单菌落的沙门菌中经常出现少数另一种含H抗原的细菌，这种现象称为鞭毛相转变。遗传分析表明，这种抗原相位的改变是由基因中一段995bp的H片段发生倒位所致。如图23-4所示，H片段的两端为14bp的特异性重组位点(h ix)，其方向相反，发生重组后可使H片段倒位。H片段上有两个启动子(P)，其一驱动hin基因表达，另一个驱动H2和rHl基因表达，倒位后H2和!RecBCD结合到断裂口的断端（钝端或近似钝端）5'—-－·衄iRecBDC向上滑行，DNA解旋，双链打开i解旋后的DNA单链末蜘且火，单链区形成“loop"RecA核蛋白丝iRec战支载到3'－单链上千了？孟饮同源染色体DNA的双链(Rec2:已勹om)／\Non-：巴亡copy)亏. 二入－噬菌体DNAgaJ+-attB hio+E. coli染色体DNAj入－噬菌体DNA整合到宿玉色体中一I叫一 溶源噬菌体图23-3入噬菌体DNA与大肠埃希菌基因组DNA的位点特异性重组图23-4沙门菌H片段倒位决定鞭毛相转变hix为14bp的反向重复序列；rHl为Hl阻遏蛋白编码基因；P代表启动子rHJ基因不表达。加n基因编码特异的重组酶，即倒转酶(invertase)Hin，该酶为同源二聚体，分别结合在两个h ix位点上，并由辅因子凡s(factor for inversion stimul ation)促使DNA弯曲而将两个hix位点连接在一起，DNA片段经断裂和再连接而发生倒位。rHl表达产物为Hl阻遏蛋白，当H2基因表达时，rHl也表达，从而使HJ基因被阻遏；反之，H2基因不表达时，rHJ也不表达，HJ基因阻遏被解除。（三）免疫球蛋白基因以位点特异性重组发生重排免疫球蛋白编码基因V-(D)-J重排及T细胞受体基因V-(D)-J重排都是利用位点特异性重组的原理。 三、转座重组可使基因位移 转座重组(transpos山onal recombination)或转座(transposition)是指由插入序列和转座子介导的基因移位或重排。（－）插入序列是最简单的转座元件插入序列(insertion sequence, IS)是指能在基因（组）内部或基因（组）间改变自身位置的一段DNA序列。通常是转座子的一种，只携带与自身转座有关的编码基因，具有独特的结构特征：两端是反向重复序列(inverted repeat, IR)，中间是一个转座酶(transposase)编码基因，后者的表达产物可引起IS转座。典型的IS两端各一个9~4lbp的反向重复序列，反向重复序列侧翼连接有短的(4~12bp)、不同的IS所特有的正向重复序列。IS发生的转座有保守性转座(conservative transposition)和复制性转座(duplicative transposition)两种形式，前者是IS从原位迁至新位（图23-5)，后者是IS复制后的一个复制本迁至新位。 白蛋424第五篇医学分子生物学专题H片段Hin倒转酶H濂毛蛋白归一j重组位点靠近插入序列：j转座正向重复序列反向重复序列反向重复序列间之列点列重两重五向的向芦正形复后到制入复插列列妇三 (IS)，除有与转座有关的编码基两边侧翼序列是插入序列一个中心区域itTn)即有转座子(cosempo，，囚！转座子(transposon, Tn)是指能将自身或其拷贝插入基因组新位置的DNA序列，一般属于复合型因外，还携带其他基因如抗生素抗性基因等（图23-6)。Tn普遍存在于原核和真核细胞中，不但可以在一条染色体上移动，也可以从一条染色体跳到另一条染色体上，甚至从一个细胞进入另一个细胞。Tn在移动过程中，DNA链经历断裂及再连接的过程，可能导致某些基因开启或关闭，引起插入突变、新基因生成、染色体畸变及生物进化。 转座酶基因国IR"转座酶基因l阻遏蛋白I P－内酰胺酶I IR Fef-R基因产A曰ISIO叫jemA盐必兰l lemB|jemC巳IS10曰(a)IS：转座酶编码基因两侧连接反向重复序列(IR);(b)转座子Tn3：含有转座酶、B－内酰胺酶及阻遏蛋白编码基因；（c）转座子TnlO：有两个1S10，其中只有一个编码有功能的转座酶；ISIO之间有5个基因（简称Fej-R基因），其中位于TnlO中间tetA和tetR是四环素抗性基因，另外3个基因jemA、jemB和jemC的功能尚不清楚四、原核细胞可通过接合、转化和转导进行基因转移或重组原核细胞（如细菌）可通过细胞间直接接触（接合作用）、细胞主动摄取（转化作用）或噬菌体传递（转导作用）等方式进行基因转移或重组。(—)接合作用是质粒DNA通过细胞间相互接触发生转移的现象接合作用(conjugation)是指细菌的遗传物质在细菌细胞间通过细胞－细胞直接接触或细胞间桥样-. 426第五篇医学分子生物学专题 连接的转移过程。当细菌通过鞭毛相互接触时，质粒DNA就可以从一个细菌转移至另一细菌，但并非任何质粒DNA都有这种转移能力，只有某些较大的质粒，如F因子(F facto1)，方可通过接合作用从一个细胞转移至另一个细胞。F因子决定细菌表面鞭毛的形成，当含有F因子的细菌(F细菌）与没有F因子的细菌(F细菌）相遇时，在两细菌间形成性鞭毛连接桥，接着质粒双链DNA中的一条链会被酶切割，产生单链切口，有切口的单链DNA通过鞭毛连接桥向F细胞转移，随后，在两细胞内分别以单链DNA为模板合成互补链。（二）转化作用是受体细胞自主摄取外源DNA并与之整合的现象转化作用(transformation)是指受体菌通过细胞膜直接从周围环境中摄取并掺入外源遗传物质引起自身遗传改变的过程，受体菌必须处千敏化状态，这种敏化状态可以通过自然饥饿、生长密度或实验室诱导而达到。例如，当溶菌时，裂解的DNA片段作为外源DNA被另一细菌（受体菌）摄取，受体菌通过重组机制将外源DNA整合至其基因组上，从而获得新的遗传性状，这就是自然界发生的转化作用。然而，由于较大的外源DNA不易透过细胞膜，因此，自然界发生转化作用的效率并不高，染色体整合概率则更低。（三）转导作用是病毒将供体DNA带入受体并与之染色体发生整合的现象转导作用(transduction)是指由病毒或病毒载体介导外源DNA进入靶细胞的过程。自然界中常见的例子是噬菌体介导的转导，包括普遍性转导(generalized transduction)和特异性转导(speci alized transduction)，后者又称为限制性转导(restricted transduction)。1.普遍性转导的基本过程当噬菌体在供体菌内包装时，供体菌自身的DNA片段被包装入噬菌体颗粒，随后细菌溶解，所释放出来的噬菌体通过感染受体菌而将所携带的供体菌DNA片段转移至受体菌中，进而重组千受体菌的染色体DNA上。2特异性转导的基本过程当噬菌体感染供体菌后，噬菌体DNA以位点特异性重组机制整合千供体菌染色体DNA上；当整合的噬菌体DNA从供体菌染色体DNA上切离时，可携带位千整合位点侧翼的DNA片段，随后切离出来的噬菌体DNA被包装入噬菌体衣壳中；供体菌裂解，所释放出来的噬菌体感染受体菌，继而，携带有供体菌DNA片段的噬菌体DNA整合于受体菌染色体DNA的特异性位点上。这样，位于整合位点侧翼的供体菌DNA片段重组至受体菌染色体DNA上。五、细菌可通过CRISPR/Cas系统从病毒获得DNA片段作为获得性免疫机制CRISPR/Cas系统(CRISPR/Cas system)是原核生物的一种获得性免疫系统，用于抵抗存在于噬菌体或质粒的外源遗传元件的入侵。关于细菌的CRISPR/Cas系统的发现过程可参看数字扩展相关内容。(-)CRISPR序列的结构特征成簇规律间隔短回文重复(cluste red regularly interspaced palindromic repeats, CRISPR)座CRISPR loci)是指细菌基因组上成簇排列的、由来自噬菌体DNA的间隔序列(spacer)和宿主菌基因组的重组序列所形成的特殊重复序列－间隔序列阵列，与Gas基因(CRISPR-associated gene, Cas gene)相邻（图23-7)。CRISPR存在千已测序的40％细菌基因组和90％古细菌(archaea)基因组中。 重复序列尸一一一一一一一一一一一一一一一一1固23-7CRISPR座结构特征（二）外源DNA可插入宿主基因组的CRISPR座 以噬菌体感染为例。当噬菌体感染宿主菌后，噬菌体DNA进入宿主细胞并复制，复制所产生的DNA片段可以被宿主细胞的Casl-Cas2复合物捕获。然后，Casl-Cas2复合物将所捕获的DNA片段插入到宿主基因组CRISPR座位的第一个位点，Casl在此过程中协调切割－连接反应，即在重复序列5I端切开，然后与DNA片段的3'－端连接（图23-8)。这种机制在跨越插入的DNA片段两端的重复序列上产生两个单链DNA缺口，最后由DNA聚合酶将缺口封闭。 53,l-\35/,'/__靶向性复合物病毒复制时产生的DNA片段＝ Casl-Cas2复合物－DNA片段靶向CRISPR座位的第一个位点，Cas劝：重复序列－1(Rl)的5'－端Casl-Cas2/z-＼切开单链复合物/，切＼／引导序列点,,,,/5'33'5'间隔序列(S)的：＇－端与重妞列(R)的5'端连y了』新间隔序列（新S)插入CRISP瞳醴分位点，重复序列按另一条单链上的模板序列复制补齐，并在新S前5,复制出新的重复序列（新R)，缺口由DNA聚合酶封闭35',3呵引导序列鲁新S S1R2(Leader)（三）CRISPR/Cas系统是细菌的获得性免疫机制CRISPR/Cas系统是指由Cas基因编码的Cas蛋白催化CRISPR形成，以及CRISPR转录产物与Cas蛋白相配合介导入侵DNA切割的机制，并成为细菌抵抗病毒感染的一种获得性免疫机制。根据Cas蛋白的功能可将其分为三型，即I型、Il型和III型，其中Il型CRISPR/Cas9系统是目前应用最多的。以Il型CRISPR/Cas9系统为例介绍CRISPR/Cas系统的工作原理（图23-9)=n型系统中由重复序列及间隔序列(spacer)组成的CRISPR座位经转录产生CRISPR-RNA(crRNA)前体(pre-crRNA)和tracrRNA(trans-encoded crRNA); tracrRNA与pre-erRNA的重复序列区互补配对产生局部双链RNA(dsRNA);RNase III识别并切割dsRNA产生向导crRNA(g uide crRNA, gcrRNA)；宿主细胞表达的Cas9核酸酶与gcrRNA结合形成Cas9-crRNA复合物；当含有相同间隔序列的噬菌体或质粒再次入侵时，Cas9-crRNA复合物与入侵DNA上的原间隔序列(protospacer)互补配对形成由protospacer/crRNA组成的R－环双链结构，Cas9识别并切割R－环，从而在入侵者的基因组上产生切口。Cas9切割的靶序列下游有一个紧邻原间隔序列基序(protospacer-adjacentmotif, PAM)，可能对于Cas9寻找靶序列有一定作用。CRISPR/Cas9系统是一种细菌防御病毒和质粒攻击的获得性免疫机制，目前已经被开发成\一种应用最多的高效率、低脱靶率的基因组编辑(genome editing)技术。 428第五篇医学分子生物学专题 引导序列tracrRNA Cas9(leader)CRISPR座 基因--～一--·-．一一、、、、lgcrRNA-Cas9复合物靶向人侵DNA的靶序列R－环＼义gcrRNA-Cas9复合物 靶序列;、---j-"'PAM｀割后的靶序列出现缺口重组DNA技术又称分子克隆(molecular cloning)、DNA克隆(DNA cloning)或基因工程(genetic engineering)，是指通过体外操作将不同来源的两个或两个以上DNA分子重新组合，并在适当细胞中扩增形成新功能DNA分子的方法，其主要过程包括：在体外将目的DNA片段与能自主复制的遗传元件（又称载体）连接，形成重组DNA分子，进而在受体细胞中复制、扩增及克隆化，从而获得单一DNA分子的大量拷贝。在克隆目的基因后，还可针对该基因进行表达产物蛋白质或多肤的制备以及基因结构的定向改造已。自1972年成功构建第一个重组DNA分子以来，重组DNA技术得到了快速发展，人们几乎可以随心所欲地分离、分析、切割－连接等操作基因。另外，该技术在生物制药、基因诊断、基因治疗等诸多方面都得到了广泛应用。 一、重组DNA技术中常用的工具酶 在重组DNA技术中，常需要一些工具酶用于基因的操作。例如，对目的DNA(target DNA)进行处理时，需利用序列特异性限制性核酸内切酶(restri ction endonuclease, RE), RE在准确的位置切割DNA，使较大的DNA分子成为一定大小的DNA片段；构建重组DNA分子时，必须在DNA连接酶催化下才能使DNA片段与载体共价连接。此外，还有一些工具酶也是重组DNA时所必不可少的。（一）常用工具酶具有各自功能为了方便快速浏览重组DNA技术中一些常用工具酶及其基本功能，我们将一些常用工具酶概括flt~il.于表23-1。在所有工具酶中，RE具有特别重要的地位，因此，有关RE的内容单独介绍。工具酶功能RE识别特异序列，切割DNA DNA连接酶催化DNA中相邻的5'－磷酸基团和3'－胫基末端之间形成磷酸二酣键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接起来DNA聚合酶I具有5'-+3'聚合、3'一5'外切及5'-+3'外切活性，用于合成双链cDNA分子或片段连接；缺口平移法制作高比活性探针；DNA序列分析；填补3'末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的5'-+3'聚合及3'-+5'外切活性，但缺乏5'-+3'外切活性。常用于cDNA第二链合成、双链DNA的3'－端标记等逆转录酶是以RNA为模板的DNA聚合酶，用于合成cDNA，也用于替代DNA聚合酶I进行缺口填补、标记或DNA序列分析等多聚核昔酸激酶催化多聚核昔酸5'－胫基末端磷酸化或标记探针等末端转移酶在3仁胫基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基团（二）限制性核酸内切酶是最重要的工具酶限制性核酸内切酶(RE)简称为限制性内切酶或限制酶，是一类核酸内切酶，能识别双链DNA分子内部的特异序列并裂解磷酸二酷键。除极少数RE来自绿藻外，绝大多数来自细菌，与相伴存在的甲基化酶共同构成细菌的限制－修饰体系(restriction mod山cation system), RE对甲基化的自身DNA分子不起作用，仅对外源DNA切割，因此对细菌遗传性状的稳定具有重要意义。


生物化学与分子生物学 一、重组DNA技术中常用的工具酶 3'方向的序列完全一致。例如，EcoR I的识别序列，在两条链上的5I----+3'序列均为GAAITC。RE识别位点RE识别位点Apa I GGGCC'C Sma I CCC'GGG C'CCGGG GGG'CCC BamH I G'GATCC Sau3A I GATC'CCTAG'G CTAG Pst I CTGCA'G Not I GC'GGCCGC G'ACGTC CGCCGG'CG EcoR I G'AAITC Sfi I GGCCNNN'NGGCC CTIAA'G CCGGN'NNNCCGG'代表切割位点，N代表任意碱基\(?e@430第五篇医学分子生物学专题二、重组DNA技术中常用的载体载体(vector)是为携带目的外源DNA片段、实现外源DNA在受体细胞中无性繁殖或表达蛋白质所采用的一些DNA分子，按其功能可分为克隆载体和表达载体两大类，有的载体兼有克隆和表达两种功能。


生物化学与分子生物学 （一）克隆载体用于扩增克隆化DNA分子 克隆载体(cloning vector)是指用于外源DNA片段的克隆和在受体细胞中扩增的DNA分子，一般应具备的基本特点：O至少有一个复制起点使载体能在宿主细胞中自主复制，并能使克隆的外源DNA片段得到同步扩增；＠至少有一个选择标志(selection marker)，从而区分含有载体和不含有载体的细胞，如抗生素抗性基因、B－半乳糖昔酶基因(lacZ汃营养缺陷耐受基因等；＠有适宜的RE单一切点，可供外源基因插入载体。常用克隆载体主要有质粒、噬菌体DNA等。1.质粒克隆载体质粒克隆载体是重组DNA技术中最常用的载体，可以是天ampR然质粒，更多是人工改造的质粒。质粒是Hind1ll细菌染色体外的、能自主复制和稳定遗传Sph I的双链环状DNA分子，具备作为克隆载体Pstl的基本特点包。例如，pUC18质粒载体，Sa II,Ace I,Hine II具有一个复制起点ori，一个选择标志——Xbal氨茉青霉素抗性基因ampR，多个单一酶切BamHJ位点，也称多克隆酶切位点(multiple Sma I,Xmal cloning sites, MCS)（图23-10)。Kpn I2.噬菌体DNA载体入和M13噬Sac I菌体DNA常用作克隆载体。稍早经入噬EcoR I菌体DNA改造的载体系统有入gt系列（插入型载体，适用于cDNA克隆）和EMBL系图23-10pUC18质粒克隆载体图谱列（置换型载体，适用于基因组DNA克隆）；经改造的M13载体有M13mp系列和pUC系列，它们是在M13的基因间隔区插入了大肠埃希菌(E. coli)的一段调节基因及B－半乳糖昔酶(LacZ)N-端146个氨基酸残基编码基因，其编码产物为B－半乳糖昔酶的Q片段。突变的E.coli宿主(lac-)仅表达该酶的Q片段（酶的C－端）。单独存在B－半乳糖昔酶的Q片段或o片段都没有酶的活性，只有携带Q片段基因的Ml3进入宿主细胞，宿主细胞才能同时表达Q和Q片段，产生有活性的B－半乳糖昔酶，使特异性底物变为蓝色化合物，这就是所谓的a互补(ex complementation)。当外源基因的插入位点设计在LacZ基因内部时，外源基因的插入则会干扰LacZ的表达，利用lacz-菌株为宿主细胞，在含Lacz底物X-gal和诱导剂IPTG的培养基上生长时会出现白色菌落；如果在lacZ基因内无外源基因插入，则有Lacz表达，转化菌在同样条件下呈蓝色菌落，这就是蓝白筛选。现在，很多质粒载体也构建了蓝白筛选系统。


生物化学与分子生物学 （一）克隆载体用于扩增克隆化DNA分子 3.其他克隆载体为增加克隆载体携带较长外源基因的能力，还设计有柯斯质粒(cosmid)载体（又称黏粒载体）、细菌人工染色体(bacterial artificia l chromosome, BAC)载体和酵母人工染色体(yeast artific ial chromosome, YAC)载体等。柯斯质粒是人工构建的含入DNA Cos序列和质粒复制子的特殊类型质粒载体，自身分子量一般只有5~7kb，但能携带的外源DNA片段最大可达45kb。BAC是以大肠埃希菌性因子F质粒为基础构建的克隆载体，可携带的外源DNA片段在50-300kb之间。YAC是含酵母染色体上必需的端粒、着丝点和复制起始序列的入工构建载体，能携带400kb左右的DNA片段。


生物化学与分子生物学 （二）表达载体能为外源基因提供表达元件 表达载体(expression vec tor)是指用来在宿主细胞中表达外源基因的载体，依据其宿主细胞的不同可分为原核表达载体(proka1-yotic express ion vector)和真核表达载体(eukaryotic expression vector)，它们的区别主要在千为外源基因提供的表达元件。利用表达载体提供的表达元件也可在体外建立无细胞表达体系(cell-free expression system)，根据表达载体上的表达元件决定提供原核细胞提取物或真核细胞提取物，其基本工作原理相同于在细胞内。下面简介原核表达载体和真核表达载体的结构特点。1.原核表达载体该类载体用于在原核细胞中表达外源基因，由克隆载体发展而来，除了具有克隆载体的基本特征外，还有供外源基因有效转录和翻译的原核表达调控序列，如启动子、核糖体结合位点即SD序列(Sh ine-Dalgarno sequ ence汃转录终止序列等。原核表达载体的基本组成如图23-11所示。目前应用最广泛的原核表达载体是E. coli表达载体。


生物化学与分子生物学 转录方向,编码序列二二二GTC/'ITGTAAffG二-35区-10区起始密码子终止密码子 图23-11原核表达载体的基本框架注：R：调节序列；P：启动子；SD:SD序列；TI：转录终止序列；amp＼氨某青霉素抗性基因2.真核表达载体该类载体用于在真核细胞中表达外源基因，也是由克隆载体发展而来的，除了具备克隆载体的基本特征外，所提供给外源基因的表达元件是来自真核细胞的。质粒真核表达载体一般具备的特点包括：心含有必不可少的原核序列，如复制起点、抗生素抗性基因、多克隆酶切位点(MCS)等，用于真核表达载体在细菌中复制及阳性克隆的筛选；＠真核表达调控元件，如真核启动子、增强子、转录终止序列、poly(A)加尾信号等；＠真核细胞复制起始序列，用于载体或基因表达框架在真核细胞中的复制；＠真核细胞药物抗性基因，用千载体在真核细胞中的阳性筛选包。图23-12显示的是真核表达载体的基本组成。根据真核宿主细胞的不同，真核表达载体可分为酵母表达载体、昆虫表达载体和哺乳类细胞表达载体等。


生物化学与分子生物学 三、重组DNA技术的基本原理及操作步骤 完整DNA克隆过程包括五大步骤（图23-13)：心目的DNA的分离获取（分）；＠载体的选择与准备（选）；＠目的DNA与载体的连接（连）；＠重组DNA转入受体细胞（转）；＠重组体的筛选及鉴定432第五篇医学分子生物学专题原核选压orf uk择标记on真核选择标记P MCS图23-12真核表达载体的基本组成注：0产：原核复制起始序列；P：启动子；MCS：多克隆位点；TT：转录终止序列；ori'气真核复制起始序列。注意不是所有真核表达载体都有整合序列（－）目的DNA的分离获取是DNA克隆的第一步分离获取目的DNA的方法主要有以下几种：载体外源重组DNA分子1.化学合成法该方法可直接合成目的|DNA片段，通常用于小分子肤类基因的合成，转化或转染其前提是已知某基因的核昔酸序列，或能根据。氨基酸序列推导出相应核昔酸序列。一般先合细菌成两条完全互补的单链，经退火形成双链，然后克隆于载体。


生物化学与分子生物学 2.从基因组文库和cDNA文库中获取目今二-,的DNA关于两种文库的构建和从文库中筛选目的DNA/cDNA的方法已经基本商业化了细菌在培养液可以根据具体需求从公司订购。／／＄彗已[固 3. PCR法PCR是一种高效特异的体外扩增DNA的方法（见第二十四章）国。使用PCR法的前提是：已知待扩增目的基因或DNA筛选含重组片段两端的序列，并根据该序列合成适当引物。质粒的细菌4.其他方法除上述方法外，也可采用酵母单杂交系统克隆DNA结合蛋白的编码基因，或用酵母双杂交系统克隆特异性相互作用蛋白图23-13以质粒为载体的DNA克隆过程质的编码基因。


生物化学与分子生物学 2.从基因组文库和cDNA文库中获取目今二-,的DNA关于两种文库的构建和从文库中筛选目的DNA/cDNA的方法已经基本商业化了细菌在培养液可以根据具体需求从公司订购。／／＄彗已[固 （二）载体的选择与准备是根据目的DNA片段决定的进行DNA克隆的目的主要有二：一是获取目的DNA片段，二是获取目的DNA片段所编码的蛋白质。针对第一种目的，通常选用克隆载体；针对第二种目的，需选择表达载体。另外，选择载体时还要考虑目的DNA的大小、受体细胞的种类和来源等因素（表23-3)。除了上述需要考虑的因素外，选择载体时还需要注意载体内应有适宜的单一酶切位点或MCS，以便根据目的DNA片段，对载体进行适当的酶切处理。总之，在重组DNA技术中，载体的选择、准备和改进极富技术性，目的不同，操作基因的性质不同载体的选择和改建方法也不同。


生物化学与分子生物学 载体插入DNA片段的适宜长度宿主细胞 质粒<5-lOkb细菌，酵母入噬菌体DNA载体~20kb晨门•----细菌黏粒~50kb细菌贮—-－－一－--·咖l虹•--..._-－」，一·l.擘----千一-..,__--厚_..


