医学细胞生物学 第三节细胞分化的影响因素一、细胞间相互作用对细胞分化的影响 （一）胚胎细胞间相互作用的主要表现形式是胚胎诱导胚胎发育过程中，一部分细胞对邻近细胞产生影响并决定其分化方向的现象，称为胚胎诱导(embryonic induc tion)。起诱导作用的细胞或组织称为诱导细胞或诱导组织，被诱导而发生分化的细胞或组织称为反应细胞或反应组织。胚胎诱导现象最初是由Spemann在胚胎移植(embryonic graft)实验过程中发现的，他因此获得了1935年的诺贝尔生理学或医学奖。研究表明，胚胎细胞间的相互诱导作用是有层次的。在三个胚层中，中胚层首先独立分化，该过程对相邻胚层有很强的分化诱导作用，促进内胚层、外胚层各自向相应的组织器官分化。例如，中胚层脊索诱导其表面毅盖的外胚层形成神经板，这是初级诱导；神经板卷成神经管后，其前端进一步膨大形成原脑，原脑两侧突出的视杯诱导其上方的外胚层形成晶状体，此为次级诱导；晶状体又诱导覆盖在其上方的外胚层形成角膜，这为三级诱导（图15-15)。不同胚层细胞通过这种进行性的相互作用实现胚胎细胞分化。个体发育过程中，胚胎诱导具有严格的区域特异性和发育时空限制性。


医学细胞生物学 第三节细胞分化的影响因素一、细胞间相互作用对细胞分化的影响 为什么会发生胚胎诱导现象，胚胎诱导的分子基础是什么？研究表明，胚胎诱导是通过诱导组织释放的各种旁分泌因子(paracrine factor)实现的。这些旁分泌因子以诱导组织为中心形成由近及远的浓度梯度，它们与反应组织细胞表面的受体结合，将信号传递至细胞内，通过调节反应组织细胞的基因表达而诱导其发育和分化。发育过程.族，由30多个结构相关的成员组成，包括TGF-13家族、活化素(activin)家族、骨形成蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)家族及Vgl家族等。这些因.仁..


医学细胞生物学 杯视体杯状视晶即上经氓上经育发翅哈前＼＼人』后 中