生物化学与分子生物学 载体插入DNA片段的适宜长度宿主细胞 YAC~3Mb酵母妇1,注：BAC:bacterial artificial chromosome，细菌人工染色体；YAC:yeast rutificial chromosome，酵母人工染色体（三）目的DNA与载体连接形成重组DNA依据目的DNA和线性化载体末端的特点，可采用不同的连接策略岱。主要连接策略如下：（四）重组DNA转入受体细胞使其得以扩增重组DNA转入宿主细胞后才能得到扩增。理想的宿主细胞通常是DNA／蛋白质降解系统和（或）重组酶缺陷株，这样的宿主细胞称为工程细胞。工程细胞具有较强的接纳外源DNA的能力，可保证外源DNA长期、稳定地遗传或表达。将重组DNA导入宿主细胞的常用方法有如下几种：1.转化转化(transforma tion)是指将外源DNA直接导入细菌、真菌的过程，例如，重组质粒导入大肠埃希菌。然而，只有细胞膜通透性增加的细菌才容易接受外源DNA，这样的细菌称作感受态细胞(competent cells)。实现转化的方法包括化学诱导法（如氯化钙法）、电穿孔(electroporation)法等。此外，将质粒DNA直接导入酵母细胞以及将黏粒DNA导入细菌的过程也称作转化。 434第五篇医学分子生物学专题 2转染转染(transfection)是指将外源DNA直接导入真核细胞（酵母除外）的过程。常用的转染方法包括化学方法（如磷酸钙共沉淀法、脂质体融合法等）和物理方法（如显微注射法、电穿孔法等）。此外，将噬菌体DNA直接导入受体细菌的过程也称作转染。3.感染感染(infection)是指以病毒颗粒作为外源DNA运载体导入宿主细胞的过程。例如，以噬菌体、逆转录病毒、腺病毒等DNA作为载体构建的重组DNA分子，经包装形成病毒颗粒后进入宿主细胞。 （五）重组体的筛选与鉴定 重组DNA分子导入宿主细胞后，可通过载体携带的选择标记或目的DNA片段的序列特征进行筛选和鉴定，从而获得含重组DNA分子的宿主细胞。筛选和鉴定方法主要有遗传标志筛选法、序列特异性筛选法、亲和筛选法等。1.借助载体上的遗传标志进行筛选载体上通常携带可供重组体筛选的遗传标志，如抗生素抗性基因等，据此可对含重组DNA的宿主细胞进行筛选。(1)利用抗生素抗性标志筛选：将含有某种抗生素抗性基因的重组载体转化宿主细胞，然后在含相应抗生素的培养液中培养此细胞，若细胞能在这种条件下生长，则说明细胞中至少应含有导入的载体，但是否是插入目的DNA的载体，还需要进一步鉴定。若细胞中没有载体，则被抗生素杀死。(2)利用基因的插入失活／插入表达特性筛选：针对某些带有抗生素抗性基因的载体，当目的DNA插入抗性基因后，可使该抗性基因失活。如果还以这种抗生素抗性进行筛选，不能生长的细胞应该是含重组DNA的细胞。以这种方式筛选时，通常载体上携带一个以上筛选标志基因。例如pBR322质粒含有氨茉青霉素抗性基因(ampR)和四环素抗性基因(tet11)，如将目的DNA插入tetR中，tetR失活，含重组DNA的细胞只能在含氨苯青霉素的培养基中生长，而不能在含四环素的培养基中生长（图23-14)。(3)利用标志补救筛选：标志补救(marker rescue)是指当载体上的标志基因在宿主细胞中表达时，宿主细胞通过与标志基因表达产物互补弥补自身的相应缺陷，从而在相应选择培养基中存活。利用该策略可初步筛选含有载体的宿主细胞。例如，S. cere'Visiae酵母菌株，因trpl基因突变而不能在缺少色氨酸的培养基上生长，当转入带有功能性trpl基因（主平板）用ampR和LetR标志筛选含外源DNA的重组子的重组载体后，转化菌则能在色氨酸缺陷的培养基上生长。标志补救也可用于外源基因导入哺乳类细胞后阳性克隆的初筛，例如，当将带有二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(dhfr）的真核表达载体导入dhfr缺陷的哺乳类细胞后，则可使细胞在无胸腺晓唗的培养基中存活，从而筛选出带有载体的克隆(DHFR可催化二氢叶酸还原成四氢叶酸，后者可用千合成胸腺啼唗）。利用a互补筛选携带重组质粒的细菌也是一种标志补救筛选方法。关千a互补原理在本节”重组DNA技术中常用载体”部分已有介绍，在此仅以图23-15概括说明将外源基因插入载体lacZ基因扣I., N－端序列时是如何进行筛选的。 a片段的编码序列被分割ampR外源DNA MCS0片段的编码序列被分割导人细菌空载体 (4)利用噬菌体的包装特性进行筛选：入噬菌体的一个重要遗传特性就是其在包装时对入DNA大小有严格要求，只有当心NA的长度达到其野生型长度的75%～105％时，方能包装形成有活性的噬菌体颗粒，进而在培养基上生长时呈现清晰的噬斑，而不含外源DNA的单一噬菌体载体DNA因其长度太小而不能被包装成有活性的噬菌体颗粒，故不能感染细菌形成噬斑。根据此原理可初步筛出带有重组入噬菌体载体的克隆。2.序列特异性筛选根据序列特异性筛选的方法包括RE酶切法、PCR法、核酸杂交法、DNA测序法等。具体序列和可读框的正确性；针对未知DNA片段，可揭示其序列，为进一步研究提供依据。沁qi}436第五篇医学分子生物学专题.... ....－三三尸膜 依据硝酸纤维素膜上的阳性斑点，在琼脂平板上挑出对应的阳性菌落或噬斑3亲和筛选法亲和筛选法的前提是重组DNA进入宿主细胞后能够表达出其编码产物。常用的亲和筛选法的原理是基于抗原－抗体反应或配体－受体反应。一般做法与上述菌落或噬斑核酸原位杂交相似，只是被检测的靶分子换成吸附于硝酸纤维素膜上的蛋白质，检测探针换成标记的抗体／抗原或配体／受体。 （六）克隆基因的表达 采用重组DNA技术还可进行目的基因的表达，实现生命科学研究、医药或商业目的，这是基因工程的最终目标。基因表达涉及正确的基因转录、mRNA翻译、适当的转录后及翻译后的加工过程，这些过程对于不同的表达体系是不同的。克隆目的基因，进而大量地表达出有特殊意义的蛋白质，已成为重组DNA技术中一个专门的领域，这就是重组蛋白质表达。在蛋白质表达领域，表达体系的建立包括表达载体的构建、宿主细胞的建立及表达产物的分离、纯化等技术和策略。基因工程中的表达系统包括原核和真核表达体系。(2)重组蛋白质的表达策略：在实际工作中，蛋白质表达策略颇不一致。有时表达目的是为了获得蛋白质抗原，以便制备抗体，此时要求表达的蛋白质或多肤具有抗原性，同时要求表达产物易于分离、纯化。较好的策略是为目的基因连上一个编码标签肤的序列，从而表达为融合蛋白(fusion protein)。在有些情况下，表达的蛋白质多为不溶性的包含体(inclusion body)，极易与细菌蛋白质分离。如果在设计融合基因时，在目的基因和标签序列之间加入适当的裂解位点，则很容易从表达的融合分子中去除标签序列。巧妙地设计标签序列还可大大方便表达产物的分离纯化。如果表达的蛋白“4质是为了用千生物化学、细胞生物学研究或临床诊断或基因防治，除分离纯化方便，更重要的是考虑蛋白质的功能和生物学活性。此时，表达可溶性蛋白质往往具有特异的生物学功能；如果表达的是包含体形式，还需要在分离纯化后进行复性或折叠。2.真核表达体系真核表达体系除与原核表达体系有相似之处外，一般还常有自己的特点。真核表达载体通常含有供真核细胞用的选择标记、启动子、转录和翻译终止信号、mRNA的poly(A)加尾信号或染色体整合位点等。关于真核表达载体的基本组成见图23-12。真核表达体系有酵母、昆虫、哺乳类细胞等，不仅可以表达克隆的cDNA，也可表达从真核基因组DNA扩增的基因。哺乳类细胞表达的蛋白质通常总是被适当的修饰，而且表达的蛋白质会恰当地分布在细胞内一定区域并积累。因此，采用真核表达体系的优势是：CD具有转录后加工机制；＠具有翻译后修饰机制；＠表达的蛋白质不形成包含体（酵母除外）；＠表达的蛋白质不易被降解。当然，操作技术难、费时、费钱是其缺点。 第三节重组DNA技术在医学中的应用 目前，重组DNA技术已广泛应用于生命科学和医学研究、疾病诊断与防治、法医学鉴定、物种的修饰与改造等诸多领域，对医学临床及医学研究的影响日益增大。 一、重组DNA技术广泛应用于生物制药 利用重组DNA技术生产有应用价值的药物是当今医药发展的一个重要方向，有望成为21世纪的支柱产业之一。该技术一方面可用于改造传统的制药工业，如利用该基因可改造制药所需要的工程菌种或创建新的工程菌种，从而提高抗生素、维生素、氨基酸等药物的产量；另一方面利用该技术生产有药用价值的蛋白质／多肤及疫苗抗原等产品，重组人胰岛素是利用该技术生产的世界上第一个基因工程产品。目前上市的基因工程药物已百种以上，表23-4中仅列出部分药物和疫苗。产品名称主要功能组织纤溶酶原激活剂抗凝血，溶解血栓凝血因子Vlll/IX促进凝血，治疗血友病粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子刺激白细胞生成促红细胞生成素促进红细胞生成，治疗贫血多种生长因子刺激细胞生长于分化生长激素治疗侁儒症胰岛素治疗糖尿病多种白细胞介素调节免疫，调节造血肿瘤坏死因子杀伤肿瘤细胞，调节免疫，参与炎症骨形态形成蛋白修复骨缺损，促进骨折愈合人源化单克隆抗体利用其结合特异性进行临床诊断，肿瘤靶向治疗重组乙肝疫苗(HBsAg VLP)预防乙型肝炎重组HPV疫苗(L1VLP)预防HPV感染重组B亚单位霍乱菌苗口服预防霍乱注VLP：类病毒颗粒；HBsAg：乙肝病毒表面抗原；LI HPV：人乳头瘤病毒衣壳蛋白V`”,"438第五篇医学分子生物学专题利用重组DNA技术，可以让细菌、酵母等低等生物成为制药工厂，也使基因工程细菌成为各类生物基因的储藏所；可以将小鼠杂交瘤细胞人源化，让其产生人源化抗体；可以制造基因工程病毒，使病毒保留免疫原性，缺乏感染性或变成不含核酸的类病毒颗粒(virus-like pm廿cle, VLP)。 二、重组DNA技术是医学研究的重要技术平台 重组DNA技术可用于医学研究的很多方面，诸如遗传修饰动物模型的建立、遗传修饰细胞模型的建立、基因获得或丧失对生物功能的影响等。1.遗传修饰动物模型的医用研究重组DNA技术可用于遗传修饰动物模型的研制，从而建立人类疾病的动物模型。目前已经建立了诸多人类疾病的遗传修饰动物模型，用于研究癌症、糖尿病、肥胖、心脏病、老化、关节炎等；遗传修饰猪模型的应用，可望增加从猪到人器官移植(pig to human organ ti·ansplantation)的成功率；改造蚊子的基因组，使其产生对疤疾的免疫反应，可望消灭症疾。2遗传修饰细胞模型在医学研究中的应用重组DNA技术也可用千遗传修饰细胞模型的建立，从而用于基因替代治疗／靶向治疗，或体内示踪。体细胞基因治疗(somatic gene th erapy)已经在X连锁联合免疫缺陷病(X-linked SCID汃慢性淋巴细胞白血病(chronic lyrnphocytic leuke m团，CLL)和帕金森病进行了临床研究，这是在人体上进行遗传工程的研究。改造T淋巴细胞，让其携带嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor, CAR)，从而达到靶向治疗疾病的CAR-T细胞也是采用重组DNA技术实现的。例如，人T细胞经基因操作成为靶向CD19的CAR-T，用于治疗难治性慢性B淋巴瘤。将绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)与细胞内的某些蛋白相融合，可使细胞变成具有示踪作用的发光细胞。3.基因及基因功能的获得及丧失的研究基因工程生物或细胞模型可用来发现一些基因的新功能，或发现新基因，一般可通过基因的获得（如转基因）或丧失（如基因敲除）进行研究，也可通过示踪实验（如GFP融合蛋白）研究基因表达产物的定位或相互作用信息等，或通过报告基因（如GFP或催化特定底物的酶）与不同启动子相融合的方法实现对基因表达调控的研究。三、重组DNA技术是基因及其表达产物研究的技术基础重组DNA技术已经成为基因或基因功能获得或丧失研究的技术基础，也是基因表达产物相互作用研究的技术基础。1在基因组水平上干预基因重组DNA技术是基因打靶（包括基因敲除和基因敲入）及基因组编辑等的技术基础。例如，基因敲除(gene knock-out)，传统的方法是利用同源重组的原理，用目的基因替换基因组上的特定基因，要实现这一目标，需要将目的基因克隆到合适的载体上，并在其两侧加上待敲除基因上的部分序列，使重组DNA进入细胞后能通过同源重组替换基因组的目标基因。条件性基因打靶(conditional gene targeting)是在目的基因两侧构建了Cre重组酶的切割位点。基因组编辑(genome edi ting)是指一类能定向地在基因组上改变基因序列的技术，其中CRISPR/C as9系统是目前应用最多的、脱靶最少的基因组编辑技术，也是细菌抵抗病毒感染的一种获得性免疫机制。利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术对特定基因进行改造，也需要在体外构建含导向crRNA(gu ide crRNA, gcrRNA)和Cas9编码基因的重组载体，然后将这种重组载体导入受体细胞，才能实现在基因组水平定向地改变特定基因的目的。2.在RNA水平上干预基因的功能RNA干扰(RNA interference, RNAi)是通过干扰小RNA(s mall interference RNA, siRNA)与靶RNA结合，从而阻止基因表达的方法。siRNA可以直接采用化学法合成，也可以利用DNA克隆技术构建干扰小发夹RNA，即将编码siRNA反向互补序列和间隔序列(l i nker)克隆入合适的载体，在细胞内转录合成干扰小发夹RNA，实现RNA干扰目的。3研究蛋白质的相互作用重组DNA技术也是蛋白质相互作用研究的技术基础。例如，酵母.1,L双杂交系统(yeas t two-hybrid system)是利用分别克隆转录因子DNA结合结构域(DNA bindingdomain, DBD)和转录激活结构域(transcription activating domain, TAD)的融合基因，对DBD－融合蛋白和TAD融合蛋白的融合部分的潜在相互作用能力进行研究。DNA重组是指DNA分子内或分子间发生的遗传信息的重新共价组合过程，包括同原重组、位点特异性重组和转座重组等类型，广泛存在于各类生物。自然界DNA重组方式主要有同原重组、位点特异性重组和转座重组。此外，原核生物还可以接合、转化和转导等作为基因转移的方式。噬菌体在感染细菌后在宿主基因组上留下短序列，从而组成CRISPR(clustered regularly interspaced short pal皿dromic repeats)序列簇，成为细菌防御病毒感朵的重要荻得性免疫机制。重组DNA技术是指通过体外操作将不同来源的两个或两个以上DNA分子重新组合，并在适当细胞中扩增形成新的功能DNA分子的方法。基本操作包括五步：心荻取目的DNA;＠选择和准备栽体；＠目的DNA与载体连接；＠重组DNA导入受体细胞；＠重组体的筛选、鉴定及克隆化。依据载体的不同，重组的目的基因可在原核或真核细胞中表达。限制性核酸内切酶、DNA连接酶等是重组DNA技术常用的重要工具酶。拟克隆的基因称为目的基因。荻取目的基因的方法包括化学合成、从基因组文库或cDNA文库钓取或PCR扩增等。载体是指能携带目的基因在受体细胞中复制或表达的DNA分子，可分为克隆载体和表达载体。克隆载体应至少具备复制位点、供目的基因插入的单一酶切位点或多克隆酶切位点和筛选标志，表达载体除了具备克隆栽体的一般特征外，还应具备供目的基因在受体细胞中表达的转录单位及必要元件，如真核表达载体的poly(A)加尾信号。筛选和鉴定重组体的方法主要有遗传标志筛选法、序列特异性筛选法、亲和筛选法等。表达目的基因的体系包括原核表达体系和真核表达体系，两者各具优势和不足。常用的原核表达体系是大肠埃希菌表达体系，操作简便，但缺乏对基因表达产物的加工修饰；常用的真核表达体系有酵母表达体系、昆虫表达体系和哺乳细胞表达体系。重组DNA技术已经成为基因工程制药的重要技术平台，包括重组蛋白质、重组多肤、重组病毒或类病毒颗粒、人原化单克隆抗体等多种药物都是采用重组DNA技术完成的；重组DNA技术也是医学研究的重要平台技术，遗传修饰的各种模式生物已经成为人类疾病研究的重要模型；重组DNA技术也是基因及其功能研究的技术基础，包括基因打靶、基因组编辑、RNA干扰及蛋白质相互作用等的技术都是以重组DNA技术为基础的。1.自然界DNA重组无论采用哪种方式，都涉及DNA链的断裂和再连接。从DNA分子的角度思考，链断裂和再连接与DNA分子哪个化学键有关？这个化学键的解离和形成为什么需要酶的参与？2.设想一下，生物体基因组DNA自发地频繁发生重组，无论是同源重组、位点特异性重组或转座重组，会对生物体产生哪些潜在的影响？3.生物体基因组可以摄取外源DNA留作已用（如细菌的CRISPR阵列），并进化成为自身的防御机制。请思考一下，细菌利用CRISPR/Cas系统作为荻得性免疫机制，人等哺乳动物是否也需要类似的机制，为什么？4.重组DNA技术为操作DNA提供了技术平台，针对人基因组中的一个基因序列，如何能成功地用大肠埃希菌表达系统将其编码产物表达出来？（需要考虑原核表达体系的特点、真核基因的结构特点、构建重组DNA的优化方式等。） （王丽颖）第二十四章常用分子生物学技术的原理及其应用 分子生物学理论研究的突破无一不与分子生物学技术的产生和发展息息相关，可以说两者是科学与技术相互促进的最好例证，即理论上的发现为新技术的产生提供思路，而新技术的产生又为证实原有理论和发展新理论提供有力工具。因此，了解分子生物学技术原理及其用途，对于加深理解现代分子生物学的基本理论和研究现状、深入认识疾病的发生和发展机制、理解和应用新的基于分子生物学而发展起来的诊断治疗策略和药物具有极为重要的意义。为此本章概括介绍目前分子生物学中的一些常用技术及其在医学上的应用。 第一节分子杂交和印迹技术 分子杂交技术利用DNA变性与复性这一基本理化性质，结合印迹技术和探针技术，可进行DNA和RNA的定性或定量分析。 —、分子杂交和印迹技术的原理 分子杂交的概念在第二章已有详细描述，这里仅介绍印迹和探针技术。 （一）印迹技术 1975年，E. Southern将经琼脂糖电泳分离的DNA片段在胶中变性使其成为单链，然后将硝酸纤维素(nitrocellulose, NC)膜平铺在胶上，膜上放置一定厚度的吸水纸巾，利用毛细作用使胶中的DNA分子转移到NC膜上，使之固相化已。将载有DNA单链分子的NC膜放在核酸杂交反应溶液中，溶液中具有互补序列的DNA或RNA单链分子就可以结合到存在于NC膜上的DNA分子上。这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此称之为“blotting"，译为印迹技术。目前这种技术已广泛用于DNA、RNA和蛋白质的检测。除靠毛细作用将DNA转移至NC膜外，后来又建立了电转移印迹技术和真空吸引转移印迹技术。这些新的方法缩短了转移所需的时间。另外亦有一些新的材料用千转移膜制备而改善待测分子的转移效率和样品承载能力。 （二）探针技术 探针(probe)指的是带有放射性核素、生物素或荧光物质等可检测标志物的核酸片段，它具有特定的序列，能够与待测的核酸片段依据碱基互补原理结合，因此可以用于检测核酸样品中存在的特定核酸分子。核酸探针既可以是人工合成的寡核昔酸片段，也可以是基因组DNA片段、cDNA全长或片段，还可以是RNA片段。在NC膜杂交反应中，标记探针的序列如果与NC膜上的核酸存在碱基序列互补，就可以结合到膜上的相应DNA或RNA区带，经放射自显影或其他检测手段就可以判定膜上是否有互补序列的核酸分子存在。 二、印迹技术的类别及应用 印迹技术可以分为DNA印迹、RNA印迹和蛋白质印迹三大类。它们的基本流程如图24-1所示。 第二十四章常用分子生物学技术的原理及其应用芦盓笃／RNA样品／岁蛋白质样品／ 转移到NC膜后与转移到NC膜或尼龙膜转移到NC膜或PVDF标记探针杂交后与标记探针杂交膜后与抗体反应DNA印迹(DNA blotting)为E. Southern首次应用，因而命名为Southern blotting。DNA样品经限制性内切酶消化后行琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，将含有不同大小DNA片段的凝胶在变性溶液中处理，然后将胶中的变性DNA分子转移到NC膜上，转移完成后，将含DNA片段的NC膜在80°C真空条件下加热或在紫外交联仪内处理，使DNA固定于NC膜上，即可用于杂交反应已。DNA印迹技术主要用千基因组DNA的定性和定量分析，例如对基因组中特异基因的定位及检测、基因组中转基因和基因剔除的分析，此外亦可用千分析重组构建的质粒和噬菌体。 （二）RNA印迹 利用与DNA印迹相类似的技术来分析RNA就称为RNA印迹(RNA blotting)。相对于Southern blotting，有人将RNA印迹称为Northern blotting，其技术原理与Southern blotting相同卤。RNA分子较小，在转移前无需进行限制性内切酶切割，而且变性RNA的转移效率也比较高。RNA印迹技术目前主要用于检测特定组织或细胞中已知的特异mRNA和非编码RNA的表达水平，也可以比较不同组织和细胞中的同一基因的表达情况。尽管用RNA印迹技术检测RNA的敏感性较PCR法（见本章第二节）低，但是由于其特异性强，假阳性率低，仍然被认为是最可靠的mRNA和非编码RNA定量分析方法之一。（三）蛋白质印迹印迹技术不仅可用于核酸的分子杂交，而且也可用于蛋白质的分析。人们发现蛋白质在电泳之后也可以从胶中转移并固定到膜型材料上，再依靠与溶液中相应的蛋白质分子相互结合来进行定性定量分析，其中最常用的是用抗体来检测，因此亦被称为免疫印迹(immunoblotting)。相对应于DNA的Southern blotting和RNA的Northern blotting，蛋白质印迹被称为Western blotting。包蛋白质印迹需先将混合蛋白质用聚丙烯酰胺凝胶电泳按分子大小分开，再将蛋白质转移到NC膜或其他膜上包。蛋白质的转移只有靠电转移方可实现。蛋白质的分析主要靠抗体来进行。特异性抗体（称为第一抗体）首先与转移膜上相应的蛋白质分子结合，然后用碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶标记或放射性核素标记的第二抗体与之结合。反应之后用底物显色或放射自显影来检测蛋白质区带的信号，底物亦可与化学发光剂相结合以提高敏感度。蛋白质印迹技术用千检测样品中特异性蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。除上述三种基本印迹技术外，还有一些方法可用千核酸和蛋白质的分析。例如，可以不经电泳分离而直接将样品点在NC膜上用于核酸杂交分析，这种方式被称为斑点印迹(dot blotting)；组织切片或细胞涂片可以直接用于杂交分析，称为原位杂交(msituhybr心zatIOn, ISH心；可以将多种已知序列442第五篇医学分子生物学专题的DNA排列在一定大小的尼龙膜或其他支持物上用千检测细胞或组织样品中的核酸种类，这种技术称为DNA芯片技术包（见本章第五节）。 第二节PCR技术的原理与应用 20世纪70年代末，随着DNA重组技术的产生和发展，如何快速获得目的基因（待检测或待研究的特定基因）片段已经成为瓶颈问题。1983年K. Mullis发明了聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)技术。该技术可将微量DNA片段大量扩增，使微量DNA或RNA的操作变得简单易行。PCR技术的高敏感、高特异、高产率、可重复、快速简便等优点使其迅速成为分子生物学研究中应用最为广泛的方法，许多以往无法解决的分子生物学研究难题得以解决。PCR技术的发明是分子生物学的一项革命，极大地推动了分子生物学以及生物技术产业的发展，成为分子生物学与医学的支撑技术。近年来，PCR技术不断改进，从手工操作发展到自动化仪器，从定性分析发展到定量测定。该方法与其他分子生物学技术相结合，其用途日益广泛。新的PCR技术类型层出不穷。 —、PCR技术的工作原理 PCR的基本工作原理是在体外模拟体内DNA复制的过程。以待扩增的DNA分子为模板，用两条寡核昔酸片段作为引物，分别在拟扩增片段的DNA两侧与模板DNA链互补结合，提供3'-0H末端；在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成两条新链的合成。不断重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增（图24-2)（动画24-1"PCR原理及实验步骤示意”)。PCR反应的特异性依赖于与模板DNA两端互补的寡核昔酸引物。组成PCR反应体系的基本成分包括模板DNA、特异引物、耐热性DNA聚合酶（如Taq DNA聚合酶）、dNTP以及含有M忙的缓冲液。 ＝三一3'5'了，r．飞屯王子．立．五．···寸，，一DNA模板变性5'-心~_＿＿ 3'-＿亡石可可芯霄霖＝一5'3'一芷．．．．平哼5'5'－磁磁部讼础磁姬磁吵磁珈．？．，一3'5，一＇，令吟．充盒激磁芍兹松呻怼恋恋妘····—3'正向引物Taqpol I5'-让三罕丑:a:ct-3'5'-·涨巡恋伽x妞悴咖怼磁磁敛纵王．一一I3'Taqpol汇［说书”·5'µllll入卞七」心九岁心严，从斗，，，唱进人第二轮循环'，王．中研叫吟＼甲几小L心也数十次反应步骤的循环产生大蜇短片段DNA终产物图24-2PCR技术原理示意图PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。在第一轮反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物附上模板的3'－端，即新生链的5'－端是固定的，其3仁端则没有固定的止点，产生“长产物片段＂。进入第二轮循环，新延伸片段的起点和终点都限定于引物扩增序列以内，形成长短一致的＂短产物片段＂。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5'－端之间，是需要扩增的特定片段。＂短产物片段”按指数倍数增加，而“长产PCR的基本反应步骤包括：心变性：将反应体系加热至95°C，使模板DNA完全变性成为单链，同时引物自身以及引物之间存在的局部双链也得以消除；＠退火：将温度下降至适宜温度（一般较兀低汽）使引物与模板DNA结合；＠延伸：将温度升至72°C,DNA聚合酶以dNTP为底物催化DNA的合成反应。上述3个步骤称为1个循环，新合成的DNA分子继续作为下一轮合成的模板，经多次循环(25~30次）后即可达到扩增DNA片段的目的。


生物化学与分子生物学 ＝三一3'5'了，r．飞屯王子．立．五．···寸，，一DNA模板变性5'-心~_＿＿  二、PCR技术的主要用途(—)获得目的基因片段 PCR技术为在重组DNA过程中获得目的基因片段提供了简便快速的方法。在人类基因组计划完成之前，PCR是从cDNA文库或基因组文库中获得序列相似的新基因片段或新基因的主要方法。目前，该技术是从各种生物标本或基因工程载体中快速获得已知序列目的基因片段的主要方法。 （二）DNA和RNA的微量分析 PCR技术敏感性高，对模板DNA的量要求很低，是DNA和RNA微量定性和定量分析的最好方法。理论上讲，只要存在1分子的模板，就可以获得目的片段。实际工作中，1滴血液、1根毛发或1个细胞已足以满足PCR的检测需要，因此在基因诊断方面具有极广阔的应用前景。 （三）DNA序列分析 将PCR技术引入DNA序列测定，使测序工作大为简化，也提高了测序的速度，是实现高通量DNA序列分析的基础（见本章第三节）。待测DNA片段既可克隆到特定的载体后进行序列测定，也可直接测定。


生物化学与分子生物学 （四）基因突变分析 PCR与其他技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性，例如单链构象多态性分析、等位基因特异的寡核昔酸探针分析、基因芯片技术、DNA序列分析等。（五）基因的体外突变在PCR技术建立以前，在体外对基因进行各种突变是一项费时费力的工作。现在，利用PCR技术可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行插入、嵌和、缺失、点突变等改造。


生物化学与分子生物学 三、几种重要的PCR衍生技术 PCR技术自身的发展及其与已有分子生物学技术的结合形成了多种PCR衍生技术，提高了PCR反应的特异性和应用的广泛性。本章仅举例介绍部分与医学研究密切相关的PCR衍生技术。（一）逆转录PCR技术逆转录PCR(reverse transcription PCR, RT-PCR)是将RNA的逆转录反应和PCR反应联合应用的一种技术。首先以RNA为模板，在逆转录酶的作用下合成cDNA，再以cDNA为模板通过PCR反应来扩增目的基因。RT-PCR可检测到单个细胞中少于10个拷贝的特异的RNA，是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的RNA进行定性和半定量分析的最有效方法，也是最广泛使用的PCR方法。国原位PCR(in situ PCR)是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的基因片段。PCR反应在甲酸溶液（福尔马林）固定、石蜡包埋的组织切片或细胞涂片上的单个细胞内进行。PCR反应后，再用特异性探针进行原位杂交，即可检出待测DNA或RNA是否在该组织或细胞中存在。由于常规PCR或RT-PCR技术的产物不能在组织细胞中直接定位，因而不能与特定的组织细胞特征表型相联系，而原位杂交技术虽有良好的定位效果，但灵敏度不高。原位PCR方法弥补了PCR技术和原位杂交技术的不足，将目的基因的扩增与定位相结合，既能分辩鉴定带有靶序列的细胞，又能标出靶序列在细胞内的位置，在分子和细胞水平上研究疾病的发病机制和临床过程有重大的实用价值。＼，环i}444第五筒医学分子生物学专题常规PCR反应是在反应终点检测产物含量，然而在反应过程中产物是以指数形式增加的，多次循环反应后的产物堆积将影响对原有模板含量差异的准确判断，故常规PCR反应只能作为半定量手段。实时PCR(real-time PCR)技术通过动态监测反应过程中的产物量，消除了产物堆积对定量分析的干扰，亦被称为定量PCR(quantitative PCR, qPCR)。定量PCR技术实现了mRNA、miRNA及其他非编码的RNA快速而准确的定量分析，已在临床应用于基因诊断。


生物化学与分子生物学 三、几种重要的PCR衍生技术 1.实时PCR的基本技术原理实时PCR的基本原理是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，故也被称为实时荧光定量PCR或荧光定量PCR。实时定量PCR需要采用专用PCR仪，自动在每个循环的特定阶段对反应体系的荧光强度进行采集，实时记录荧光强度的改变，可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线。由于反应起始的模板DNA量与循环过程的指数期的扩增产物量之间存在着定量关系，利用荧光信号的实时监测和计算，可以准确地确定起始DNA拷贝数，从而对样品的浓度进行精确定量。2.实时PCR技术的分类荧光标记是实现PCR反应实时定量的化学基础。实时荧光定量PCR的化学原理包括引物探针类和非引物探针类两种。非引物探针类是利用非特异性的插入双链DNA的荧光染料来指示扩增的增加，引物探针类则是利用可与靶DNA序列特异杂交结合的引物，标记荧光报告基团作为探针，来指示扩增产物的增加。


生物化学与分子生物学 三、几种重要的PCR衍生技术 (1)非引物探针类实时PCR：非引物探针类实时PCR加入的是能与双链DNA结合的荧光染料，由此来实现对PCR过程中产物量的全程监测，并不使用荧光来标记引物。最常用的是能结合到DNA双螺旋小沟区域的荧光染料SYER Green。该染料处千游离状态时，荧光信号强度较低，一旦与双链DNA结合之后，荧光信号强度大大增强（约为游离状态的1000倍）。荧光信号的强度与反应体系中的双链DNA（代表合成产物）的量成正比（图24-3)。因此，该荧光染料可用来实时监测PCR产物量的多少。由于非探针类实时PCR成本低廉，简便易行，近年来得到很快的发展，技术日趋完善，从而在基因表达的定量分析方面广泛应用。 (1)退火反应液中游离的SYBRGreen染料分子引物 (2)DNA链延伸，SYER Green结合到新合成的DNA双链上


生物化学与分子生物学 (3)合成完毕，更多的SYBRGreen结合到DNA双链上5'引物31|1｝111叫｝11d飞飞日厂 SYBRGreen只可以结合在双链DNA上，结合后产生荧光。荧光信号强度与产物最正相关。在PCR反应过程中，实时测定荧光强度即可得知产物撒，并据此计算出样本中的初始模板含量(2)引物探针类实时PCR：与非引物探针类实时PCR相比，引物探针类实时PCR是通过使用荧光标记的引物为探针来产生荧光信号。探针除了能产生荧光信号用于监测PCR进程之外，还能和模板DNA待扩增区域结合，因此提高了PCR的特异性。目前，常用的探针类实时PCR包括TaqMan探针法、分子信标(molecular beacons)探针法包和荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)探针法包等。荧光探针由千增加了探针的互补识别步骤，特异性更高，且可采用多色荧光探针，可在一个反应中实现对数种不同基因表达水平的同时检测。


生物化学与分子生物学 (3)合成完毕，更多的SYBRGreen结合到DNA双链上5'引物31|1｝111叫｝11d飞飞日厂 3实时PCR的应用实时定量PCR技术具有定量、特异、灵敏和快速等特点，是目前检测目的核酸拷贝数的可靠方法，是DNA定量技术的一次飞跃。目前实时荧光PCR技术已经被广泛应用于基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域。这些应用将改变以往对疾病的表型认识和表型诊断，而是从本质上认识疾病和诊断疾病。(1)实时PCR在肿瘤领域的应用：实时定量PCR不但能有效地检测基因的突变、重排、易位等，而且能准确检测癌基因表达量，可用于肿瘤早期诊断、鉴别、分型、分期、治疗及预后评估。实时荧光定量PCR可运用特异性荧光探针检测基因突变。可设计跨越疑似突变位点的荧光探针，进行基因扩增，然后对扩增产物进行缓慢加热获得熔解曲线，根据熔解曲线特征判断有无突变。也可使用双色标记探针进行突变检测，一个检测野生型，另一个标记的探针检测突变体。


生物化学与分子生物学 第三节DNA测序技术 DNA测序(DNA sequencing)的目的是确定一段DNA分子中4种碱基(A、G、C、T)的排列顺序。DNA测序技术是阐明和理解基因结构、基因功能、基因变异、基因表达调控的基础，也是实现在分子层次预测、预防、诊断和治疗疾病的个体化医学的最重要的支撑技术。分子生物学发展的初期，采用部分酶解等方法仅能测定RNA的序列，且费时费力。1977年，MaxamAM和Gilbert W合作创立了化学降解法，又称Maxam-Gilbert测序法；同年，Sanger F创建了双脱氧测序法或称Sanger法。这两种方法的建立实现了DNA测序技术的第一次飞跃，三位科学家也因此分享了1980年的诺贝尔化学奖。40余年来，DNA测序技术发展迅速，从手工操作到自动化仪器分析、从单一短片段到高通量平行分析，尤其是在人类基因组计划的推进和带动下，已经实现了高速和低价的目标，人全基因组30亿碱基对的测序目前已经成为常规技术。快速测序技术极大推动了生物学和医学多个领域的理论突破和应用研究。


生物化学与分子生物学 一、双脱氧法和化学降解法是经典DNA测序方法 早期的DNA测序只能在实验室内手工完成，故基本上是用于分子生物学研究工作，采用的是双446第五篇医学分子生物学专题Sanger双脱氧测序(dideoxy sequencing)法亦称为链终止(chain-termination method)法，基于对引物的延伸合成反应。如图24-4所示，用DNA聚合酶来延伸结合在待测序列DNA模板上的寡脱氧核昔酸引物，直到在新合成的DNA链的31习末端掺入了4种放射性核素标记的2',3'－双脱氧核昔三磷酸(ddNTP)底物的其中一种。由千ddNTP脱氧核糖的3'－位碳原子上缺少胫基而不能与下一位核昔酸的5'－位磷酸基之间形成3',5'－磷酸二酷键，从而使得正在延伸的DNA链在该ddNTP处终止。因此，在4种不同反应体系中分别加入4种不同的ddNTP底物(A、G、C、T)，就可得到终止于相应特定碱基的一系列不同长度DNA片段。


生物化学与分子生物学 一、双脱氧法和化学降解法是经典DNA测序方法 这些片段具有共同的起点（即引物的5'－末端），而有不同的终点（即ddNTP掺入的位置），其长度取决千ddNTP掺入的位置与引物5'－末端之间的距离。经可分辨1个核昔酸差别的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离这些片段，再借助片段的放射性核素或荧光标记，即可读出一段DNA序列。（动画24-2"DNA序列测定原理”)I I I l l I I I I I I I I I I I l l I I I I I I I I I I l I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I双链DNA片段ACGTAAATCGATACGTAATddATP l I I I.I I I l l I I I I I I I I I I I I I l单链模板DMA ddATP I I I I I I I I l I I. ACGTAAATCGATACGTAATddATPI.


生物化学与分子生物学 一、双脱氧法和化学降解法是经典DNA测序方法 CATTA标记引物A}电泳T_DNA聚合酶CH20碱基(A.C.G.T)E·1jl（二）化学降解法DNA测序技术Maxam-Gilbert化学降解测序(chemical degradation sequencing)法则首先对待测序的DNA片段的末端进行放射性核素标记，然后用专一性化学试剂将该片段DNA进行特异性降解，从而产生4套含有长短不－DNA片段的混合物，再通过其所带的标记读出序列。这一方法的建立在分子生物学发展早期发挥了重要作用，但因其费用高且难以实现自动化而被其他方法取代。二、第—代全自动激光荧光DNA测序仪器基千双脱氧法Sanger方法和Maxam-Gilbert化学降解法的手工操作对技术人员的经验和技术熟练程度要求很高，实验失败概率高，难以在普通实验室推广普及，更难以满足分子生物学的迅速发展及其在医学等领域应用的需求，因而催生了自动化分析仪己的发明。


生物化学与分子生物学 一、双脱氧法和化学降解法是经典DNA测序方法 早期的全自动DNA序列分析仪的工作原理主要是基于Sanger法，采用四色荧光标记ddNTP而制作的。目前，自动激光荧光DNA测序仪（又称第一代测序仪）的应用巳十分普遍，它可实现制胶、进样、电泳、检测、数据分析全自动化。第一代测序技术的读长可以超过lOOObp，原始数据的准确率可高达99,999%。在四色荧光法分析中，采用4种不同荧光染料标记4种不同的可终止DNA延伸反应的底物ddNTP，经Sanger法反应后，赋予所合成的DNA片段4种不同的颜色。待测DNA样品的4个反应产物在同一个泳道内依照片段大小电泳分离，由仪器自动连续采集荧光数据并完成分析，最后直接显示待测DNA的碱基序列。人类基因组计划的第一个人类基因组草图的绘制采用的就是Sanger法。美国、英国、日本、法国、德国、加拿大、中国等7个国家的科学家合作，用了众多自动激光荧光DNA测序仪，以集成式工厂化运行模式而完成的。


生物化学与分子生物学 三、高通星DNA测序技术使基因测序走向医学实用 要将人类基因组序列分析的研究成果用于各种复杂疾病的机制研究、诊断、预警、治疗监测以及法医学鉴定等医学实践，需要对入群及个体进行全基因组序列分析。为此必须首先实现DNA测序技术的微量、快速和低成本化，而标准的Sanger法及第一代测序仪的高成本很难满足这一需求，新的高通量DNA测序技术及其分析仪器因此应运而生。这些新技术被冠以新一代测序(next generation sequencing, N GS)之称，并先后有第二代、第三代甚至第四代之分，其共同特点都是实现了微量化、高通量并行化和低成本。所有的NGS都是在一次反应中同时分析多个DNA小片段，因而可快速获得所有序列，再经生物信息学整合分析，得出个体的基因组序列。在超高通量测序时，甚至可并行百万个测序反应。需要指出的是，每一种新的高通量测序技术都是伴随相应的新仪器而诞生的，否则无法进入生物学和医学领域。


生物化学与分子生物学 三、高通星DNA测序技术使基因测序走向医学实用 一些NGS技术需要首先进行待测DNA片段的PCR扩增。这些技术和仪器主要包括：g凶54基因组测序仪利用焦磷酸测序，检测DNA合成产生的焦磷酸。综合运用了乳液PCR、微流控芯片、焦磷酸检测等技术。®Solexa/Illumina测序仪检测DNA合成反应中掺入的荧光标记单核昔酸，利用桥式PCR、微流控芯片、荧光标记基团和终止基团检测等技术。＠SOLiD测序仪基于寡核昔酸连接反应，利用乳液PCR、微流控芯片，检测DNA连接酶催化的荧光标记寡核昔酸探针连接到DNA链过程中释放出的光学信号。更新一代的测序技术则无需PCR扩增反应，直接针对DNA单分子进行序列分析，亦称为第三代测序技术。这些技术包括HeliScope测序技术、单分子实时技术(single molecule real time technology, SMRT)以及基于荧光共振能量转移(FRET)的测序技术等区。


生物化学与分子生物学 三、高通星DNA测序技术使基因测序走向医学实用 高通量DNA测序技术的快速进步极大促进了人全基因组测序(whole genome sequencing, WGS)、转录组测序(RNA-seq)、全外显子测序(Exome-seq)、DNA－蛋白质相互作用，即染色质免疫共沉淀测序(ChIP-seq)、病原微生物全基因组测序等在医学研究和实践中的应用（见第二十七章），为医学进入大数据时代提供了核心技术支撑。


生物化学与分子生物学 四、DNA测序在医学领域具有广泛应用价值 DNA测序技术在医学领域的使用日益广泛和深入。DNA测序在医学研究和临床实践中的主要用途是：心通过人群大样本分析，确定单基因遗传病和多基因变异相关疾病的SNP位点、基因结构变异、基因拷贝数变异等，鉴定出可用于复杂性疾病易感性预警或早期诊断的疾病标志物，并将这些单一基因或多个基因的变异检测用千临床诊断。这些变异的发现还将指导治疗靶点的确认和药物研发；＠检测肿瘤组织的染色体畸变癌基因和抑癌基因突变位点、融合基因、染色体拷贝数变化等，为肿瘤分子分型和治疗敏感性监测提供依据；＠进行个人基因组分析，在大数据平台发展的基础上，建，，飞i}448第五篇医学分子生物学专题立个人SNP位点与疾病易感性、药物敏感性和耐受性以及其他诸多表型之间的联系；＠用于病原微生物检测，确定病原微生物的分子分型，为抗病毒或细菌感染治疗提供依据。DNA测序在法医学领域具有特殊意义。该技术极大提高了DNA鉴定的敏感性和准确性，在各类案件中作为司法证据的重要性越加凸显。DNA测序在亲子鉴定中亦具有重要价值。


生物化学与分子生物学 第四节生物芯片技术 生物芯片技术是在20世纪末发展起来的一项新的规模化生物分子分析技术，目前已被应用千生命科学的众多领域。这些应用包括基因表达检测、基因突变检测、基因诊断、功能基因组研究、基因组作图等多个方面。 基因芯片—、基因芯片 基因芯片(gene chip)是指将许多特定的DNA片段有规律地紧密排列固定于单位面积的支待物上，然后与待测的荧光标记样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等对芯片进行扫描，通过计算机系统对每一位点的荧光信号作出检测、比较和分析，从而迅速得出定性和定量的结果。该技术亦被称作DNA微阵列(DNA microarray)。基因芯片可在同一时间内分析大量的基因，高密度基因芯片可以在lcm2面积内排列数万个基因用于分析，实现了基因信息的大规模检测。


生物化学与分子生物学 基因芯片—、基因芯片 基因芯片特别适用于分析不同组织细胞或同一细胞不同状态下的基因差异表达情况，其原理是基于双色荧光探针杂交。该系统将两个不同来源样品的mRNA逆转录合成cDNA时用不同的荧光分子（如正常用红色、肿瘤用绿色）进行标记（图24-5)，标记的cDNA等量混合后与基因芯片进行杂交，在两组不同的激发光下检测，获得两个不同样品在芯片上的全部杂交信号。呈现绿色荧光的位点代表该基因只在肿瘤组织表达，呈现红色信号的位点代表该基因只在正常组织表达，呈现两种荧光互补色一—黄色的位点则表明该基因在两种组织中均有表达。 正常细胞的mRNA肿瘤细胞的mRNA-尸已／荧光标记立＼＾一/-＼＾~ 红色荧光{Cy3浙而已的cDNA片段绿色荧光{Cy5浙面记的cDNA片段---等批混合•••o••.0


生物化学与分子生物学 ！激光扫描Cy5图像（绿色）重叠图像（黄色）Cy3图像（红色）计算机读取 图24-5基因芯片工作流程示意图不同标本（如正常组织和肿瘤组织）抽提的RNA经RT-PCR后分别以不同的荧光染料标记，等量混合后在芯片上进行杂交，最后进行扫描和读片。右下为双色荧光重叠图像，绿色荧光者表示正常组织高表？记达，而红色荧光者表示肿瘤组织高表达蛋白质芯片(protein chip)是将高度密集排列的蛋白质分子作为探针点阵固定在固相支待物上，当与待测蛋白质样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白质，再经检测系统对靶蛋白质进行定性和定量分析的一种技术。蛋白质芯片的基本原理是蛋白质分子间的亲和反应，例如抗原－抗体或受体－配体之间的特异性结合。最常用的蛋白质探针是抗体。在用蛋白质芯片检测时，首先要将样品中的蛋白质标记上荧光分子，经过标记的蛋白质一旦结合到芯片上就会产生特定的信号，通过激光扫描系统来检测信号。蛋白质芯片技术具有快速和高通量等特点，它可以对整个基因组水平的上千种蛋白质同时进行分析，是蛋白质组学研究的重要手段之一，已广泛应用于蛋白质表达谱、蛋白质功能、蛋白质间的相互作用的研究。在临床疾病的诊断和新药开发的筛选上也有很大的应用潜力。


生物化学与分子生物学 第五节蛋白质的分离、纯化与结构分析 蛋白质是生物大分子，具有胶体性质、沉淀、变性和凝固等特点。人体的细胞和体液中存在成千上万种蛋白质，要分析其中某种蛋白质的结构和功能，需要从混合物分离纯化出单一蛋白质。蛋白质分离通常是利用其特殊理化性质，采取盐析、透析、电泳、层析及超速离心等不损伤蛋白质空间构象的物理方法，以满足研究蛋白质结构与功能的需要。 一、蛋白质沉淀用于蛋白质浓缩及分离 蛋白质在溶液中一般含量较低，需要经沉淀浓缩，以利进一步分离纯化。1.有机溶剂沉淀蛋白质丙酮、乙醇等有机溶剂可以使蛋白质沉淀，再将其溶解在小体积溶剂中即可获得浓缩的蛋白质溶液。为保持蛋白质的结构和生物活性，需要在0~4"C低温下进行丙酮或乙醇沉淀，沉淀后应立即分离，否则蛋白质会发生变性。


生物化学与分子生物学 一、蛋白质沉淀用于蛋白质浓缩及分离 2.盐析分离蛋白质盐析(salt precipitation)是将硫酸按、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质在水溶液中的稳定性因素去除而沉淀。各种蛋白质盐析时所需的盐浓度及pH均不同，可据此将不同的蛋白质予以分离。例如血清中的清蛋白和球蛋白，前者可溶于pH7.0左右的半饱和硫酸按溶液中，而后者在此溶液中则发生沉淀。当硫酸按溶液达到饱和时，清蛋白也随之析出。所以盐析法可将蛋白质初步分离，但欲得纯品，尚需用其他方法。许多蛋白质经纯化后，在盐溶液中长期放置逐渐析出，成为整齐的结晶。3.免疫沉淀分离蛋白质蛋白质具有抗原性，将某种纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白质的特异抗体。利用特异抗体识别相应抗原并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。这就是可用于特定蛋白质定性和定量分析的免疫沉淀法。在具体实验中，常将抗体交联至固相化的琼脂糖珠上，易千获得抗原抗体复合物。进一步将抗原抗体复合物溶于含十二烧基硫酸钠和二琉基丙醇的缓冲液后加热，使抗原从抗原抗体复合物分离而得以纯化，并用于分析。


生物化学与分子生物学 一、蛋白质沉淀用于蛋白质浓缩及分离 二、透析和超滤法去除蛋白质溶液中的小分子化合物利用透析袋将大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法称为透析(dialysis)已。透析袋是用具有超小微孔的膜，如硝酸纤维素膜制成，一般只允许分子量为lOkD以下的化合物通过。将蛋白质溶液装在透析袋内置千水中，硫酸按氯化钠等小分子物质可透过薄膜进入水溶液，由此可对盐析浓缩后的蛋白质溶液进行除盐。如果透析袋外放放置吸水剂如聚乙二醇，则袋内水分伴同小分子物质透出袋外，高分子量的蛋白质留在袋内，可达到浓缩目的。同样，应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的，称为超滤法闷。此法简便且回收率高，是常用的浓缩蛋白质溶液方法。


生物化学与分子生物学 三、电泳分离蛋白质 蛋白质在高于或低于其pI的溶液中成为带电颗粒，在电场中能向正极或负极方向移动。这种通\IITF,450第五篇医学分子生物学专题过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术称为电泳(electrophoresis)。根据支撑物的不同有纤维薄膜电泳、凝胶电泳等。薄膜电泳是将蛋白质溶液点样于薄膜上，薄膜两端分别加正、负电极，此时带正电荷的蛋白质向负极泳动；带负电荷的蛋白质向正极泳动；带电多，分子量小的蛋白质泳动速率快；带电少，分子量大的则泳动慢，千是蛋白质被分离。凝胶电泳的支撑物为琼脂糖、淀粉或聚丙烯酰胺凝胶。凝胶置千玻璃板上或玻璃管中，凝胶两端分别加上正、负电极，蛋白质混合液即在凝胶中泳动。电泳结束后，用蛋白质显色剂显色，即可看到多条巳被分离的蛋白质色带。


生物化学与分子生物学 三、电泳分离蛋白质 1SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质若蛋白质样品和聚丙烯酰胺凝胶系统中加入带负电荷较多的十二烧基硫酸钠(SDS)，使所有蛋白质颗粒表面疫盖一层SDS分子，导致蛋白质分子间的电荷差异消失，此时蛋白质在电场中的泳动速率仅与蛋白质颗粒大小有关，加之聚丙烯酰胺凝胶具有分子筛效应，因而此种称之为SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-polyac1ylarnide gel eiectrophoresis, SDS-PAGE)已。2.等点聚焦电泳分离蛋白质如果在聚丙烯酰胺凝胶中加入系列两性电解质载体，在电场中可形成一个连续而稳定的线性pH梯度，即pH从凝胶的正极向负极依次递增。在这种介质中电泳时，被分离的蛋白质处在偏离其等电点的pH位置时带有电荷而移动，当蛋白质泳动至与其自身的pI值相等的pH区域时，其净电荷为零而不再移动，这种通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法称为等电聚焦电泳(isoelectric equilibri um electrophoresis, IEE)已。


生物化学与分子生物学 三、电泳分离蛋白质 3双向凝胶电泳分离蛋白质人类基因组计划完成后迎来了后基因组时代，其中蛋白质组学的研究颇受重视。双向凝胶电泳(two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)是蛋白质组学研究的重要技术之一。双向凝胶电泳的第一向是蛋白质的IEE，第二向为SDS-PAGE，利用被分离蛋白质等电点和分子量的差异，将复杂蛋白质混合物在二维平面上分离（见第二十七章）已。 四、层析分离蛋白质 层析(chromatography)是分离、纯化蛋白质的重要手段之一。一般而言，待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的。层析种类很多，有离子交换层析、凝胶过滤和亲和层析等。其中离子交换层析和凝胶过滤应用最广。


生物化学与分子生物学 四、层析分离蛋白质 蛋白质和氨基酸一样，是两性电解质，在某一特定pH时，各蛋白质的电荷量及性质不同，故可以通过离子交换层析得以分离岱。图24-6介绍的是阴离子交换层析，将阴离子交换树脂颗粒填充在层析管内，由于阴离子交换树(a)样品全部交换并吸附到树脂上；（b）负电荷较少的分子用较稀的Cl一或其他负离子溶液洗脱；（c）电荷多的分子随Cl一浓度增加依次洗脱；（d）洗脱图A280表示为280nm的吸光度脂颗粒上带正电荷，能吸引溶液中的阴离子（图24-6a)。然后再用含阴离子（如Cl-)的溶液洗柱。含负电量小的蛋白质首先被洗脱下来（图24-6b)；增加Cl一浓度，含负电量多的蛋白质也被洗脱下来（图24-6c)，于是两种蛋白质被分开。凝胶过滤(gel filtration)又称分子筛层析。层析柱内填满带有小孔的颗粒，一般由葡聚糖制成。蛋白质溶液加于柱之顶部，任其往下渗漏，小分子蛋白质进入孔内，因而在柱中滞留时间较长，大分子蛋白质不能进入孔内而径直流出，因此不同大小的蛋白质得以分离（图247)包。


生物化学与分子生物学 五、蛋白质颗粒沉降行为与超速离心分离 超速离心法(ultracentrifugation)既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的第二十四章常用分子生物学技术的原理及其应用(a)大球是葡聚糖凝胶颗粒；（b）样品上柱后，小分子进入凝胶微孔，大分子不能进入，故洗脱时大分子先洗脱下来；（c）小分子后洗脱出来分子量。蛋白质在高达500OOOg(g为gravity，即地心引力单位）的重力作用下，在溶液中逐渐沉降，直至其浮力(buoyant force)与离心所产生的力相等，此时沉降停止。不同蛋白质其密度与形态各不相同，因此用上述方法可将它们分开。蛋白质在离心力场中的沉降行为用沉降系数(sedimentation coefficient, S)表示，沉降系数(S)使用Svedberg单位(lS=l0-13秒）。S与蛋白质的密度和形状相关（表24-1)。


生物化学与分子生物学 五、蛋白质颗粒沉降行为与超速离心分离 蛋白质细胞色素c（牛心）肌红蛋白（马心）糜蛋白酶原（牛胰）B－乳球蛋白（羊奶）血红蛋白（人）血清清蛋白（人）过氧化氢酶（马肝）脉酶（刀豆）纤维蛋白原F. Sanger耗时多年才在1953年基本完成了胰岛素的一级结构测定，现今由于方法学改进及自动化分析仪器的产生，已有越来越多蛋白质的氨基酸序列问世。1.离子交换层析分析蛋白质的氨基酸组分首先分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成。蛋白质经盐酸水解后成为个别氨基酸，用离子交换树脂将各种氨基酸分开，测定它们的噩，算出各氨基酸在蛋白质中的百分组成或个数（图24-8)。 452第五篇医学分子生物学专题天冬慧郢 洗脱体积L___pH3.50.2mo讥拧檬酸钠----'c___pH4.250.2mo旧拧檬酸钠2.测定多肤链的氨基端和狻基端的氨基酸残基第二步测定多肤链的氨基端与狻基端为何种氨基酸残基。F. Sanger最初用二硝基氛苯与多肤链的a－氨基作用生成二硝基苯氨基酸，然后将多肤水解，分离出带有二硝基苯基的氨基酸。目前多用丹酰氯使之生成丹酰衍生物，该物质具强烈荧光，更易鉴别。狻基端氨基酸残基可用狻肤酶将其水解下来进行鉴定。


生物化学与分子生物学 452第五篇医学分子生物学专题天冬慧郢 3.肤链序列的测定第三步是将肤链水解成片段，分别进行分析。常用者有胰蛋白酶法、胰凝乳蛋白酶法、澳化氛法等。胰蛋白酶能水解赖氨酸或精氨酸的狻基所形成的肤键。所以如果蛋白质分子中有4个精氨酸及赖氨酸残基，则可得5个片段。胰凝乳蛋白酶水解芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸）狻基侧的肤键，澳化氮水解甲硫氨酸狻基侧的肤键。蛋白质水解生成的肤段，可通过层析和电泳及质谱将其分离纯化并鉴定，得到的图谱称为肤图(peptide map)，由此可明确肤段的大小和数量。各肤段的氨基酸排列顺序一般采用Edman降解法进行分析。将待测肤段先与异硫氮酸苯酣反应，该试剂只与氨基端氨基酸的游离a－氨基作用。再用冷稀酸处理，氨基端残基即自肤链脱落下来，成为异硫氖酸苯酣衍生物，用层析可鉴定为何种氨基酸衍生物。残留的肤链可继续与异硫氖酸苯酣作用，依次逐个鉴定出氨基酸的排列顺序（图24-9)。对分析出的各肤段中的氨基酸顺序，进行组合排列对比，最终得出完整肤链中的氨基酸排列顺序。吼－NCS+NH2-CH-g-NH-R迦座►C6比一甘CS-NH-CH—C—NH—R


生物化学与分子生物学 异硫氖酸苯酣肤(I)苯氨基硫甲酰基肤(PIC-肤） 飞c6比—NH—C=NH子烟－NH-CS-NH-9H-COOH肤(II)\/[－5－嗟嗤琳酮PTC－氨基酸SC-NH+H+11苯乙内酰硫脉衍生物(PIH氨基酸）I、层析质谱法鉴定近年来，由于核酸研究在理论上及技术上的迅猛发展，尤其是人全基因组测序的完成，各种蛋白质的氨基酸序列已经可以通过核酸序列来推演。然而，蛋白质组学研究、生物制药产品的鉴定等仍需要进行高效而准确的蛋白质的部分一级结构分析。 七、蛋白质的空间结构分析 大量生物体内存在的蛋白质空间结构的解析，对于研究蛋白质结构与功能的内在关系至关重要，也为蛋白质或多肤药物的结构改造以致增强作用减弱副作用提供了理论依据。由千蛋白质的空间结构十分复杂，因而其测定的难度也较大，而且还需昂贵的仪器设备和先进的技术。随着结构生物学的发展，蛋白质二级结构和三维空间结构的测定也已普遍开展已。


生物化学与分子生物学 七、蛋白质的空间结构分析 冷冻电镜(cryo-electron microscopy)技术的发明极大提高了蛋白质三维结构的解析速度和分辨率，而且可以分析蛋白质在相对天然状态下的结构，当前已经成为结构生物学的主要研究手段。3生物信息学预测蛋白质空间结构由于蛋白质空间结构的基础是一级结构，参照已经完成的各种蛋白质的三维结构数据库，已经可以初步预测各种蛋白质的三维空间结构。 第六节生物大分子相互作用研究技术 生物大分子之间可相互作用并形成各种复合物，所有的重要生命活动，包括DNA的复制、转录、蛋白质的合成与分泌、信号转导和代谢等，都是由这些复合物所完成。研究细胞内各种生物大分子的相互作用方式，分析各种蛋白质、蛋白质－DN八蛋白质－RNA复合物的组成和作用方式是理解生命活动基本机制的基础。有关研究技术发展迅速，本节选择性介绍部分方法的原理和用途。


生物化学与分子生物学 一、蛋白质相互作用研究技术 目前常用的研究蛋白质相互作用的技术包括酵母双杂交、各种亲和分离分析（亲和色谱、免疫共沉淀、标签蛋白沉淀等）、FRET效应分析、噬菌体显示系统筛选等包。本部分简要介绍标签蛋白(tagged protein)沉淀和酵母双杂交技术(yeast two-hybrid system)。 (—)标签蛋白沉淀 标签融合蛋白结合实验是一个基千亲和色谱原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。该方法利用一种带有特定标签(tag)的纯化融合蛋白作为钓饵，在体外与待检测的纯化蛋白质或含有此待测蛋白质的细胞裂解液温育，然后用可结合蛋白标签的琼脂糖珠将融合蛋白沉淀回收，洗脱液经电泳分离并染色。如果两种蛋白质有直接的结合，待检测蛋白质将与融合蛋白同时被琼脂糖珠沉淀(pull-down），在电泳胶中见到相应条带已。标签融合蛋白结合实验可用于证明两种蛋白质分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结合的具体结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结合的未知分子。该方法亦常用于重组融合蛋白的纯化。


生物化学与分子生物学 (—)标签蛋白沉淀 目前最常用的标签是谷胱甘肤S－转移酶(glutathion eS-tran sferases, GST)，有各种商品化的载体用于构建GST融合基因，并在大肠杆菌中表达为GST融合蛋白（图24-10)。利用GST与还原型谷胱甘肤(glutathione, GSH)的结合作用，可以用共价偶联了GSH的琼脂糖珠进行标签蛋白沉淀实验(GST454第五篇医学分子生物学专题pull-down assay)。另一个常用的易于用常规亲和色谱方法纯化的标签分子是可以与锦离子琼脂糖珠结合的6个连续排列组氨酸(6xHis)标签。


生物化学与分子生物学 GSH-琼脂糖珠GST-蛋白X融合蛋白琼脂糖珠••.GST＞蛋白X>GS瑾码序列蛋白X编码序列蛋白质琼脂融合蛋白X—二三分子量糖珠蛋白与蛋白标准对照对照Y复合物 图24-10标签融合蛋臼沉淀实验流程示意图如蛋白X和蛋白Y间存在相互作用，可用GST标签蛋白沉淀实验予以证明。将蛋白X的编码基因插到GST编码序列的下游，表达为GST－蛋白X融合蛋白；该融合蛋白的GST部分可以与偶联在琼脂糖珠上的GSH结合；蛋白Y可以与蛋白X相互作用，被琼脂糖珠间接沉淀下来；经洗涤去除未结合的蛋白质，再用含游离GSH的缓冲液将GST－蛋白X融合蛋白竞争洗脱下来，经电泳染色即可证明两者的相互作用酵母双杂交系统目前已经成为分析细胞内未知蛋白质相互作用的主要手段之一。该技术的建立是基于对酵母转录激活因子GAIA分子的认识。GAIA分子的DNA结合区(binding domain, BD)和促进转录的活性区(activation domain, AD)被分开后将丧失对下游基因表达的激活作用，但是如果BD和AD分别融合了具有配对相互作用的两种蛋白质分子后，就可以依靠所融合的蛋白质分子之间的相互作用而恢复对下游基因的表达激活作用卤。


生物化学与分子生物学 GSH-琼脂糖珠GST-蛋白X融合蛋白琼脂糖珠••.GST＞蛋白X>GS瑾码序列蛋白X编码序列蛋白质琼脂融合蛋白X—二三分子量糖珠蛋白与蛋白标准对照对照Y复合物 酵母双杂交系统可以用于：心证明两种已知基因序列的蛋白质可以相互作用；©分析已知存在相互作用的两种蛋白质分子的相互作用功能结构域或关键氨基酸残基；＠将待研究蛋白质的编码基因与BD基因融合成为＂诱饵”表达质粒，可以筛选AD基因融合的＂猎物“基因的cDNA表达文库，获得未知的相互作用蛋白质。 二、DNA蛋白质相互作用分析技术 蛋白质与DNA相互作用是基因表达及其调控的基本机制。分析各种转录因子所结合的特定DNA序列及基因的调控序列所结合的蛋白质是阐明基因表达调控机制的主要研究内容。这里介绍两种目前常用的研究DNA与蛋白质相互作用的技术。


生物化学与分子生物学 二、DNA蛋白质相互作用分析技术 （一）电泳迁移率变动分析电泳迁移率变动分析(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)或称凝胶迁移变动分析(gel shift assay)最初用于研究DNA结合蛋白与相应DNA序列间的相互作用，可用于定性和定量分析，已经成为转录因子研究的经典方法。目前这一技术也被用千研究RNA结合蛋白和特定RNA序列间的相互作用包。DNA结合蛋白与特定DNA探针片段的结合会增大其分子扯，在凝胶中的电泳速度慢于游离探针，即表现为条带相对滞后。在实验中预先用放射性核素或生物素标记待检测的DNA探针，再将标记好的探针与细胞核提取物温育一定时间，使其形成DNA－蛋白质复合物，然后将温育后的反应液进行非变性（不加SDS，以免形成的复合物解离）聚丙烯凝胶酰胺电泳，最后用放射自显影等技术显示出标记DNA探针的条带位置。


生物化学与分子生物学 （二）染色质免疫沉淀技术 真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在。因此，研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的重要途径。染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay, ChIP)是目前可以研究体内DNA与蛋白质相互作用的主要方法。它的基本原理是在活细胞状态下，用化学交联试剂固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，再利用PCR技术特异性地富集目的蛋白质结合的DNA片段，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息包。近年来，人们将ChIP和芯片技术结合在一起，建立了ChIP芯片(ChIP社1ip)技术。该方法是在全基因组范围筛选与特定蛋白质相结合的DNA序列，即鉴定特定核蛋白的DNA结合靶点的一项新技术。 本章概括介绍了目前医学分子生物学中有关的部分常用技术。 印迹技术可以将在凝胶中电泳分离的生物大分子转移到固相介质上并加以检测分析，包括DNA印迹技术、RNA印迹技术和蛋白质印迹技术。在DNA和RNA印迹技木中，使用核酸探针进行检测；在蛋白质印迹技术中，使用特异性抗体进行梒测。


生物化学与分子生物学 本章概括介绍了目前医学分子生物学中有关的部分常用技术。 PCR的技术原理是以待扩增的DNA分子为模板，用两条寡核菩酸片段作为引物，分别与模板DNA链互补结合；在DNA聚合酶作用下完成两条新链的合成。不断重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。PCR的基本反应步骤包括变性、退火和延伸。以PCR为基础，衍生出RT-PCR、原位PCR、实时PCR等多种技术。PCR及其衍生技术主要用于目的基因的克隆、基因突变分析、DNA和RNA的微量分析、DNA序列测定和基因的体外突变等。确定一段DNA分子中的4种碱基的排列顺序的技术称为DNA测序。双脱氧法和化学降解法是经典的DNA测序方法。笫一代全自动DNA测序技术基于双脱氧法而建立。新一代高通量DNA测序技术实现了微量化、并行化和低成本，为医学大数据时代提供了核心技术支撑。DNA测序在医学中用于鉴定各种复杂性疾病的易感性预警或早期诊断的疾病标志物和治疗靶点；建立个人SNP位点与疾病易感性、药物敏感性和耐受性以及其他诸多表型之间的联系；用于病原微生物的分子分型。DNA测序在法医学领域具有特殊价值。


生物化学与分子生物学 本章概括介绍了目前医学分子生物学中有关的部分常用技术。 生物芯片包括基因芯片和蛋白质芯片。基因芯片主要用于基因表达检剧、基因突变检测、功能基因组学研究、基因组作图和新基因的发现等多个方面。蛋白质芯片广泛应用于蛋白质表达谱、蛋白质功能、蛋白质间的相互作用等研究。分离纯化蛋白质是研究单一蛋白质结构与功能的先决条件。通常利用蛋白质的理化性质，采取盐析、透析、电泳、层析及超速离心等不损伤蛋白质结构和功能的物理方法来纯化蛋白质。通过肤图分析和肤段的Edman降解法可以获得蛋白质的一级结构。X射线衍射、核磁共振和冷冻电镜是解析蛋白质三维结构的主要技术。分析蛋白质－蛋白质、蛋白质－DNA、蛋白质－RNA复合物的组成和作用方式是理解生命活动的基础。酵母双杂交技术和标签蛋白沉淀是目前分析细胞内蛋白质相互作用的主要手段。EMSA和ChIP456第五篇医学分子生物学专题是目前最常用的在体外和体内分析DNA与蛋白质相互作用的方法。


生物化学与分子生物学 1.核酸分子杂交在医学领域有哪些应用价值。 理和社会问题。5.简要叙述蛋白质理化性质在蛋白质分离、纯化中的应用。6.研究蛋白质相互作用的意义是什么，如何能够分离到细胞内的蛋白质复合体，设想可以动态实时分离鉴定研究细胞内生物大分子复合体的方式。（药立波）第二十五章基因结构功能分析和疾病相关基因鉴定克隆人类几乎所有的疾病都与基因结构和表达变化有关，都是遗传因素和环境因素相互作用的结果，因此分析基因的结构与功能、鉴定疾病相关基因是医学分子生物学重要的研究领域，具有重大的理论和实践意义。要解析疾病发生发展过程中遗传因素的作用及其分子机制，开展精准的诊断、治疗和预防，首先需要揭示基因的结构与功能。DNA序列测定可用于解析基因一级结构的变化；基因顺式作用元件的鉴定是了解基因表达的关键；基因拷贝数和表达产物的分析，了解基因时空表达特性，有助于揭示基因功能及功能改变的原因。


生物化学与分子生物学 1.核酸分子杂交在医学领域有哪些应用价值。 基因作为遗传信息携带分子，其功能实际是基因产物的功能，即基因编码的蛋白质和RNA的功能。对基因产物不同水平的研究，需要采用不同的研究手段。生物信息学序列比对，可预测基因的功能；蛋白质与蛋白质相互作用，蛋白质与DNA/RNA等的相互作用可用于了解基因产物的生物学途径；细胞水平上，高表达或者沉默某种基因，观察细胞生物学行为的改变，以了解基因的功能；构建转基因或基因敲除的动物模型，可在整体水平观察基因功能。


生物化学与分子生物学 1.核酸分子杂交在医学领域有哪些应用价值。 依据基因变异在疾病发生、发展中的作用，疾病相关基因可区分为致病基因和疾病易感基因。如果一种疾病的表型和一个基因型呈直接对应的因果关系，即该基因结构或表达的异常是导致该病发生的直接原因，那么该基因就属于致病基因。这类疾病主要是单基因病，即传统的遗传性疾病，环境因素的影响较小。在复杂性疾病，诸如肿瘤、心血管疾病、代谢性疾病、自身免疫性疾病等，环境因素和遗传因素均起着一定作用，表现为两个以上基因的“微效作用”的相加，或者多基因间的相互作用，故此类疾病亦称为多基因病。若单一基因变异仅增加对疾病的易感性，其基因可称之为疾病易感基因。我们可以将影响疾病发生发展的基因，笼统地称为疾病相关基因(disease related gene)，甚至直接称为疾病基因(disease gene)。需要特别注意的是不要被痰性纤维化基因、糖尿病基因等基因名称所误导。许多人类基因首先是通过研究该基因突变导致的疾病时发现的，故以疾病来命名，实际上这些基因正常时，均具有重要的生物学功能。


生物化学与分子生物学 1.核酸分子杂交在医学领域有哪些应用价值。 鉴定疾病相关基因，不但可以详尽地了解疾病的病因和发病机制，开发新的诊断和干预技术，而且有利于了解基因的功能，因而一直是生物医学工作者研究的重点。鉴定新基因或称克隆新基因也具有重大的商业价值，各大生物药物公司纷纷加入这一基因发现的大战中。人类基因组计划的完成为疾病相关基因的发现提供了有利的契机。后基因组时代生物医学领域的主要任务之一就是诠释基因的功能，而鉴定疾病相关基因与确定基因功能两者有着密不可分的联系，并可相互促进。 第一节基因结构分析 大部分基因实质上就是一段特定的DNA序列，通常由编码序列和非编码序列组成。解析基因一级结构的DNA测序技术见第二十四章，本节主要介绍分析基因编码序列和两种非编码序列（转录起点和启动子）的技术、分析基因拷贝数和基因表达产物的常用技术。


生物化学与分子生物学 458第五篇医学分子生物学专题一、鉴定基因的顺式元件是了解基因表达的关键 对基因结构的了解，除获得DNA的核昔酸序列外，还必须确定基因功能区域，这些功能区域包括基因编码区、启动子区和转录起始点等顺式作用元件区域。(—)编码序列的确定主要通过生物信息学、cDNA文库和RNA剪接分析法编码序列是对应着成熟mRNA的核昔酸序列，分析基因编码序列的主要技术如下。1.用数据库分析基因编码序列在基因数据库中，对各种方法所获得的cDNA片段的序列进行同源性比对，通过染色体定位分析、内含子／外显子分析、可读框(open reading frame, ORF)分析及表达谱分析等，可以初步明确基因的编码序列，并可对其编码产物的基本性质，如跨膜区、信号肤序列等进行分析。由于基因数据库的信息量不断增大，利用有限的序列信息即可通过同源性搜索获得全长基因序列，然后，利用美国国立生物技术信息中心(Nation al Center for Biotechnology Information, NCBI)的ORF Finder软件或EMBOSS中的getorf软件进行ORF分析，并根据编码序列和非编码序列的结构特点，便可确定基因的编码序列。


生物化学与分子生物学 458第五篇医学分子生物学专题一、鉴定基因的顺式元件是了解基因表达的关键 2.用cDNA文库法分析基因编码序列对cDNA进行克隆测序或构建cDNA文库是最早分析基因编码序列的方法。全长cDNA文库一般可以通过mRNA的结构特征进行判断，因为尽管细胞中各mRNA的序列互不相同，但基本上都由3部分组成，即5'-UTR、编码序列和3'-UTR，其中编码序列含有以起始密码子开头、终止密码子结尾的ORF。以cDNA文库作为编码序列的模板，利用PCR法即可将目的基因的编码序列钓取出来，如果按基因的保守序列合成PCR引物，即可从cDNA文库中克隆未知基因的编码序列；还可通过分析PCR产物来观察mRNA的不同拼接方式。cDNA末端快速扩增(rap吐amplification of cDNA end, RACE)技术（包括5'－和3'-RACE)是高效钓取未知基因编码序列的一种方法，该方法可以利用mRNA内很短的一段序列来扩增与其互补的cDNA末端序列，以此为线索，经过多次扩增及测序分析，最终可以获得基因的全部编码序列。


生物化学与分子生物学 458第五篇医学分子生物学专题一、鉴定基因的顺式元件是了解基因表达的关键 此外，采用核酸杂交法可从cDNA文库中，获得特定基因编码序列的cDNA克隆，该方法为寻找同源编码序列提供了可能，其做法是：根据其他生物的基因序列合成一段DNA探针，然后以核酸杂交法筛选所构建的cDNA文库，进而对阳性克隆的cDNA片段进行序列分析，也将此方法称为动物园杂交(zoo hybrization)。


生物化学与分子生物学 458第五篇医学分子生物学专题一、鉴定基因的顺式元件是了解基因表达的关键 3.用RNA剪接分析法确定基因编码序列通常情况下，选择性剪接的转录产物可以通过基因表达序列标签(expression sequence tag, EST)的比较进行鉴定，但这种方法需进行大量的EST序列测定；同时由于大多数EST文库来源于非常有限的组织，故组织特异性剪接变异体也很可能丢失。目前，高通量分析RNA剪接的方法主要有3种：心基于DNA芯片的分析法：常用的是代表外显子的DNA芯片或外显子／外显子交界的DNA片段芯片；＠交联免疫沉淀法：用紫外线将蛋白质和RNA交联在一起，然后用特异性抗体将蛋白质－RNA复合物沉淀，通过分析蛋白质结合的RNA序列，便可确定RNA的剪接位点；＠体外报告基因测定法：即将报告基因克隆到载体中，使RNA剪接作为活化报告基因的促进因素，通过分析报告基因的表达水平，即可推测克隆片段的RNA剪接情况，以此为线索便可分析基因的编码序列。


生物化学与分子生物学 458第五篇医学分子生物学专题一、鉴定基因的顺式元件是了解基因表达的关键 （二）启动子的确定主要采用生物信息学、启动子克隆法和核酸蛋白质相互作用法分析启动子结构对于研究基因表达调控具有重要意义。研究启动子结构的方法首先可利用生物信息学方法预测启动子，其次可采用传统的启动子克隆法，还可以采用核酸与蛋白质相互作用的方法进行研究。1.用生物信息学预测启动子采用生物信息学方法预测启动子结构特征为后续的启动子克隆及深入研究提供理论支撑。(1)用启动子数据库和启动子预测算法定义启动子：由千启动子通常涉及基因的上游区域，含有第二十五章基因结构功能分析和疾病相关基因鉴定克隆459调控基因适度活化或抑制的信息，因此，在定义启动子或预测分析启动子结构时应包括启动子区域的3个部分：CD核心启动子(core promoter)；＠近端启动子（proximal promoter)：含有几个调控元件的区域，其范围一般涉及转录起点(transcription start site, TSS)上游几百个碱基；＠远端启动子（如tal promoter)：范围涉及TSS上游几千个碱基，含有增强子和沉默子等元件。


生物化学与分子生物学 458第五篇医学分子生物学专题一、鉴定基因的顺式元件是了解基因表达的关键 (2)预测启动子的其他结构特征：启动子区域的其他结构特征包括GC含量、CpG比率、转录因子结合位点、碱基组成及核心启动子元件等。大约70％以上哺乳类动物基因5'－区都含有CpG岛，常与启动子序列重叠或交叉覆盖，故可用千鉴定启动子。也可以根据始祖启动子与mRNA转录本之间的相似性鉴定启动子。用于启动子预测的数据库有多个，例如，真核启动子数据库(eukaryotic promoter database, EPD)主要预测真核RNA聚合酶11型启动子，数据库中的所有启动子数据信息都经过实验证实；转录调控区数据库(transcription regulatory region database, TRRD)的数据来源千已发表的科学论文。这些数据库主要通过计算机识别、判断及分析，在数据库中寻找启动子的特异性特征结构。2.用PCR结合测序技术分析启动子结构该方法最为简单和直接，即根据基因的启动子序列，设计一对引物，然后以PCR法扩增启动子，经测序分析启动子序列结构。3.用核酸－蛋白质相互作用技术分析启动子结构足迹法(footprinting)用千分析启动子中潜在的调节蛋白结合位点，利用DNA电泳条带连续性中断的图谱特点判断与蛋白质结合的DNA区域，它是研究核酸－蛋白质相互作用的方法，而不是专dsDNA门用千研究启动子结构的方法，足迹法需要对被检DNA进行切割，根据切割DNA试剂的不同，足迹法可分为酶足迹法和化学足迹法。谦I单链末端标记(1)用核酸酶进行足迹分析：酶足迹法澡(enzymatic footprinting)是利用DNA酶处理DNA结合蛋白DNA－蛋白质复合物，然后通过电泳分析蛋白质结合序列。常用的酶有DNA酶I(DNase I)和核酸外切酶III。jDNaseI切割（控制反应时间）DNase I足迹法的基本原理如图25-1。将谦__:::::,可能含有目的启动子序列的双链DNA片段进谦_二=＝＝＝谦＝一二－—－二＝＝＝长短不同的片段行单链末端标记，然后与细胞核抽提物进行体谦＝＝=二—I蛋白质结合区不被酶切外结合反应，进而经DNase I随机切割，从而谦谦＝＝<二—二-勹产生一系列长短不同的DNA片段，最后经变谦谦性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，形成仅相差一个l变性凝胶电泳核昔酸的一系列DNA条带。由千DNA结合蛋M无蛋白蛋白－DNA白可保护其结合的DNA序列不受DNase I的酶切消化，从而在凝胶电泳的感光胶片上出现无条带的空白区域，该现象类似蛋白质在DNA上留下的足迹。通过对空白区域相应的DNA进行克隆和测序，并对照未经结合反应的DNA序列标志，即可鉴定蛋白质结合区的DNA之精确序列。


生物化学与分子生物学 458第五篇医学分子生物学专题一、鉴定基因的顺式元件是了解基因表达的关键  核酸外切酶皿足迹法的基本原理类似 DNase I足迹法，即利用核酸外切酶III的3'~对空白区域相应的DNA进行克隆和测序，并对照未经结合5'外切酶活性，从3'－末端切割双链DNA，从而反应的DNA序列标志，即可鉴定蛋白质结合区的DNA序列确定蛋白质在DNA上的结合位点。图25-1DNase I足迹法的原理460第五篇医学分子生物学专题(2)用化学试剂进行足迹分析：化学足迹法(chemical footprinting)是利用能切断DNA骨架的化学试剂处理DNA－蛋白质复合物，由于化学试剂无法接近结合了蛋白质的DNA区域，因此在电泳上形成空白区域的位置就是DNA结合蛋白的结合位点。最常用的化学足迹法是经自由基足迹法(hydroxyl radica l footprinting)。


生物化学与分子生物学 核酸外切酶皿足迹法的基本原理类似 轻自由基足迹法利用轻自由基攻击DNA分子表面的脱氧核糖骨架，若DNA结合蛋白将脱氧核糖遮盖，则自由轻基无法靠近，于是便可在凝胶电泳中出现缺失条带的现象。由千轻自由基分子量小，不受本身空间位阻的影响，相对于DNase I和核酸外切酶皿足迹法而言，轻自由基足迹法产生的足迹更小，更有利于确定蛋白质在DNA上的结合位点。还可用电泳迁移率变动分析和染色质免疫沉淀技术鉴定启动子，电泳迁移率变动分析(electrophoretic mob山ty shift assay, EMSA)和染色质免疫沉淀(chromatin immuno-pre cipitation, ChIP)技术的原理见第二十四章。由于EMSA和ChIP均只能确定DNA序列中含有核蛋白结合位点，故尚需结合DNA足迹实验和DNA测序等技术来确定具体结合序列。（三）转录起始点的确定采用生物信息学、直接克隆测序法和5'-RACE法在原核或真核生物，RNA聚合酶通过识别和结合启动子而在基因的转录起点(TSS)启动基因的转录。此处主要介绍分析真核生物基因TSS的技术。


生物化学与分子生物学 核酸外切酶皿足迹法的基本原理类似 1.用数据库搜索TSS目前，数据库巳成为搜索TSS的重要工具。利用对寡核昔酸帽法构建的全长cDNA文库5'－末端测序所得的数据信息建立了一个TSS数据库(database of trans cription start sites, DBTSS)，并在此基础上，通过将寡核昔酸帽法和大量平行测序技术相结合开发了一种TSS测序法，从而实现了一次测试可产生1xl07个TSS的数据。由此可见，利用数据库资源可以为基因TSS的鉴定提供重要参考。


生物化学与分子生物学 核酸外切酶皿足迹法的基本原理类似 2.用cDNA克隆直接测序法鉴定TSS最早对TSS的鉴定方法就是直接对cDNA克隆进行测序分析。以mRNA为模板，经逆转录合成cDNA第一链，同时利用逆转录酶的末端转移酶活性，在cDNA第一链的末端加上polyC尾，并以此引导合成cDNA第二链。将双链cDNA克隆千适宜载体，通过对克隆cDNA的5'－末端进行测序分析即可确定基因的TSS序列。该方法比较简单，尤其适于对特定基因TSS的分析。但该方法依赖于逆转录合成全长cDNA，一旦cDNA的5'－末端延伸不全，或在逆转录之前或过程中mRNA的5'－末端出现部分降解，便可导致5'－末端部分缺失，从而影响对TSS的序列测定。


生物化学与分子生物学 核酸外切酶皿足迹法的基本原理类似 3.用5'-cDNA末端快速扩增技术鉴定TSS5'-cDNA末端快速扩增技术(5'-rapid amplification of cDNA end,5'-RACE)是一种基于PCR从低丰度的基因转录本中快速扩增cDNA5'－末端的有效方法。以下简要介绍一种利用高特异性5'-RACE法鉴定TSS的技术（图25-2)：心用碱性磷酸酶去掉总RNA中裸露的5'－磷酸基团；＠用烟草酸焦磷酸酶去掉mRNA的5'－帽子结构，保留一个磷酸基团；＠用T4RNA连接酶将5'-RACE适配体(5'-RACE adapter)连接到去帽mRNA的5'－末端；＠以上述带有5'-RACE适配体的mRNA为模板，用逆转录酶和随机寡核昔酸引物进行逆转录合成cDNA;＠巢式PCR反应：先用下游外侧基因特异性引物(gene specific primer1, GSPl)和5'-RACE外侧引物进行外侧PCR反应；然后再使用下游内侧基因特异性引物(GSP2)和5'-RACE内侧引物进行内侧PCR反应；＠通过对最终的PCR产物直接进行DNA测序或先进行DNA克隆后再测序，从而明确特定基因的TSS序列。


生物化学与分子生物学 核酸外切酶皿足迹法的基本原理类似 在5'-RACE的基础上，通过在转录本5'－末端引入特殊的II型限制性内切酶识别位点，可将多个5'－末端短片段串联在一起，进而通过对串联片段的一次测序可获得多个基因的TSS序列信息。常用的技术包括5'－末端基因表达系列分析(5'-end seria l analysis of gene expression,5'-SAGE)和帽分析基因表达(cap analysis gene expression, CAGE)技术。RNA5'm7G-p-p-p AAA...3'全长mRNA5'3'降解的mRNA,rRNA,tRNA和DNA5'p t用TAP处理AAA...3'去帽的全长mRNA5'5'RACE接头卜连接AAA...3'去帽的mRNA与5'RACE接头结合5'AAA...3'cDNA随机9核昔酸引物（四）其他顺式作用元件的确定顺式作用元件(cis-acting element)指存在于基因非编码序列中，能影响编码基因表达的序列。除上文所描述的顺式作用元件外，增强子、沉默子、绝缘子等都可以参与基因表达调控，因发挥重要的调控作用而被广泛关注。


生物化学与分子生物学 核酸外切酶皿足迹法的基本原理类似 增强子指能增加同它连锁的基因转录效果的DNA序列。增强子是通过启动子来增加转录的。有效的增强子可以位于基因的5'－端，也可位于基因的3'－端，有的还可位于基因的内含子中。增强子的效应很明显，一般能使基因转录效果增加l0~200倍，有的甚至可以高达上千倍。例如，人珠蛋白基因的表达水平在巨细胞病毒(cytomegalovirus, CMV)增强子作用下可提高600-1000倍。增强子的作用同增强子的方向(5'-+3'或3'-+5'）无关，甚至远离靶基因达几于kb也仍有增强作用。常用于鉴定增强子的方法包括染色质免疫共沉淀技术(ChIP)结合测序技术(ChIP-seq)和位点特异性整合荧光激活细胞分选测序技术(site-specific integration fluorescenc e-activated cell sorting followed by sequencing, SIF-seq)分析法。


生物化学与分子生物学 核酸外切酶皿足迹法的基本原理类似 沉默子是基因的负调控元件。真核细胞中沉默子的数量远远少于增强子。沉默子的DNA序列被调控蛋白质结合后阻断了转录起始复合物的形成或活化，使基因表达活性关闭。绝缘子(insulator)是一类特殊的顺式作用元件，它不同千增强子，其功能是阻止激活或阻遏作用在染色体上的传递，使染色质的活性限定于结构域之内。如果将一个绝缘子置于增强子和启动子之间，它能阻止增强子对启动子的激活。另外，如果一个绝缘子在活性基因和异染色质之间，则可以保护该基因免受异染色质化而失活。这些性质说明绝缘子可能影响染色质的组织结构。近几年来，利用染色质免疫共沉淀技术、染色体构象捕获(chromosome conformation capture,3C)等表观遗传学技术，结合芯片或新一代测序技术等高通量技术平台，以及生物信息学分析手段来鉴定这些具有调节基因表达的顺式作用元件，已经成为后基因时代的研究热点和发展趋势。


生物化学与分子生物学 核酸外切酶皿足迹法的基本原理类似 二、检测基因的拷贝数是了解基因表达丰度的重要因素分析某种基因的种类及拷贝数，实质上就是对基因进行定性和定量分析，常用的技术包括DNA印迹(Southern印迹）、实时定量PCR技术等（见第二十四章）。DNA印迹是根据探针信号出现的位置和次数判断基因的拷贝数。一般情况下，DNA印迹可以准确地检测位于基因组不同位置上的相同拷贝基因，但如果基因的多个拷贝成簇地排列在基因组上，则应配合DNA测序进行分析。DNA印迹除462第五篇医学分子生物学专题了作为基因拷贝数的检测方法外，还常用于基因定位、基因酶切图谱、基因突变和基因重排等分析。实时定量PCR是通过被扩增基因在数量上的差异推测模板基因拷贝数的异同。DNA测序是最精确的鉴定基因拷贝数的方法。


生物化学与分子生物学 核酸外切酶皿足迹法的基本原理类似 三、分析基因表达的产物可采用组学方法和特异性测定方法基因表达产物包括RNA和蛋白质／多肤，因此分析基因表达可以从RNA和蛋白质／多肤水平上进行。在1968年中心法则确立前后的数年间，只能通过测定代谢酶活性，或采用核素标记结合原位杂交、凝胶电泳、放射自显影分析基因表达。20世纪70年代中期以后，RNA印迹(1977年）和蛋白质印迹(1979年）成为分析特异基因表达的常规技术。DNA克隆技术的诞生(1973年）推动了基因组DNA和cDNA的分离与鉴定；1980—1990年间，积累了大量EST;1990年代初，各种DNA、EST、mRNA数据库应运而生。随后，PCR(1986年），特别是实时定量PCR与数据库检索相结合，通过合成特异引物检测基因表达几乎取代了先前的RNA印迹。随着人类基因组测序的完成，为了满足基因功能诠释和从“组学“水平揭示基因表达谱的需要，各种生物芯片（包括核酸和蛋白质芯片）技术应运而生，结合20世纪80~90年代建立的转基因、基因敲除／敲入技术，基因表达及功能分析技术日趋成熟。


生物化学与分子生物学 （一）通过检测RNA在转录水平分析基因表达 根据分析方法的原理和功能特性，可将基因转录水平分析分为封闭和开放性系统研究方法。封闭性系统研究方法（如DNA芯片、R NA印迹、实时RT-PC R等）的应用范围仅限于巳知基因。开放性系统研究方法（如差异显示P C R、双向基因表达指纹图谱、分子索引法、随机引物PCR指纹分析等）可用于发现和分析未知基因。此处主要介绍常用的针对已知基因的转录水平分析技术。1.用核酸杂交法检测RNA表达水平核酸分子杂交法是目前生物化学及分子生物学研究领域应用非常广泛的技术之一，是定性或者定量特异性检测RNA序列片段的有效工具。(1)用RNA印迹分析RNA表达：RNA印迹，也称Northern印迹，被广泛应用于RNA表达分析，并作为鉴定RNA转录本、分析其大小的标准方法。尽管RNA印迹并不适合高通量分析，但对于那些通过差异显示RT-PCR或DNA芯片等技术获得的差异表达的RNA，可用RNA印迹来确证；对于新发现的cDNA序列，以其为探针对组织或细胞的RNA样品进行RNA印迹分析，可确定与之互补的RNA真实存在。


生物化学与分子生物学 （一）通过检测RNA在转录水平分析基因表达 (2)用核糖核酸酶保护实验分析RNA水平及其剪接情况：RNA酶保护实验(ribonuclease protection assay, RP A)是一种基于杂交原理分析RNA的方法，既可进行定量分析，又可研究其结构特征。RPA的原理如图25-3：用含特定DNA序列的质粒为模板，经体外转录，制备RNA探针；将标记的RNA探针与样品RNA杂交后，经只水解单链RNA的RNA酶处理，即可去除游离探针及双链RNA中的单链区域，而使杂交双链RNA受到保护不被消化。回收杂交双链并进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后，通过检测探针标记物便可显示对应千探针大小的RNA片段。RPA技术可对RNA分子的末端以及外显子／内含子的交界进行定位，确定转录后RNA的剪接途径。此外，RPA还可用于特定RNA的丰度分析。与RNA印迹相比，RPA的灵敏度和分析效率更高，该方法可在一次实验中同时分析几种mRNA，但因每一个探针的实验条件需认真优化，因此这一方法不适于高通量分析。


生物化学与分子生物学 （一）通过检测RNA在转录水平分析基因表达 (3)用原位杂交进行RNA区域定位：原位杂交(in situ hybridization, ISH)是通过设计与目标RNA碱基序列互补的寡核昔酸探针，利用杂交原理在组织原位检测RNA的技术，其可对细胞或组织中原位表达的RNA进行区域定位，同时也可作为定量分析的补充。2用PCR技术检测RNA表达水平PCR技术是目前生物化学与分子生物学领域应用最为便捷、广泛的技术，可快速对RNA分子进行定量或者定性检测。 5'~待克隆目的片段3'T7或SP6，一一限制性内切酶使载体线性化」_5'．产3'T7或SP6依赖DNA的5'总RNA池3'RNA聚合酶l标记的单核昔酸杂交反应3◄标记的反义RNA探针5'』5'3'变性电泳检测RNA探针工lRNA杂交片段/~_固25-3核糖核酸酶保护实验的原理 3.用基因芯片和高通量测序技术分析RNA表达水平基因芯片和高通量测序技术的应用大大加速了揭示基因组、转录组结构与功能的步伐，是目前宏观分析RNA表达的有效技术手段。


生物化学与分子生物学 5'~待克隆目的片段3'T7或SP6，一一限制性内切酶使载体线性化」_5'．产3'T7或SP6依赖DNA的5'总RNA池3'RNA聚合酶l标记的单核昔酸杂交反应3◄标记的反义RNA探针5'』5'3'变性电泳检测RNA探针工lRNA杂交片段/~_固25-3核糖核酸酶保护实验的原理 (I)基因芯片已成为基因表达谱分析的常用方法：目前，基因芯片（见第二十四章）技术巳广泛应用于基因表达谱分析，主要采用cDNA芯片，其便于对不同状态（如生理和病理条件）下的基因表达谱进行比较，揭示转录组差异表达的规律，对探索发病机制、评价治疗效果、筛选药物靶标具有重要意义。


生物化学与分子生物学 5'~待克隆目的片段3'T7或SP6，一一限制性内切酶使载体线性化」_5'．产3'T7或SP6依赖DNA的5'总RNA池3'RNA聚合酶l标记的单核昔酸杂交反应3◄标记的反义RNA探针5'』5'3'变性电泳检测RNA探针工lRNA杂交片段/~_固25-3核糖核酸酶保护实验的原理 (2)用循环芯片测序技术分析基因表达谱：运用循环芯片测序技术（即第二代测序技术），可对基因表达谱进行高通最分析，一次可完成几十万到几百万个DNA分子片段的序列测定，从而快速获得转录组或基因组的全貌。除用千DNA测序外，循环芯片测序技术还广泛应用千基因组分析的各个方面：在DNA水平上，可以大规模地分析基因组甲基化、筛选突变基因、检测基因多态性；在RNA水平上，可以对RNA片段进行扫描、定量与鉴定，对全基因组进行广谱表达研究等。循环芯片测序技术的另一个广泛应用领域是小分子RNA或非编码RNA的研究。（二）通过检测蛋白质／多肤而在翻译水平分析基因表达蛋白质／多肤是结构基因表达的最终产物，其质和量的变化直接反映了基因的功能。以下简要介绍几种检测蛋白质／多肤的技术。


生物化学与分子生物学 5'~待克隆目的片段3'T7或SP6，一一限制性内切酶使载体线性化」_5'．产3'T7或SP6依赖DNA的5'总RNA池3'RNA聚合酶l标记的单核昔酸杂交反应3◄标记的反义RNA探针5'』5'3'变性电泳检测RNA探针工lRNA杂交片段/~_固25-3核糖核酸酶保护实验的原理 1.用蛋白质印迹技术检测蛋白质／多肤蛋白质印迹技术的原理见第二十四章。该技术需要将蛋白质／多肤转移到固相支待物上进行检测。2用酶联免疫吸附实验分析蛋白质／多肤与蛋白质印迹相似，酶联免疫吸附实验(ELISA)也是\mfi464第五篇医学分子生物学专题一种建立在抗原－抗体反应基础上的蛋白质／多肤分析方法，其主要用于测定可溶性抗原或抗体，该方法需要将已知抗原或抗体吸附于固相载体（如聚苯乙烯微量反应板）表面，使抗原－抗体反应在固相表面进行。常用的ELISA方法包括双抗体夹心法、间接法、酶联免疫斑点实验(ELISPOT)以及生物素亲和素系统－ELISA(b iotin avidin system ELISA, BAS-ELISA)。


生物化学与分子生物学 5'~待克隆目的片段3'T7或SP6，一一限制性内切酶使载体线性化」_5'．产3'T7或SP6依赖DNA的5'总RNA池3'RNA聚合酶l标记的单核昔酸杂交反应3◄标记的反义RNA探针5'』5'3'变性电泳检测RNA探针工lRNA杂交片段/~_固25-3核糖核酸酶保护实验的原理 5.用蛋白质芯片分析蛋白质／多脓表达水平用蛋白质芯片分析蛋白质／多肤的表达谱：运用蛋白质芯片可高通量分析蛋白质／多肤的表达和功能。根据制作方法和用途不同，可将其分为蛋白质检测和功能芯片两大类。蛋白质检测芯片包括抗体芯片、抗原芯片、配体芯片等，它是将具有高亲和力的特异性探针分子（如单克隆抗体）固定在基片上，用以识别生物样品溶液中的目标多肤；蛋白质功能芯片可用来研究蛋白质修饰、蛋白质－蛋白质／蛋白质－DNA/蛋白质－RNA，以及蛋白质与脂质、蛋白质与药物、酶与底物、蛋白质－小分子等的相互作用。与基因芯片类似，蛋白质芯片可用于检测组织／细胞来源的样品中蛋白质的表达谱；其精确程度、信息范畴取决于芯片上已知多肤的信息多寡。由于多肤合成昂贵，蛋白质来源受限，加之蛋白质操作技术难，使蛋白质芯片的应用受到限制。


生物化学与分子生物学 5'~待克隆目的片段3'T7或SP6，一一限制性内切酶使载体线性化」_5'．产3'T7或SP6依赖DNA的5'总RNA池3'RNA聚合酶l标记的单核昔酸杂交反应3◄标记的反义RNA探针5'』5'3'变性电泳检测RNA探针工lRNA杂交片段/~_固25-3核糖核酸酶保护实验的原理 6.双向电泳高通量分析蛋白质表达谱用双向电泳分析蛋白质／多肤表达谱：双向电泳可同时分离成百上千的蛋白质（见第一章）。电泳结果经染色后，既可对不同样品中蛋白质的表达谱进行比较；还可以从凝胶中将特定的蛋白质点切下，经胰蛋白酶消化后得到短肤片段，利用质谱技术进行定性分析，对差异表达的蛋白质进行鉴定。


生物化学与分子生物学 第二节基因功能研究 基因的功能就是基因产物的功能，也就是编码基因的蛋白质功能和非编码基因RNA的功能，前者是本节讨论的重点。非编码RNA，如miRNA、lncRNA等所谓的调节RNA功能，最近引起了广泛的关注，可参考基因表达调控的相关章节内容。基因产物的功能可以从三个不同水平来描述：心生物化学水平，主要描述基因产物参与了何种生化过程，如蛋白激酶、转录因子等；＠细胞水平，主要论述基因产物在细胞内的定位和参与的生物学途径，例如，某蛋白质定位于核内，参与DNA的修复过程，有可能并不了解确切的生物化学功能；＠整体水平，主要包括基因表达的时空性及基因在疾病中的作用。对人类基因功能的研究是后基因组时代生命科学领域中的重大命题。通过基因功能的研究可以阐明人体细胞的增殖、分化、衰老、死亡和通讯等方面的分子机制，确定人类疾病发生发展及转归的机制，进而研发新的诊断技术及治疗干预措施，提供药物开发的靶标分子，是开展精准医疗的基础包。


生物化学与分子生物学 一、生物信息学全面了解基因已知的结构和功能 江在以往的研究中，已经对大量的基因功能产物的功能有了详尽的了解，获得了足够多的信息，建立了共享资源数据库，其中最为著名的就是美国的GenBank。这些数据库是进行基因序列比对，诠释基因功能的基础。依据分子进化的理论，核酸或氨基酸序列相似的基因，应表现出类似的功能。这些序列相似的基因称之为同源基因。基本的方法是基因序列比对分析。两个或多个符号序列按字母比较、尽可能确切地反映它们之间的相似和差异，称为序列比对，又称序列联配。通常所讲的序列比对包括核酸序列比对和蛋白质序列比对。根据每次参与比对的序列数又可分为双序列比对和多序列比对。常用的生物信息数据库网址见表25-1。


生物化学与分子生物学 数据库名称数据库服务器网址 EBI http:II吓w. ebi. ac. uk/GenBank.恤··••一一~恤 http:llww..v. ncbi. nlm. nih. govlGSDB(Genome Sequence Database)http:II=叩．ncgr. org:801gsdbNCBI http:II叭叩．ncbi. nlm. nih. govlSWISS-PROT http:lh'vWlv. ebi. ac. uk. swissprot/二、基因发挥作用的本质是其编码产物的生物化学功能人类基因组DNA有3xl09bp，包括2万个蛋白质编码基因，决定了人类作为高等动物及其复杂的生物学性状。编码基因表达的蛋白质分子包括：转录因子，是一类能与基因调控区域专一性结合的蛋白质分子，调控基因表达的时空性；核骨架蛋白质，是由纤维蛋白构成的网架结构，维待细胞核的基本结构；信号分子，一类参与胞内信号转导的蛋白质分子；酶，是一类生物催化剂，支配着生物的新陈代谢参与营养和能量转换等许多催化过程，与生命过程关系密切的反应大多是酶催化反应；细胞骨架蛋白质，是由蛋白质与蛋白质搭建的骨架网络结构，主要作用是维待细胞的一定形态；细胞膜受体，位千细胞质膜上，用千识别和结合小的非脂溶性信号分子；离子通道蛋白质，是横跨质膜的亲水性通道，允许适当大小的离子顺浓度梯度通过；转运体，是一类具有从胞外向胞内转运物质的蛋白质分子；激素，是一类由分泌细胞合成的信号分子，可调节机体的代谢、生长、发育、繁殖、性别、性欲等重要生命活动；细胞因子，是一类由免疫细胞（如单核、巨噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞等）和某些非免疫细胞（内皮细胞、表皮细胞、纤维母细胞等）经刺激而合成、分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质，可调节细胞生长、分化，调控免疫应答；抗体，是一种由浆细胞（效应B细胞）分泌，被免疫系统用来鉴别与中和外来物质如细菌、病毒等的大型Y形蛋白质；凝血因子，是一类参与血液凝固过程的蛋白质组分；载体蛋白，是血浆中可与一些不溶或难溶于水的物质，以及一些易被细胞摄取或易随尿液排出的物质结合的蛋白质；细胞外基质蛋白，是由细胞合成并分泌到细胞外、分布在细胞表面或细胞之间的大分子，主要是胶原蛋白或蛋白聚糖，支持并连接组织结构、调节组织的发生和细胞的生理活动。


生物化学与分子生物学 数据库名称数据库服务器网址 在一些情况下，即使对基因的序列、结构和表达模式有清楚的认识，但仍然难以阐明基因所表达的蛋白质的功能。此时通过研究该蛋白质与已知功能蛋白质的相互作用，无疑将非常有助于对该蛋白质功能的了解。例如，某一未知功能的新蛋白质与另一参与RNA剪接的蛋白质存在相互作用，极有可能该蛋白质也参加了RNA的剪接过程。研究蛋白质相互作用的方法包括遗传学、生物化学和物理学方法。遗传学方法仅用千如果蝇、酵母等模式生物，而生化和物理的方法可直接用千人类细胞。常用的生化方法是亲和层析和免疫共沉淀。常用的高通掀筛查蛋白质间相互作用的方法是酵母双杂交技术（见第二十四章）和噬菌体展示技术。噬菌体展示(phage display)是将外源性DNA插入到噬菌体衣壳蛋白编码基因中的一种表达克隆师466第五篇医学分子生物学专题技术。重组基因以融合蛋白的形式，掺入病毒颗粒中，展示在噬菌体的表面。融合噬菌体可与表面展示的外源蛋白质相互作用的蛋白质结合，以筛查蛋白质的相互作用。噬菌体展示的缺点在千其本身是一种体外分析系统，另外，只有短肤可以展示在噬菌体表面。噬菌体展示也可用千抗体工程和普通的蛋白质工程。


生物化学与分子生物学 三、利用工程细胞研究基因在细胞水平的功能 在细胞水平研究基因功能，除了观察细胞在实验条件下该基因表达的改变，更重要的是人为地导入外源基因或干预正常基因的表达，以观察细胞生物学行为的改变。（一）采用基因重组技术建立基因高表达工程细胞系采用基因重组技术，将外源基因导入宿主细胞，使其表达目的基因，进而观察细胞的生物学特征改变。根据外源基因在宿主细胞表达的待续时间，可区分为瞬时转染和稳定转染细胞。稳定转染细胞是一种最常用的细胞水平的转基因模型，外源基因通过转基因过程插入到细胞的染色体中，或以游离基因(episome)的形式存在于细胞中稳定表达。稳定表达外源蛋白的转染细胞可以用作基因功能研究的细胞模型，也可以利用这种方法获得外源基因产物，目前被广泛应用于细胞模型的建立。


生物化学与分子生物学 （二）基因沉默技术抑制特异基因的表达 在细胞水平沉默研究基因的表达，进而观察基因沉默后细胞的生物学行为改变，是基因功能研究的有力工具。可以利用RNA干扰技术、反义技术以及基因组编辑(genome editing)技术等来实现对特定基因表达的抑制。其中利用成簇规律间隔短回文重复(clustered regulatory interspaced short palindromic repeat, CRISPR)技术进行基因敲除，近年来发展迅猛并广泛应用于细胞、动物水平的特定基因沉默。


生物化学与分子生物学 四、利用基因修饰动物研究基因在体功能 人类基因组计划虽然解析了基因序列，但绝大多数基因的功能尚不清楚。因此，利用各种技术手段研究基因的功能将是”后基因组时代”的主要内容之一。基因功能的确定必须通过实验来验证。通常采用基因功能获得和（或）基因功能缺失的策略，观察基因在细胞或生物个体中所导致的细胞生物学行为或个体表型遗传性状的变化，从而从正反两方面对基因的功能进行鉴定。此外，基于正向遗传学的随机突变筛选技术也成为揭示基因功能的重要手段。由于基因的功能必须在完整的生物个体及其生命过程中才能得到完整的体现，因此，从整体水平研究基因的功能是必然的选择国。 （一）用功能获得策略鉴定基因功能 基因功能获得策略的本质是将目的基因直接导入某一细胞或个体中，使其获得新的或更高水平的表达，通过细胞或个体生物性状的变化来研究基因功能。常用的方法有转基因技术和基因敲入技术。


生物化学与分子生物学 （一）用功能获得策略鉴定基因功能 1．用转基因技术获得基因功能转基因技术(transgenic technology)是指将外源基因导入受精卵或胚胎干细胞(embryonic stem cell)，即ES细胞，通过随机重组使外源基因插入细胞染色体DNA，随后将受精卵或ES细胞植入假孕受体动物的子宫，使得外源基因能够随细胞分裂遗传给后代。转基因动物(transgenic animal)是指应用转基因技术培育出的携带外源基因，并能稳定遗传的动物，其制备步骤主要包括转基因表达载体的构建、外源基因的导入和鉴定、转基因动物的获得和鉴定、转基因动物品系的繁育等。在转基因动物中，以转基因小鼠最为常见。建立转基因小鼠的常用方法有两种，一是直接将目的DNA显微注射到受精卵的雄性原核，然后植入假孕母鼠体内，使之发育成幼仔；二是将带有目的基因的ES细胞注射到猴胚，然后在小鼠体内发育成幼仔。在出生的动物中即含有在一个等位基因的位点进行了DNA整合的小鼠，即转基因杂合子。经子代杂合子交配，在其后代中可筛选到纯合子（图25-4)。


生物化学与分子生物学 （一）用功能获得策略鉴定基因功能 `1,3利用转基因动物模型研究外源基因，能够接近真实地再现基因表达所导致的结果及其在整体水第二十五章基因结构功能分析和疾病相关基因鉴定克隆467检测子代是否存在植入假孕转移基因或基因1。“O O O O O O'/0|的ES 过杂合子后代，获得纯合子转 同源重组将筛选的或基因敲除／敲动物胚胎干细胞(ES)敲除／敲人ES注人细胞平的调控规律，把复杂的系统简单化，具有系统性和独立性。利用转基因技术建立的疾病动物模型具有遗传背景清楚、遗传物质改变简单、更自然更接近疾病的真实症状等优点。然而，转基因动物模型仍存在一些亟待解决的问题，如外源基因插入宿主基因组是随机的，可能产生插入突变，破坏宿主基因组功能；外源基因在宿主染色体上整合的拷贝数不等；整合的外源基因遗传丢失而导致转基因动物症状的不稳定遗传等。为解决上述问题，可以在转基因动物利用组织特异性启动子实现外源基因的时空特异性表达，或用化学或生物分子作为诱导剂，实现对外源基因表达时间及水平的精确控制。


生物化学与分子生物学 过杂合子后代，获得纯合子转 2.用基因敲入技术获得基因的功能基因敲入(gene knock-in)是通过同源重组的方法，用某一基因替换另一基因，或将一个设计好的基因片段插入到基因组的特定位点，使之表达并发挥作用。通过基因敲入可以研究特定基因在体内的功能；也可以与之前的基因的功能进行比较；或将正常基因引入基因组中置换突变基因以达到靶向基因治疗的目的。


生物化学与分子生物学 过杂合子后代，获得纯合子转 基因敲入是基因打靶(gene targetin g)技术的一种。基因打靶是一种按预期方式准确改造生物遗传信息的实验手段。该技术的巧妙之处在千将ES细胞技术和DNA同源重组技术结合起来，实现对染色体上某一基因的定向修饰和改造，从而深入地了解基因的功能。基因打靶的原理如图25-4：心从小鼠巍胚（受精卵分裂至8个细胞左右即为毅胚，此时受精卵只分裂不分化）分离出未分化的ES细胞；＠然后利用细胞内的染色体DNA与导入细胞的外源DNA在相同序列的区域内发生同源重组的原理，用含有筛选标记的打靶载体，对ES细胞中的特定基因实施“打靶”;＠将“中靶＂的ES细胞移植回小鼠襄胚，进而与壺胚一起分化发育成相应的组织和器官，最后产生出具有基因功能改变的＂嵌合鼠＂。由于“中靶＂的ES细胞保持分化的全能性，因此它可以发育成为嵌合鼠的生殖细胞，使得经过定向改造的遗传信息可以代代相传。


生物化学与分子生物学 过杂合子后代，获得纯合子转 除基因敲入外，基因打靶还包括基因敲除、点突变、缺失突变、染色体大片段删除等。基因打靶与转基因技术均可用于基因功能研究，但两者的最大区别就是基因打靶能去除和（或）替换生物体内的固有基因，而转基因技术则未去除或替换固有基因。目前，基因打靶巳成为研究基因功能最直接和最468第五篇医学分子生物学专题（二）用功能失活策略鉴定基因功能基因功能失活策略的本质是将细胞或个体的某一基因功能部分或全部失活后，通过观察细胞生物学行为或个体遗传性状表型的变化来鉴定基因的功能。常用的方法主要有基因敲除和基因沉默技术。1.用基因敲除技术使基因功能完全缺失基因敲除(gene knock-out)属于基因打靶技术的一种（见图25-4)，其利用同源重组的原理，在ES细胞中定点破坏内源基因，然后利用ES细胞发育的全能性，获得带有预定基因缺陷的杂合子，通过遗传育种最终获得目的基因缺陷的纯合个体。


生物化学与分子生物学 过杂合子后代，获得纯合子转 然而，基因被完全敲除之后使得表型分析受到很多限制，例如，有些重要的靶基因被敲除后会引起胚胎早期死亡，使得无法分析该基因在胚胎发育晚期和成年期的功能；某些基因在不同的细胞类型中执行不同的功能，完全敲除会导致突变小鼠出现复杂的表型，使研究者很难判断异常的表型是由一种细胞引起的，还是由几种细胞共同引起的。为了克服以上不足，条件性基因敲除(conditional gene knock-out)技术应运而生，该技术可以更加明确地在时间和空间上操作基因靶位，敲除效果更加精确可靠，理论上可达到对任何基因在不同发育阶段和不同器官、组织的选择性敲除。


生物化学与分子生物学 过杂合子后代，获得纯合子转 Cre/loxP系统的条件敲除的原理：如图25-5, Cre重组酶属于位点特异性重组酶，能介导两个34bp的loxP位点之间的特异性重组，使loxP位点间的序列被删除。重组酶介导的条件性基因敲除通常需要两种小鼠，一种是在特定阶段、特定组织或细胞中，表达Cre重组酶的转基因小鼠；另一种是在基因组中引入了loxP位点的小鼠，即靶基因或其重要功能域片段被两个loxP位点错定的小鼠。两种小鼠交配后，Cre基因表达产生的Cre重组酶就会介导靶基因两侧的loxP间发生切除反应，结果将一个loxP和靶基因切除。由千可以控制Cre重组酶在特定阶段、特定组织或细胞中表达，使得Cre介导的重组可以发生在特定的阶段、组织或细胞中，导致这些组织或细胞中的靶基因在特定的阶段被敲除，而其他组织或细胞中因不表达Cre而使得靶基因不被敲除。


生物化学与分子生物学 交配 靶基因被两个loxP位点连接在组织／细胞特异性启动子P之后，描定的转基因小鼠表达Cre重组酶的转基因小鼠Cre重组酶以组织／细胞特异的方式介导靶基因两侧的loxP间发生切除暑特异组织／细胞的中靶基因被敲除条件性基因敲除的优势在千克服了重要基因被敲除所导致的早期致死，并能客观、系统地研究基因在组织器官发生、发育以及疾病发生、治疗过程中的作用和机制。但这一技术亦存在一些缺点，如心L费用太高、周期较长，而且许多基因在敲除后，可能是这些基因的功能被其他基因代偿，并未产生明显第二十五章基因结构功能分析和疾病相关基因鉴定克隆469的表型改变。2.用基因沉默技术可使基因功能部分缺失基因沉默策略通常是利用反义技术，在转录或翻译水平特异性阻断（或封闭）某些基因的表达（即沉默相应基因），然后通过观察细胞生物学行为或个体遗传性状表型的变化来鉴定基因的功能。以下简要介绍几种常用的基因沉默技术。


生物化学与分子生物学 交配 (1)用RNA干扰(RNA interference, RN Ai)技术研究基因功能：利用RNAi能在短时间内高效特异地抑制靶基因表达的特点，可以很方便地研究基因的功能。用于基因沉默的干扰小RNA(smal l interfering RNA, siRNA)既可以在体外进行化学合成或体外转录生成，也可以基于具有合适启动子的载体或转录元件，在哺乳类动物或细胞中转录生成。研究者既可以将siRNA导入特定细胞，在细胞水平上研究基因的功能；也可以通过转基因的方法，在动物体内实现特异、稳定、长期地抑制靶基因的表达，从而在整体水平上研究基因的功能。与基因敲除相比，RN扣技术具有简单、易操作、周期短等优势，因此已被作为一种简便和有效的工具而广泛用于基因功能的研究。然而，该技术可能对靶基因的相似序列发生作用，导致脱靶(off-targeting)效应。


生物化学与分子生物学 （三）用随机突变筛选策略鉴定基因功能 尽管利用转基因、基因敲入／敲除、基因沉默等技术，从特定基因的改造到整体动物表型分析的“反向遗传学”研究大大推动了功能基因组学的进展，但是也存在明显的局限性：首先，由于生物体的代偿机制，使得基因敲除动物常常观察不到异常表型；其次，由于“反向遗传学”只能对已知基因进行研究而人类基因组中尚有90％以上的非编码序列处于未知状态；第三，由于“功能缺失”和“功能获得“小鼠常出现胚胎期死亡，而目前可用于条件性基因改造的启动子还很少，从而阻碍了特定基因在成体动物中的功能分析；第四，由于一个蛋白质有多个不同的功能域，特定基因在不同位点上的突变可能产生不同的表型，应用单一的”功能缺失”方法，显然不可能发现这些不同的异常表型。因此，只应用“反向遗传学”不足以完成功能基因组学的任务，而基千“正向遗传学”的、从异常表型到特定基因突变的随机突变筛选策略逐渐受到青眯。


生物化学与分子生物学 （三）用随机突变筛选策略鉴定基因功能 随机突变筛选策略的第一步是通过物理诱变、化学诱变或生物技术产生大量的基因组DNA突变。其中乙基亚硝基脉(ethyl nitrosourea, ENU)诱变是近年来发展起来的研究基因功能的新手段。ENU是一种化学诱变剂，它通过对基因组DNA碱基的烧基化修饰，诱导DNA在复制时发生错配而产生突变。它主要诱发单碱基突变，造成单个基因发生突变（双突变的情况非常少），更接近于人类遗传性疾病的基因突变情况。同时，ENU的突变效率非常高，可以达到0.2%，是其他突变手段的10倍左右。例如，经ENU处理可使雄鼠精子基因组发生点突变，进而使得后代小鼠有可能出现突变表型，经筛选及遗传试验即可得到突变系小鼠。通过对突变小鼠的深入研究、对突变基因定位以及位置候选法克隆突变序列，就会得到突变基因的功能信息。


生物化学与分子生物学 （三）用随机突变筛选策略鉴定基因功能 另外，基因捕获(gene trapping)技术也是一种产生大规模随机插入突变的便利手段，对于揭示基因序列所对应的基因功能具有重要的应用价值。基因捕获技术的基本过程是：将一个含报告基因的DNA载体随机插入基因组，产生内源基因失活突变，通过报告基因的表达，提示插入突变的存在以及内源基因的表达特点。利用基因捕获可以建立一个携带随机插入突变的ES细洲ji}470第五篇医学分子生物学专题胞库，每一种ES细胞克隆中含有不同的突变基因，ES细胞克隆经燥胚注射发育为基因突变动物模型，通过对动物模型的表型分析鉴定突变基因的功能。基因捕获技术可节省大量构建特异打靶载体以及筛选基因组文库的工作和费用，成为可同时对基因的序列、基因的表达以及基因的功能进行研究的高效技术。随机突变筛选策略能够获得研究基因功能的新材料以及人类疾病的新模型，这种”表型驱动”的研究模式有可能成为功能基因组学研究最有前景的手段和捷径之一。（四）利用基因编辑技术鉴定基因功能近几年来，越来越多专注千基因功能的研究取得了成功，同时，基因功能研究过程中所面临的诸多技术瓶颈也愈加凸显，以基因敲除／敲入等技术为中心的试验愈加不能满足功能研究与临床技术转化的需要。在过去一段时间中，以锌指核酸酶(zinc-finger nuclease, ZFN)和转录激活样效应因子核酸酶(transcription activator-like effector nuclease, TALEN)技术为代表的序列特异性核酸酶技术，以其能够高效率地进行定点基因组编辑，在基础研究、基因治疗和遗传改良等方面展示出了巨大的潜力。然而，由千ZFN和TALEN技术本身所存在的多种技术瓶颈，这两种技术并不能实现快速发展并满足各种科研和临床需求。令人振奋的是，最新问世的成簇规律间隔短回文重复(clustered regulatory interspaced short palindromic repeat, CRISPR)技术拥有其他基因编辑技术无可比拟的优势。通过不断的技术改进，CRISPR技术被认为能够在活细胞中最有效、最便捷地“编辑“任何基因。同时，基于CRISPR技术相对较低的实验成本和高成功率，该技术有望应用于临床药物研究与基因治疗，并巳在目前的商业化和临床转化过程中取得了令人瞩目的成就。


生物化学与分子生物学 （三）用随机突变筛选策略鉴定基因功能 CRISPR是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。CRISPR系统共分成3类，其中I类和皿类需要多种CRISPR相关蛋白质即Cas蛋白，共同发挥作用，而II类系统只需要一种Cas蛋白即可，因此目前CRISPR/Cas9系统应用最为广泛。


生物化学与分子生物学 （三）用随机突变筛选策略鉴定基因功能 Cas9蛋白含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物，然后通过PAM序列结合DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。优化和改造后的CRISPR/Cas9系统仅包括两个元素：Cas9蛋白和sgRNA(single guide RNA)。CRISPR/Cas9通过对预设的DNA位点进行切割，造成DNA双链断裂(doub le strand break, DSB)，细胞内的修复机制随即启动，主要包括两种修复途径：一是非同源末端连接途径(non-homologous end joining, NHEJ)，此修复机制非常容易发生错误，导致修复后发生碱基的缺失或插入，从而造成移码突变，最终达到基因敲除的目的。NHEJ是细胞内主要的DNA断裂损伤修复机制。利用靶向核酸酶可以在受精卵水平高效的实现移码突变，从而制备基因敲除模式动物。


生物化学与分子生物学 （三）用随机突变筛选策略鉴定基因功能 二是DNA断裂修复途径为同源介导的修复(homology-direct ed repair, HR)，这种基于同源重组的修复机制保真性高，但是发生概率低。在提供外源修复模板的情况下，靶向核酸酶对DNA的切割可以将同源重组发生的概率提高约1000倍。利用这种机制可以实现基因组的精确编辑，如：条件性基因敲除、基因敲入、基因替换、点突变等。 第三节疾病相关基因鉴定和克隆原则 确定疾病相关基因是一个艰巨复杂的系统工程，耗时耗钱，有的疾病基因的最终鉴定历时数十年。尽管人类基因组计划的完成，为疾病相关基因的鉴定提供了诸多的便利，但明确地解析疾病和某种基因的关系仍非易事，掌握鉴定疾病相关基因鉴定和克隆的原则，无疑将起到事半功倍作用，有助于鉴定疾病相关基因研究工作高效有序的开展。首先，确定疾病表型和基因实质联系是关键；其次，采用多途径、多种方法鉴定克隆疾病相关基因是手段；最终，确定候选基因，明晰基因序列的改变和疾病表型的关系，以了解基因致病的本质，是鉴定和克隆疾病相关基第二十五章基因结构功能分析和疾病相关基因鉴定克隆因的核心包。


生物化学与分子生物学 第三节疾病相关基因鉴定和克隆原则 —、鉴定克隆疾病相关基因的关键是确定疾病表型和基因间的实质联系疾病作为一种遗传性状，要确保其专一性和同质性。正确的疾病诊断非常重要。在一些复杂性疾病中，对疾病表型有必要进行进一步的分类，确保疾病的同质性，以减少临床的异质性。其次，需要确定疾病的遗传因素，即通过家系分析、李生子分析、领养分析和同胞罹患率分析等，确定遗传因素是否在疾病发病中的作用及其作用程度（遗传度）。在遗传因素作用较小的疾病中，鉴定并最终克隆疾病相关基因成功的可能性很小。一旦确定了遗传因素在疾病中的重要作用，就可进而确定存在千人类基因组中决定疾病表型的基因，确定该基因在基因组中的位置（位点）以及该位点和基因组其他位点的联系。


生物化学与分子生物学 第三节疾病相关基因鉴定和克隆原则 二、鉴定克隆疾病相关基因需要多学科多途径的综合策略鉴定疾病相关基因是一项艰巨的系统工程，需要多学科的紧密配合，针对不同疾病采用不同的策略。如图25-6所示，这些不同策略和方法互为补充，方可达到最终克隆疾病基因的目的。首动物模型病例家系数据库先通过对不同疾病家系的连锁分析，可粗略地将疾病的基因定位于某个染色体上。这些位点被称之为疾病的位点(locus)，此时确切的基因尚不明了。随着对某些疾病发病机制的了解，可以进一步阐明疾病相关的蛋白质的生物化学和细胞生物学特征，以此为切入点，寻找基因结构的异常，确定基因DNA碱基序列突变及其导致蛋白质结构或表达异常的分子机图25-6疾病相关基因鉴定克隆策略示意图制，最终克隆疾病的基因。疾病动物模型对千疾病相关基因的克隆具有重要帮助。对不同的疾病动物模型的研究，可以确定导致实验动物异常表型的基因，进而鉴定人类的同源基因在疾病中的作用。借助生物信息数据库中有关待定基因的信息，也可极大地促进疾病相关基因克隆的效率。


生物化学与分子生物学 第三节疾病相关基因鉴定和克隆原则 三、确定候选基因是多种克隆疾病相关基因方法的交汇有许多途径能够达到最终鉴定疾病相关基因的目的，这些方法最终将交汇在候选基因上。一旦候选基因被鉴定，即可筛检病人中该基因的突变。候选基因可不依赖其在染色体位置而予以鉴定，但常用的策略仍然是首先找出候选染色体区域，然后在此区域内鉴定候选基因。人类基因组计划的完成提供了人类所有基因的信息。尽管从众多的候选基因中寻找基因突变，仍然是一项耗时的工作，但鉴定候选基因较以往还是相对容易。这是由于位置信息从2万个的基因降低到候选区域的10~30个基因。在候选区域内预测可能的候选基因并非易事，目前仍然缺乏这样的能力。需要的是大量重复、逐个排除，最终确定候选基因的突变以及这种突变和疾病的联系。 第四节疾病相关基因鉴定克隆的策略和方法 鉴定和克隆疾病相关基因的策略和方法主要包括，不依赖染色体定位的疾病相关基因克隆策略、定位克隆法、常见病的基因需要全基因组关联分析和全外显子测序法，以及生物信息数据库贮藏丰富的疾病相关基因信息检索法。


生物化学与分子生物学 472第五篇医学分子生物学专题 —、疾病相关基因鉴定和克隆可采用不依赖染色体定位的策略不依赖染色体定位的疾病相关基因克隆策略包括功能克隆、表型克隆及采用位点非依赖的DNA序列信息和动物模型来鉴定和克隆疾病基因。（－）从已知蛋白质的功能和结构出发克隆疾病基因在掌握或部分了解基因功能产物蛋白质的基础上，鉴定蛋白质编码基因的方法，称之为功能克隆(funct ional cloning)。这是相对于利用基因位置克隆基因的定位克隆而言的。该方法采用的是从蛋白质到DNA的研究路线，针对的是一些对影响疾病的功能蛋白具有一定了解的疾病，如血红蛋白病、苯丙酮尿症等出生缺陷引起的分子病可以采用这个方法定位和克隆疾病基因。


生物化学与分子生物学 472第五篇医学分子生物学专题 1.依据蛋白质的氨基酸序列信息鉴定克隆疾病相关基因如果疾病相关的蛋白质在体内表达丰富，可分离纯化得到一定纯度的足量蛋白质，就可用质谱或化学方法进行氨基酸序列分析，获得全部或部分氨基酸序列信息。在此基础上设计寡核昔酸探针，用于筛查cDNA文库，可筛选出目的基因。使用这种策略时，必须考虑到密码子的简并性特点，即除了甲硫氨酸和色氨酸仅有1个密码子外，其余氨基酸均有2个或2个以上的密码子。设计探针时应尽量避开有简并密码子的区域，但实际上往往难以做到。为此可以设计1套可能含有全部简并密码子信息的寡核背酸探针，用此混合探针去筛查cDNA文库，＂钓出“目的基因克隆。除cDNA文库筛查技术外，目前还可采用部分简并混合寡核昔酸作为PCR引物，采用多种的PCR引物组合，以获得候选基因的PCR产物。


生物化学与分子生物学 472第五篇医学分子生物学专题 上述方法曾成功地用于锄状细胞贫血的基因克隆。首先，免疫电泳等方法已经显示出锦状细胞贫血病入的珠蛋白异常，获得部分氨基酸残基序列后，设计了简并寡核昔酸探针，筛选有核红细胞系的cDNA文库，得到了a珠蛋白基因的cDNA，与正常入的cDNA比较，发现了a珠蛋白基因变异。进而找出cDNA探针与染色体DNA序列间的同源互补关系，将人的a珠蛋白基因定位于第16号染色体上，并在此基础上，提出了分子病(molecular disease)的概念。2.用蛋白质的特异性抗体鉴定疾病基因有些疾病相关的蛋白质在体内含量很低，难以纯化得到足够纯度的蛋白质用于氨基酸序列测定。但是少量低纯度的蛋白质仍可用于免疫动物获得特异性抗体，用以鉴定基因。获得的抗体一方面可用于直接结合正在翻译过程中的新生肤链，此时会获得同时结合在核糖体上的mRNA分子，最终克隆未知基因；另外，特异性抗体也可用来筛查可表达的cDNA文库，筛选出可与该抗体反应的表达蛋白质的阳性克隆，进而可获得候选基因。


生物化学与分子生物学 472第五篇医学分子生物学专题 功能克隆仍然是单基因疾病基因克隆的常用策略。其缺点是特异功能蛋白质的确认、鉴定及其纯化都相当困难，微量表达的基因产物在研究中难以获得，因而几乎不能用于多基因疾病的基因分离。


生物化学与分子生物学 （二）从疾病的表型差异出发发现疾病相关基因 表型克隆(phenotype cloning)是疾病相关基因克隆领域中一个新的策略。该策略的原理是基千对疾病表型和基因结构或基因表达的特征联系已经有所认识的基础上来分离鉴定疾病相关基因。依据DNA或mRNA的改变与疾病表型的关系，可有几种策略：第一种策略是从疾病的表型出发，比较病人基因组DNA与正常人基因组DNA的不同，直接对产生变异的DNA片段进行克隆，而不需要基因的染色体位置或基因产物的其他信息。例如，在一些遗传性神经系统疾病中，病人基因组中含有的三联重复序列的拷贝数可发生改变，并随世代的传递而扩大，称为基因的动态突变。此时，采用基因组错配筛选(genome mismatch scannin g)、代表性差异分析(represen tative difference analysis, RDA)等技术即可检测病人的DNA是否有三联重复序列的拷贝数增加，从而确定患病原因。


生物化学与分子生物学 （二）从疾病的表型差异出发发现疾病相关基因 第二种策略是针对已知基因。如果高度怀疑某种疾病是由千某个特殊的已知基因所致，可通过比较病人和正常对照间该基因表达的差异，来确定该基因是否为该疾病相关基因。常用分析方法有Northern印迹法、RNA酶保护试验、RT-PCR及实时定量RT-PCR等。第三种策略是针对未知基因的，可通过比较疾病和正常组织中的所有mRNA的表达种类和含量间的差异，从而克隆疾病相关基因。这种差异可能源千基因结构改变，也可能源于表达调控机制的改变。常用的技术有mRNA差异显示(mRNA differential display, mRNA-DD)、抑制消减杂交(suppress i vesubtractive hybridization, SSH)基因表达系列分析(SAGE)、cDNA微阵列(cDNA microarray)和基因鉴定集成法(integrated procedure for gene id entification)等。这里仅分别介绍RDA和mRNA-DD技术。


生物化学与分子生物学 （二）从疾病的表型差异出发发现疾病相关基因 1. RDA技术是建立在核酸差异杂交基础上的PCR技术RDA是通过对正常和疾病组织的cDNA差异片段（即代表性片段）的扩增，从而使其被检测和捕获的技术。基本原理是，首先用PCR方法从拟比较的疾病和正常组织获得足够量的DNA或cDNA片段；然后进行差异杂交，杂交后再用不同引物进行第二次PCR反应；在第二次PCR反应中，只有两个样品中结构或表达量有差异的DNA片段可以得到扩增（图25-7)。


生物化学与分子生物学 检测DNA检测mRNA驱动DNA驱动mRNAt酶切i逆转录，酶切酶切i t逆转录，酶切-~或cDNA片段DNA或cDNA片段＝＝＝＝＝＝炉u接头亏t加接头宫t第一次PCR扩增第一次PCR扩增i Il1-=}检测扩增子驱动扩增子'I，II}}'IIIIII+切去旧接头＝t切去接头其基本步骤是：(j)DNA片段制备：分别提取正常人基因组DNA（检测DNA)和病人基因组DNA（驱动DNA)，用限制性内切酶消化DNA，获得长度在150-lOOObp之间的片段；＠获得扩增子：在两组的所有DNA片段上加上接头，以接头的互补序列为引物，进行第一步PCR扩增，所获得扩增产物称扩增子(amplicon)；＠更换接头：切去所有扩增子的接头，仅在检测扩增子上加上新的接头；＠筛选扩增产物：按1:100的比例混合检测扩增子和驱动扩增子，进行液相杂交。取少量杂交反应物为模板，以新的接头为引物再进行第二次PCR扩增，即可筛选出两组DNA样品间的差异片段。


生物化学与分子生物学 检测DNA检测mRNA驱动DNA驱动mRNAt酶切i逆转录，酶切酶切i t逆转录，酶切-~或cDNA片段DNA或cDNA片段＝＝＝＝＝＝炉u接头亏t加接头宫t第一次PCR扩增第一次PCR扩增i 检测DNA和驱动DNA间片段在第二次PCR反应中依据两者间是否有差异，主要可以出现两种情况:(j)两组间相同的DNA片段不会得到大量扩增。这是因为在杂交反应中，驱动DNA片段的数目远大于检测DNA，将优先结合检测DNA，使得检测DNA分子间几乎没有机会形成同源复性双链。因此，利用新接头进行的二次PCR反应过程将不会有扩增产物。＠两者的差异片段可得到扩增。如果检测DNA中存在的某一片段在驱动DNA中缺失，或由于突变而失去了互补结合能力，在杂交反应中就不存在来自驱动DNA中的同源片段的竞争，检测DNA自身可以发生复性，且由于复性的双链DNA两端都具有新接头，因而可以实现PCR的大凰扩增。该片段即为候选的疾病相关DNA序列。虽然反应中无差异片段还会存在一些被扩增的可能，但产物量较小，可以被排除。RDA也可用于mRNA差异表达基因的克隆，只是需要先将mRNA逆转录成cDNA片段。RDA技术对正常和异常的DNA片段区分能力强、富集效率高、对起始材料要求低，利用RDA人们已经发现了多个疾病相关新基因。｀叩f}474第五篇医学分子生物学专题2. mRNA-DD是RT-PCR技术和聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的结合mRNA-DD又称为差异显示逆转录PCR(mRNA differential display reverse transcription PCR,DDRT-PCR)方法。该法利用可以扩增所有哺乳类生物mRNA的几条5'－端随机引物和几条3'－端铀定引物组合，用PCR的方法扩增正常人和患病个体的相应组织的cDNA。用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物，比较两组间产物的差异（图25-8)。依据理论计算，该方法所设计的组合引物可以与所有mRNA的poly(A)尾匹配，因而对于种类和含量相同的cDNA样品，PCR产物的种类多少和分布应该是完全一样的。如果在正常和病人的cDNA标本中扩增出一些不同长度的cDNA片段，它们所代表的cDNA就有可能与疾病状态相关。这一方法的优点在于所需mRNA量少、较快速、可同时显示多种生物性状的差异、可同时获得高表达和低表达的基因等。这种方法同时也存在许多严重的缺陷，如假阳性率高达70%、获得的片段太短等，很难直接判断其功能和意义。尽管有上述缺陷，但因其步骤较简单，可获得较大量信息，在实际工作中该法应用仍较多。


生物化学与分子生物学 检测DNA检测mRNA驱动DNA驱动mRNAt酶切i逆转录，酶切酶切i t逆转录，酶切-~或cDNA片段DNA或cDNA片段＝＝＝＝＝＝炉u接头亏t加接头宫t第一次PCR扩增第一次PCR扩增i  检测mRNA对照mRNANM(T11)引物逆转录差异条带（三）采用动物模型鉴定克隆疾病相关基因 人类的部分疾病，已经有相应的动物模型。如果动物某种表型的突变基因定位于染色体的某一部位，而具有相似人类疾病表型的基因很有可能存在于人染色体的同源部位已。另外，当疾病基因在动物模型上已完成鉴定，还可以采用荧光原位杂交来定位分离人的同源基因。肥胖相关的瘦蛋白(leptin)基因的克隆就是一个成功例证。利用突变的肥胖近交系小鼠通过定位克隆分离得到了位千小鼠6号染色体的瘦蛋白基因，依据小鼠瘦蛋白基因侧翼标记，将人的瘦蛋白基因定位千人染色体7q31区。小鼠和人的瘦蛋白基因有84％的同源性，编码167个氨基酸残基的分泌性蛋白一瘦蛋白，其主要功能是控制食物的摄入，促进能量的消耗。肥胖小鼠和一些遗传性肥胖症病人均具有该基因的缺损，导致基因功能丧失。


生物化学与分子生物学 二、定位克隆是鉴定疾病相关基因的经典方法 仅根据疾病基因在染色体上的大体位置，鉴定克隆疾病相关基因，称之为定位克隆(positional cloning)。定位克隆的起点是基因定位，即确定疾病相关基因在染色体上的位置，然后根据这一位置信息，应用DNA标记将经典的遗传学信息转换为遗传标记所代表的特定基因组区域，再以相关基因组区域的相连重叠群(contig)筛选候选基因，最后比较病人和正常人这些基因的差异，确定基因和疾病的关系已。人类基因组计划后所进行的定位候选克隆，是将疾病相关位点定位千某一染色体区域后，根据该区域的基因、EST或模式生物对应的同源区的已知基因等有关信息，直接进行基因突变筛查，通过多次重复，最终确定疾病相关基因。 （－）基因定位的方法有多种 基因定位(gene location)是基因分离和克隆的基础，目的是确定基因在染色体的位置以及基因在染色体上的线性排列顺序和距离。可从家系分析、细胞、染色体和分子水平等几个层次进行基因定位，由千使用手段的不同可派生出多种方法，不同方法又可联合使用，相互补充。


生物化学与分子生物学 （－）基因定位的方法有多种 3.染色体异常有时可提供疾病基因定位的替代方法从基因定位克隆的角度来看，对于任何巳知与染色体异常(chromosome abnormalities)直接相关的疾病来说，染色体的异常本身就成为疾病定位基因克隆的一个绝好的位置信息。染色体的异常有时可替代连锁分析，用于定位疾病基因。在一些散发性、严重的显性遗传病，染色体变异分析是获得候选基因的唯一方法。有时可直接获得基因的正确位置，而无需进行连锁分析，例如染色体的平衡易位和倒位等。诸如多嵌肾、巨肠症、假肥大型肌营养不良基因的定位在很大程度上借助千染色体的异常核型表现。如果细胞学观察的染色体异常与某一基因所表达的异常同时出现，即可将该基因定位千这一染色体的异常区域内。例如对一具有6号染色体臂间倒位的家系分析表现，凡是有此倒位者，同时也都有某－H队等位基因的表达；而家族中无此倒位者，也无该等位基因的表达，因此将该H且基因定于6号染色体短臂的远侧区。


生物化学与分子生物学 （－）基因定位的方法有多种 染色体非整倍体分析中，可通过基因剂量法进行基因定位。在Down综合征（核型47,+21)的病人中过氧化物歧化酶－1的活性比正常人高I.5倍，因此将该酶基因定位于21号染色体上。但是并非所有基因的拷贝数都有明显的剂量效应作用。


生物化学与分子生物学 （－）基因定位的方法有多种 4.连锁分析是定位疾病未知基因的常用方法基因定位的连锁分析(linkage analysis)是根据基因在染色体上呈直线排列，不同基因相互连锁成连锁群的原理，即应用被定位的基因与同一染色体上另一基因或遗传标记相连锁的特点进行定位。如果待定基因与标记基因呈连锁遗传，即可推断待定基因与标记基因处千同一染色体上，并且依据和多个标记基因连锁的程度（用两者间的重组率度量），可确定待定基因在染色体的排列顺序以及和标记基因间的遗传距离（用cM表示）。例如已知血炕」i}476第五篇医学分子生物学专题型基因Xs定位于X染色体上，普通鱼鳞病和眼白化病基因与其连锁，因此判定这两个基因也在X染色体上，计算病人子代的重组率，即可确定这些基因间的相对距离。（二）定位克隆疾病相关基因的过程包括三大步骤定位克隆疾病相关基因是鉴定遗传性疾病基因的主要手段，在早期的疾病基因鉴定工作中发挥了不可替代的作用，也获得了巨大的成功。随着人类基因组计划的完成，采用定位克隆疾病基因的方法，更加容易实施，其主要的过程包括三个步骤。


生物化学与分子生物学 （－）基因定位的方法有多种 1.尽可能缩小染色体上的候选区域定位克隆疾病基因困难的大小取决于染色体候选区域的宽窄。为此要尽可能地缩小疾病相关基因在染色体上的候选区域。在单基因疾病基因的遗传制图时，需要选择更多的遗传标记，找出遗传距离最近的标记，增加更多的家系、建立所有个体的单倍体型等，以增加发现重组机会，结合寻找更多连锁不平衡，精确疾病相关基因的候选区域。2.构建目的区域的基因列表由于入类基因组计划的完成，各种DNA分子水平上物理图谱的建立，已经使得疾病相关基因的克隆变得较为容易。现在已无需建立DNA重叠群，直接使用人类基因组的数据库，如基因组阅览器Ensembl(http:ll www. ensemble. org)或者the Santa Cruz阅览器(http:II genome. cse. ucsc. edu)就可直接显示候选区域巳肯定或可能的基因，但也不能完全依赖这些信息，要仔细检查重叠的拼装是否正确。当然，还要结合ENCODE计划的结果、非编码序列、选择性转录本等表达谱，获得更多候选区域的基因信息。3.候选区域优先考虑基因的选择及突变检测为了鉴定突变，对无血缘关系的病人要进行DNA测序。可以测定候选区域所有的外显子，也可测定优先考虑基因的外显子，取决于研究策略、人力和财力的投入。可根据下列清况考虑该基因为优先考虑的基因：CD合适的表达：一个好的候选基因的表达模式应该和疾病表型相一致，该基因不一定特征性表达于病变组织，但至少在疾病发生前或发生时，疾病组织表达该基因，如神经管缺损的基因应该在神经管闭锁前，即人胚胎发育的3~4周表达。＠合适的功能：候选区域的基因功能，如果已知，就易于作出决定。如fibrilli n和结缔组织疾病Marfan综合征的关系。一个新基因序列的分析提示有某种功能，如有跨膜基序或酪氨酸激酶基序等，就可和疾病的发病机制联系起来，作出判断。＠同源性和功能关系：如果候选区域一个基因和已知的基因同源，不管是与入的间接同源(paralog)，还是与其他种的直接同源(orthol og)，而且也知道同源基因突变引起的相类似表型，该基因就有可能是疾病基因。候选基因的确定也可基于密切的功能关系，如受体和配体的关系，同一代谢或发育途径的组分等。近年来，对模式生物基因功能的认识，更多的同源基因的表型被鉴定，极大地促进了人类致病基因的鉴定克隆工作。


生物化学与分子生物学 （－）基因定位的方法有多种 （三）假肥大型肌营养不良基因的克隆是定位克隆的成功例证采用定位克隆策略鉴定的第一个疾病相关基因是X连锁慢性肉芽肿病基因。而假肥大型肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy, D MD)基因的成功克隆，更彰显了基因定位克隆的优势。这项工作主要分两个阶段。首先，根据患病女性X染色体与第21号常染色体的易位，以及男患儿发生小的Xp21.2缺失并伴发三种其他X连锁隐性遗传病，再运用RFLP连锁分析将DMD基因定位于Xp21。然后，分别克隆得到了基因的2个不同的片段，分别命名为XJ系列探针和pERT87系列探针，根据两片段的比较，证明DMD基因约为2300kb，占X染色体的1％以上，该基因编码肌营养不良蛋白(dystrophin)，影响横纹肌和心肌的结构和收缩功能。


生物化学与分子生物学 （－）基因定位的方法有多种 三、确定常见病的基因需要全基因组关联分析和全外显子测序基因连锁分析在定位克隆遗传性疾病的基因取得了成功，尽管鉴定复杂性疾病的易感基因采用了如罹患姊妹对(affec ted sib pa江，ASP)分析方法，也取得一些成功的例子，但总体来说，并不理想。从2005年以来，基于连锁不平衡(linkage disequilibrium)理论发展而来的全基因组关联研究(genomewide association study, GWAS)，在复杂疾病的基因定位克隆中，发挥了巨大的作用。GWAS方法是一种在无假说驱动的条件下，通过扫描整个基因组观察基因与疾病表型之间关联的研究手段尽。具体操作中，通常收集成千上万个病人和对照的DNA标本，利用高通量芯片进行SNP的基因定型，进一步通过统计学分析，确定分子SNP位点和疾病表型的关系。该方法已成功鉴定了常见多发病的多种基因位点，不仅有效简化了常见病的相关基因鉴定过程，而且为研究疾病的发病机制和干预靶点提供了极有价值的信息。不过该技术对研究团队的经济实力，合作性，生物信息学水平以及庞大假阳性数据排查能力都有很高的要求，且只涉及常见等位基因的变异。


生物化学与分子生物学 （－）基因定位的方法有多种 全外显子测序(whole exon sequencing)技术则可对全基因组外显子区域DNA富集从而进行高通量测序，它选择性地检测蛋白质编码序列，可实现定位克隆，对常见和罕见的基因变异都具有较高灵敏度，仅对约1％的基因组片段进行测序就可覆盖外显子绝大部分疾病相关基因变异，其高的性价比使其在复杂疾病易感基因的研究中颇受推崇。四、生物信息数据库贮蔽丰富的疾病相关基因信患入类基因组计划和多种模式生物基因组测序的完成，生物信息学的发展，计算机软件的开发应用和互联网的普及，人们通过已获得的序列与数据库中核酸序列及蛋白质序列进行同源性比较，或对数据库中不同物种间的序列比较分析、拼接，预测新的全长基因等，进而通过实验证实，从组织细胞中克隆该基因，这就是所谓的电子克隆(in silica cloning)。


生物化学与分子生物学 （－）基因定位的方法有多种 人类新基因克隆大都是从同源EST分析开始的。应用同源比较，在人类EST数据库中，识别和拼接与已知基因高度同源的人类新基因的方法包括：O以已知基因cDNA序列对EST数据库进行搜索分析，即BLAST(Basic Local Alignment Se釭ch Tool)，找出与已知基因cDNA序列高度同源的EST;＠用Seqlab的Fragment Assembly软件构建重叠群，并找出重叠的一致序列；＠比较各重叠群的一致序列与已知基因的关系；＠对编码区蛋白质序列进行比较，并与已知基因的蛋白质的功能域进行比较分析，推测新基因的功能；＠用新基因序列或EST序列对序列标签位点(sequence-tagged site, STS)数据库进行BLAST分析，如果某一EST（非重复序列）与某一种STS有重叠，那么，STS的定位即确定了新基因的定位。电子克隆充分利用网络资源，可大大提高克隆新基因的速度和效率。由于数据库的不完善、错误信息的存在及分析软件的缺陷，电子克隆往往难以真正地克隆基因，而是一种电子辅助克隆。


生物化学与分子生物学 （－）基因定位的方法有多种 结构基因编码区的确定、启动子、转录起始点确定和其他顺式元件的确定是了解基因表达的关键。分析编码序列的技术包括数据库搜索法、cDNA文库法、RNA剪接法等；研究启动子结构的技术包括生物信息学预测法、启动子克隆法、核酸－蛋白质相互作用分析法等；研究真核生物结构基因转录起点序列的技术包括数据库搜索法、cDNA克隆直接测序法、5'-cDNA末端快速扩增法、连续分析法等。其他顺式作用元件主要包括增强子、沉默子、绝缘子等，都可以参与基因表达调控。分析基因表达丰度的技术包括Southern印迹、PCR和DNA测序法等。分析基因表达的产物可采用组学方法和特异性测定方法。通过检测RNA和蛋白质／多肤可分别揭示基因在转录水平和翻译水平的表达特征。栓测RNA的技术包括RNA印迹、原位杂交、核糖核酸酶保护实验、cDNA芯片等；梒测蛋白质／多肤的技术包括蛋白质印迹、酶联免疫吸附实验、免疫组化、流式细胞术、蛋白质芯片等。


生物化学与分子生物学 （－）基因定位的方法有多种 基因的功能由基因表达产物体现，也就是编码基因的蛋白质功能和非编码基因RNA的功能。基因产物的功能可以从三个不同水平来描述，即生物化学水平、细胞水平和整体水平的功能。生物信息学的同源序列比对、细胞水平高表达或低表达基因（反义技术、RNA干涉和基因编辑）技术、蛋白质与蛋白质相互作用技术和整体水平的转基因技术、基因敲除小鼠动物模型等，都是目前进行基因功能研究的有效手段。由于基因的功能必须在完整的生物个体及其生命过程中才能得到完整的体现，因此，从整体水平研究基因的功能是必然的选择。鉴定基因功能的策略包括功能荻得策略（如转基因、基因敲入技术）、功能失活策略（如基因敲除、基因沉默技术）、随机突变筛选策略及基因编辑技术等。基\(',1i478第五篇医学分子生物学专题因编辑技术近年来发展迅猛，主要ZFN、TALEN技术以及CRISPR技术，其中CRISPR技术通过不断的技术改进，被认为能够在活细胞中最有效、最便捷地“编辑“任何基因。


生物化学与分子生物学 （－）基因定位的方法有多种 疾病相关基因的鉴定和克隆，可采取非染色体定位的基因功能鉴定和定位克隆两类策略。前者包括功能克隆、表型克隆及采用位置非依赖的DNA序列信息和动物模型来鉴定和克隆疾病基因；后者则是先进行基因定位作图，确定疾病相关基因在染色体上的位置，然后寻找来自该区的基因并进行克隆，采用包括体细胞杂交法、原位杂交法、连锁分析及染色体异常定位来克隆疾病相关基因。假肥大肌营养不良基因的克隆是定位克隆策略应用的成功范例。1.简述分析基因TSS、启动子、编码序列以及拷贝数的主要方法及原理。 第二十六章基因诊断和基因治疗 人类大多数疾病都与基因变异相关。人体自身基因结构与功能发生异常，以及外源性病毒、细菌的致病基因在人体的异常表达，都可以引起疾病。从基因水平检测和分析疾病的发生，确定发病原因及疾病的发病机制，评估个体对疾病的易感性，进而采用针对性的手段矫正疾病紊乱状态，是现代医学发展的新方向。基因诊断(gene diagnosis)和基因治疗(gene therapy)已成为现代分子医学的重要内容之一。


生物化学与分子生物学 第一节基因诊断 基因诊断最早的医学实践始于1976年，美国加州大学旧金山分校的华裔科学家Y. W. Kan博士利用DNA片段多态性分析技术，对嫌状细胞贫血这一遗传性血红蛋白病进行了特异性产前诊断，开创了基因诊断的历史先河。伴随着临床手段的不断进步，基因诊断技术已经逐步地从实验研究进入临床应用阶段，作为一种新的诊断模式，基因诊断在许多重大疾病的早期诊断、鉴别诊断、分期分型、疗效判断、预后的预测等方面显示了独特的优势，广泛地应用于遗传性疾病、感染性疾病及肿瘤等疾病的诊断，使基因诊断技术在临床应用方面的作用逐步得到凸显。


生物化学与分子生物学 —、基因诊断的概念及特点（一）基因诊断是针对DNA和RNA的分子诊断 人类遗传病的基因诊断是分析遗传信息携带分子的序列，从而在分子水平上确定疾病的病因所在。从广义上说，凡是用分子生物学技术对生物体的DNA序列及其产物（如mRNA和蛋白质）进行的定性、定量分析，都称为分子诊断(molecular diagnosis)。从技术角度讲，目前的分子诊断方法主要是针对DNA分子的，涉及功能分析时，还可定量检测RNA（主要是mRNA)和蛋白质等分子。通常将针对DNA和RNA的分子诊断称为基因诊断(gene diagnosis)。因为绝大部分疾病的表型是由基因结构及其功能异常或外源性病原体基因的异常表达造成的，这也是疾病发生的根本原因。因此以遗传物质作为诊断目标，可以在临床症状和表型发生改变前作出早期诊断，属于病因诊断，并且基因诊断的结果还能够提示疾病发生的分子机制。大多数疾病的发生过程都存在基因结构和表达水平的改变。单基因病主要由病人某种基因突变，致使其编码的蛋白质的生物学功能发生改变。如迪谢内肌营养不良(Duchenne muscul狙．dystrophy, DMD)是X染色体隐性遗传疾病，抗肌萎缩蛋白(dystrophin)基因突变所致肌萎缩蛋白缺乏或功能异常是导致疾病发生的根本原因；心血管疾病、糖尿病、高血压、阿尔茨海默病等疾病不具有典型的孟德尔遗传模式，这一类疾病具有明显的家族遗传倾向，与某些遗传标记有显著的关联性，其致病原因尚未清楚，可能与基因组多个较微弱的基因效能累加有关，称为遗传学疾病或多基因病，肿瘤的发生发展具有多因素和多阶段性，在每一个阶段可能发生基因结构与功能的改变；而对于感染性疾病来说，病原体的侵入必定使病人体内存在病原体的遗传物质。基因诊断正是通过检测与分析基因结构与功能（包括外源病原体基因）及基因表达的异常改变，从而对疾病进行诊断。


生物化学与分子生物学 —、基因诊断的概念及特点（一）基因诊断是针对DNA和RNA的分子诊断  （二）基因诊断在疾病诊断上具有独特的优势 早期医学诊断是根据病人的临床症状和体征来进行判断，随着检验技术手段的提升，逐步发展为480第五篇医学分子生物学专题以疾病的表型改变为依据，而大部分疾病的表型改变缺乏特异性，并且往往是在疾病的中晚期才出现，常常不能作出及时准确的诊断。相比之下基因诊断不依赖疾病表型改变，直接以致病基因、疾病相关基因、外源性病原体基因或其表达产物为诊断对象，具有特异性强、灵敏度高、可早期诊断、应用性广的独特优势。1.特异性强基因诊断是以基因结构（包括病人自身基因和外源性病原体基因）及其表达产物(RNA或蛋白质）为检测对象，而不是疾病表型。由于基因的突变及其功能异常、外源性病原体基因的存在是疾病发生的根本原因，因此，基因诊断属于病因诊断，具有高度的特异性。采用分子生物学技术能够检测出这些特异的碱基序列，从而判断病人是否发生与携带某些基因突变，以及是否存在外源性病原体基因，从而作出特异性诊断。


生物化学与分子生物学 （二）基因诊断在疾病诊断上具有独特的优势 2.灵敏度高基因诊断常利用PCR和核酸杂交的技术手段。PCR技术可将待测核酸样品进行特异性高效扩增达百万倍，亦可以对极其微量的几个细胞、一根头发、一滴血迹、组织切片和石蜡包埋组织块中的DNA进行高效扩增。而核酸杂交技术利用核酸杂交的特异性，由于使用了具有生物催化活性的酶、放射性核素标记或荧光素标记的高灵敏度探针来检测，因此，具有很高的灵敏度。目前临床上，常常把核酸杂交技术与PCR技术联合使用，用千检测微量的病原体基因及其拷贝数极少的各种基因突变，具有较高的灵敏度。 二、基因诊断的样品来源广泛 临床上可用于基因诊断的样品有血液、组织块、羊水和绒毛、精液、毛发、唾液和尿液等。在选择被测样品时，可根据材料来源和分析目的提取其基因组DNA或各种RNA，后者可经逆转录形成cDNA。RNA的分析必须用新鲜样品。在开展胎儿DNA诊断时，除传统的羊水、绒毛和肪带血样品外，从母亲外周血中提取胎儿细胞或胎儿DNA的先进技术已经初步应用千临床实践。


生物化学与分子生物学 二、基因诊断的样品来源广泛 进行基因诊断的前提是疾病表型与基因型的关系已被阐明（见第二十五章）。人类遗传病的表型是由个体基因型决定的，故对遗传病的诊断也可理解为进行个体的基因分型。 三、基因诊断的基本技术日趋成熟 基因诊断包括检测个体的基因序列特征、基因突变、基因的拷贝数以及是否存在病原体基因等。基因诊断技术可分为定性和定证分析两类技术。基因分型和检测基因突变属于定性分析，测定基因拷贝数及基因表达产物量则属千定量分析。在检测外源感染性病原体基因时，定性分析可诊断其在人体存在与否，而定蜇分析则可确定其含量。从理论上来讲，所有检测基因表达水平或基因结构的方法都可用千基因诊断。基因诊断的基本方法几乎全部基于核酸分子杂交和PCR技术，或上述两种技术的联合应用。常用于基因诊断的基本方法主要有核酸分子杂交技术、PCR、DNA测序和基因芯片技术等。


生物化学与分子生物学 （一）核酸分子杂交技术是基因诊断的基本方法 核酸分子杂交技术是基因诊断的最基本的方法之一。不同来源的DNA或RNA在一定的条件下，通过变性和复性可形成杂化双链。因此通过选择一段已知序列的核酸片段作为探针（见第二十四章），对其放射性核素、生物素或荧光染料进行标记，然后与目的核酸进行杂交反应，通过标记信号的检测就可以对未知的目的核酸进行定性或定量分析。1. DNA印迹法Southern印迹(Southern blotting)又称DNA印迹（见第二十四章），是最为经典的基因分析方法，不但可以检测特异的DNA序列，还能用于进行基因的限制性内切核酸酶图谱和基因定位，可以区分正常和突变样品的基因型，并可获得基因缺失或插入片段大小等信息。DNA印迹一般可以显示50-20OOObp的DNA片段，片段大小的信息是该技术诊断基因缺陷的重要依据包。DNA印迹实验结果可靠，但操作繁琐，费时费力，而且要使用放射性核素，这些因素使其难以作为一种常规的临床诊断手段得以广泛开展。


生物化学与分子生物学 （一）核酸分子杂交技术是基因诊断的基本方法 2. Northern印迹法Northern印迹法(Northern blotting)是通过标记的DNA或RNA探针与待测样本RNA杂交，能够对组织或细胞的总RNA或mRNA进行定性或定量分析，及基因表达分析。N01them印迹杂交对样品RNA纯度要求非常高，限制了该技术在临床诊断中的应用。3.斑点杂交斑点杂交(dot blot hybridization)是核酸探针与支待物上的DNA或RNA样品杂交，以检测样品中是否存在特异的基因或表达产物，该技术可用千基因组中特定基因及其表达产物的定性与定量分析。斑点杂交方法应用于基因诊断具有简便、快速、灵敏和样品用量少的优点。不足之处在于无法测定目的基因的大小，特异性较低，有一定比例的假阳性。


生物化学与分子生物学 （二）PCR技术是特异、快速的基因诊断方法 PCR技术（见第二十四章）能够极其快速、特异性地在体外进行基因或DNA片段的扩增，具有较高的灵敏度。近年来，以PCR为基础的相关实验技术发展迅速，RT-PCR、QRT-PCR、FQ-PCR及in situ PCR等技术广泛地应用于致病基因的发现、核酸序列分析、DNA多态性分析、遗传疾病及感染性疾病的基因诊断、法医鉴定及个体识别等领域。在临床上，应用PCR技术可以对已知序列或已知部分序列的基因进行检测，或采用PCR技术扩增出已知DNA片段后与其他技术联合应用，衍生出了多种基因诊断技术。


生物化学与分子生物学 （二）PCR技术是特异、快速的基因诊断方法 1.直接采用PCR技术进行基因诊断PCR技术可以直接用于检测待测特定基因序列的存在与缺失。分析疾病相关基因的缺失或突变，或者据此确定病原体基因存在与否。如跨越基因缺失或插入部位的PCR技术，又称裂口PCR(gap-PCR)，因其简便灵敏而更适用于临床诊断。该方法的思路是：设计并合成一组序列上跨越突变（缺失或插入）断裂点的引物，将待测DNA样本进行PCR扩增，叩482第五篇医学分子生物学专题然后进行琼脂糖凝胶电泳，从扩增片段的大小直接判断是否存在缺失或插入突变。又如多重PCR是一种实用可靠的检测DNA缺失的常用方法，其基本原理是在一次PCR反应中加入多种引物，对一份DNA样本中的不同系列片段进行扩增，每对引物扩增的产物长度不一。可以根据电泳图谱上不同长度DNA片段存在与否，判断某些基因片段是否发生缺失或突变。


生物化学与分子生物学 （二）PCR技术是特异、快速的基因诊断方法 2. PCR－等位基因特异性寡核苦酸分子杂交检测点突变的有效技术是等位基因特异性寡核昔酸(allele specific oligonucleotide, ASO)分子杂交。采用PCR-ASO杂交技术可以检测基因上已知的点突变、微小的缺失或插入。首先使用PCR扩增受检者的目标DNA片段，然后用设计好的ASO探针进行杂交，检测受检者是否存在基因突变及基因突变是杂合子还是纯合子。图26-1显示以B地中海贫血珠蛋白基因的第17个密码子(CD17)的点突变检测为例的ASO原理示意图。首先，设计合成包含突变位点在内的正常和突变的寡核昔酸探针。将这两个探针进行标记，再分别与待检DNA样品的PCR扩增产物进行杂交和检测。正常人只能与正常序列的ASO探针杂交，突变纯合子只能与突变序列的ASO探针杂交，而突变杂合子则能与两种探针产生杂交信号。


生物化学与分子生物学 常变正突因基 图26-113地中海贫血CD17点突变的ASO分子杂交l．正常探针检测孔；2.突变探针检测孔。每一纵行排列的两个点样斑代表一个样品，杂交时沿上下中线剪成两张膜条，分别与正常（上半部分）和突变（下半部分）探针杂交。三个样品的检测结果分别为正常(A)、突变纯合子(B)和突变杂合子(C)反向点杂交(reverse dot blot, RDB)是改进的ASO技术。ASO分子杂交虽然可以准确地进行已知突变的基因分型，但由于一种突变需要对应一个探针和一组实验，对于突变类型较少的遗传病的诊断较为快速简便。当一种遗传病是由多种点突变所引起，且其频率分散时，ASO技术就显得很繁琐。为了能够同时检测多种突变，可以将针对各种突变和正常序列的ASO探针固定在杂交膜上，而将原来在ASO杂交体系中固定在膜上的PCR产物改为液相进行杂交，这种方法称为RDB。利用这一方法，一次检测可以同时筛查多种突变，大大提高了基因诊断效率，已在一些常见遗传病，如B地中海贫血和襄性纤维化的基因诊断中得以应用苍。


生物化学与分子生物学 常变正突因基 3. PCR－限制性片段长度多态性是将PCR与限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)结合起来的技术，可以快速简便地对已知突变进行基因诊断。用一种或几种限制性内切核酸酶对某一段DNA序列进行消化，就会产生大小不同的DNA片段，称为限制性片段。而对千同种生物来说，不同个体间出现不同长度限制性片段类型称为限制性片段长度多态性。如果基因突变导致的基因组成或序列改变使DNA分子中原有的某种限制性内切核酸酶识别位点发生改变，可能导致基因结构中产生新的限制性内切核酸酶位点或使原有的酶切位点消失。首先是将突变基因PCR扩增，然后经过相应的内切酶消化后，进行含有澳化乙锭的琼脂糖凝胶电泳分离，在紫外线灯下即可分辨各种限制性片段的大小或位置，或者将限制性酶切产物与核素标记探针进行杂交，进行放射自显影，从而区分各种片段，解读出目标样品之间DNA分子水平的实际差异，这种方法就是PCRRFLP。


生物化学与分子生物学 常变正突因基 引物介导的限制性分析PCR(PCR-primer introduced restriction analysis, PCR-PIRA)是PCR-RFLP技术的延伸。其原理是在设计引物时引入错配碱基，从而消除或产生新的酶切位点，该错配的结果最终表现在酶解的限制性片段长度的差异。PCR-PIRA主要的分析对象是已知基因，用相应的计算机软件可以分析基因上可能产生的酶切位点的错配，从而产生人的RFLP。PCR-RFLP和PCR-PIRA的主要区别在于后者的引物设计时人工地引入酶切位点，而在实验材料和方法上没有区别。巢式PCR－限制性片段多态性(nested PCR-RFLP)是将RFLP与巢式PCR(nes ted PCR)技术相结合通过设计高度保守序列的引物对待检测物种DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行RFLP分析。该方法省时，可应用于流行病学调查和临床常规检测。


生物化学与分子生物学 常变正突因基 PCR-DHPLC技术的基本原理是利用待测样品DNA在PCR扩增过程的单链产物可以随机与互补链相结合而形成双链的特性，依据最终产物中是否出现异源双链来判断待测样品中是否存在点突变。如果不存在点突变，在PCR反应中产生的双链DNA都是一致的，即只产生一种同源双链。如果存在点突变，就会产生4种不同的DNA双链分子，2种为异源双链，另2种为同源双链。在给定的部分变性洗脱条件下，这些异源双链DNA片段可以在液相色谱柱中呈现出不同的滞留时间，出现“变异“洗脱峰的样品可进一步通过DNA直接测序确定样品的突变位点和性质。这一技术依赖自动化操作的分析仪完成，目前已成为临床遗传学诊断的重要工具。 （三）DNA序列分析是基因诊断最直接的方法 分离出病人的有关基因，测定其碱基排列顺序，找出变异所在是最为直接和确切的基因诊断方法。由于PCR技术和DNA序列分析技术的迅速发展和推广，序列分析已经在技术上和经济上成为最佳的诊断方法，代替了传统的限制性内切酶酶谱分析法。此法主要用于基因突变类型已经明确的遗传病的诊断及产前诊断。但由千DNA测序的成本很高，将其作为一种临床上常规的检测方法尚无法实现。


生物化学与分子生物学 （四）基因芯片技术可用于大规模基因诊断 基因芯片技术可以进行微量化、大规模、自动化处理样品，特别是适用于同时检测多个基因、多个位点，精确地研究各种状态下分子结构的变异，了解组织或细胞中基因表达情况，用以检测基因的突变多态性表达水平和基因文库作图等。目前利用基因芯片技术可以早期、快速地诊断地中海贫血、异常血红蛋白病苯丙酮尿症、血友病、迪谢内肌营养不良症等常见的遗传性疾病。在肿瘤的诊断方＼I们所[}484第五篇医学分子生物学专题面基因芯片技术也广泛地应用千肿瘤表达谱研究、突变、SNP检测、甲基化分析、比较基因组杂交分析等领域。基因芯片提供了从整体观念研究有机体的全新技术，必将改变生命科学研究的方式，对复杂疾病的诊断与治疗将带来革命性的变化。 四、基因诊断的医学应用 当人类基因组的信息与人类疾病的关系完全明确以后，从理论上讲，基因诊断可以提供所有直接或间接涉及基因结构／功能改变的诊断、预警和疗效预测。虽然目前距离这一目标仍有很长的路要走，但基因诊断在遗传病的临床和预防医学实践上已经获得了较广泛的应用。


生物化学与分子生物学 四、基因诊断的医学应用 (—)基因诊断可用千遗传性疾病诊断和风险预测遗传性疾病的诊断性检测和症状前检测预警是基因诊断的主要应用领域。对于遗传性单基因病，基因诊断可提供最终确诊依据。与以往的细胞学和生化检查相比，基因诊断耗时少、准确性高。对千一些特定疾病的高风险个体、家庭或潜在风险人群，基因诊断还可实现症状前检测(pre symptomatic tes ting)，预测个体发病风险提供预防依据。基因诊断目前可用于遗传筛查和产前诊断。通过遗传筛查检测出的高风险夫妇需给予遗传咨询和婚育指导，在“知情同意”的原则下于适宜的妊娠期开展胎儿的产前诊断，若胎儿为某种严重遗传病的受累者，可在遗传咨询的基础上由受试者决定”选择“终止妊娠，从而在人群水平实现遗传性疾病预防的目标。例如基千RFLP的连锁分析技术，曾成功地用于包括锻状细胞贫血、B－地中海贫血等多种人类单基因遗传病在内的遗传分析。


生物化学与分子生物学 四、基因诊断的医学应用 在欧美发达国家，遗传病的基因诊断，尤其是单基因遗传病和某些恶性肿瘤等的诊断，已成为医疗机构的常规项目，并已形成在严格质量管理系统下的商业化服务网络。目前已列入美国华盛顿大学儿童医院和区域医学中心主持的著名基因诊断机构－-GENETests网站(http:ll www. genetests. org/)为超过3000种遗传性疾病提供分子遗传、生化和细胞生物学检测。我国基因诊断的研究和应用始于20世纪80年代中期，目前主要开展针对一些常见单基因遗传病的诊断性检测，如地中海贫血、血友病A、迪谢内肌营养不良等，表26-1列举了在我国开展的一些代表性常见单基因病基因诊断及其方法学案例。 疾病致病基因突变类型诊断方法 a地中海贫血Q珠蛋白缺失为主Gap-PCR、DNA杂交、DHPLC


生物化学与分子生物学 B地中海贫血B珠蛋白点突变为主反向点杂交、DHPLC血友病A凝血因子VIII点突变为主PCR-RFLP 血友病B凝血因子IX点突变、缺失等PCR-STR连锁分析苯丙酮尿症苯丙氨酸轻化酶点突变PCR-STR连锁分析、ASO分子杂交马方综合征原纤蛋白点突变、缺失PCR-VNTR连锁分析、DHPLCRFLP:restriction fragment length polymorphism，限制性片段长度多态性；STR:short tandem repeat，短串联重复序列；VNTR:var1able number of tandem repeats，可变数目串联重复序列（二）基因诊断可用于多基因常见病的预测性诊断对于多基因常见病，基千DNA分析的预测性诊断可为被测者提供某些疾病发生风险的评估意见。如乳腺癌易感基因(breas t cancer suscept山山ty gene, BRCA)1号(BRCAJ)和2号(BRCA2)的基因突变可提高个体的乳腺癌发病风险，其基因诊断已成为一些发达国家人群健康监测的项目之一。随着基因变异和疾病发生相关研究的知识积累，针对肿瘤和其他一些多基因常见病的这类预警性风险预测诊断正在逐步走入临床。在一些有明显遗传倾向的肿瘤中，肿瘤抑制基因和癌基因的突变分析，是基因检测的重要靶点。预测性基因诊断结果是开展临床遗传咨询最重要的依据。相信在相关基础研究取得进展的基础上，多基因常见病的预测性诊断会越来越多地得到应用，成为未来疾病诊断的主第二十六章基因诊断和基因治疗485要内容。


生物化学与分子生物学 B地中海贫血B珠蛋白点突变为主反向点杂交、DHPLC血友病A凝血因子VIII点突变为主PCR-RFLP  （三）基因诊断可用于传染病病原体检测 针对病原体自身特异性核酸(DNA或RNA)序列，通过分子杂交和基因扩增等手段，鉴定和发现这些外源性基因组、基因或基因片段在人体组织中的存在，从而证实病原体的感染。针对病原体的基因诊断主要依赖千PCR技术。PCR技术具有高度特异、高度敏感和快速的特点，可以快速检出样品中痕量的、基因序列巳知的病原微生物。如组织和血液中SARS病毒、各型肝炎病毒等的检测包。样品中痕量病原微生物的迅速侦检、分类及分型还可以使用DNA芯片技术。


生物化学与分子生物学 （三）基因诊断可用于传染病病原体检测 基因诊断主要适用于下列情况：O病原微生物的现场快速检测，确定感染源；＠病毒或致病菌的快速分型，明确致病性或药物敏感性；＠需要复杂分离培养条件，或目前尚不能体外培养的病原微生物的鉴定。分子诊断技术的特点决定了病原体的基因诊断较传统方法有更高的特异性和敏感性，有利于疾病的早期诊治、隔离和人群预防。但由千基因诊断只能判断病原体的有无和拷贝数的多少，难以检测病原体进入体内后机体的反应及其结果，因此，基因检测并不能完全取代传统的检测方法，它将与免疫学检测等传统技术互补而共存。（四）基因诊断可用千疾病的疗效评价和用药指导遗传诊断还可应用于临床药物疗效的评价及提供指导用药的信息。例如，急性淋巴细胞性白血病经化疗等综合治疗后，大部分病人可获得缓解，但容易复发。白血病复发的主要根源在于病人体内少数残留的白血病细胞（约<0.05xl09/L)。PCR等基因诊断技术已成为临床上检测和跟踪微小残留病灶的常规方法，是预测白血病的复发、判断化疗效果和制定治疗方案的很有价值的指标。


生物化学与分子生物学 （三）基因诊断可用于传染病病原体检测 人群中对药物的反应性存在着个体差异，致使药物的不良反应难以避免。例如，氨基糖昔类抗生素的致聋副作用的发生与线粒体DNA12S rRNA基因第1555位A-G同质性点突变有关。在人群中通过分子筛查发现这种突变的个体，对指导医生避免使用氨基糖昔类抗生素，防止儿童产生药物中毒性耳聋有很好的参考价值。药物代谢酶类（如细胞色素P450)的遗传多态性，也是个体对某些药物的反应性差异的重要因素。因此，通过测定人体的这些基因多态性或其单倍型可以预测药180190200210220230240250物代谢情况或疗效的反应性，从而制订针对1114父亲不同个体的药物治疗方案。在系统阐明入类]\____]\药物代谢酶类及其他相关蛋白的编码基因遗传多态性的基础上，通过对不同药物代谢基


生物化学与分子生物学 （三）基因诊断可用于传染病病原体检测 8LI因靶点的药物遗传学检测(pharmacogenetic14八长子tes ting)，将为真正实现个体化用药提供技术A队（五）DNA指纹鉴定是法医学个体识!12A母亲别的核心技术DNA指纹的遗传学基础是DNA的多态图26-2STR等位基因在家庭中遗传示意图性。世界上除了部分同卵双生子外，人与人此图以D13S317位点为例，3个子女基因型的一个等位基之间的某些DNA序列特征具有高度的个体因来自于父亲，另外一个等位基因来自千母亲特异性和终生稳定性，正如人的指纹一般，故称为DNA指纹(DNA fingerprinting)。基因诊断在法医学上的应用，主要是采用基于STR的DNA指纹技术进行个体认定（图26-2)，已成为刑侦样品的鉴定、排查犯罪嫌疑人、亲子鉴定和确定个体间亲缘关系的重要技术手段岱。当前基于PCR扩增的DNA指纹技术已取代了上述基千DNA印迹的操作程序。选择若干个基因位点（如STR、人类白细胞抗原位点等）设计相应的PCR引物对，对待测DNA样本进行PCR扩增和带型比较后即可判断结果。该方法快速、灵敏，可以对微量血痕精液、唾液和毛发进行个体鉴定。\),I{i}486第五篮医学分子生物学专题基因治疗是以改变入遗传物质为基础的生物医学治疗，即通过一定方式将人正常基因或有治疗作用的DNA片段导入人体靶细胞以矫正或置换致病基因的治疗方法。它针对的是疾病的根源，即异常的基因本身。在此过程中，目的基因被导入靶细胞内，它们或与宿主细胞染色体整合成为宿主细胞遗传物质的一部分，或不与宿主细胞的染色体整合而独立于染色体以外，但都可以在宿主细胞内表达基因产物蛋白质，而达到治疗作用。目前基因治疗的概念也有了较大扩展，凡是采用分子生物学技术和原理，在核酸水平上展开的对疾病的治疗都可纳入基因治疗范圃。基因治疗的范围也从过去的单基因遗传病扩展到恶性肿瘤、心脑血管疾病、神经系统疾病、代谢性疾病等。根据治疗的靶细胞不同，基因治疗可分为生殖细胞(germ-line)治疗和体细胞(somatic cell)治疗两大类，由于生殖细胞基因治疗涉及伦理及遗传等诸多问题，目前人类基因治疗研究与应用的重点是体细胞治疗。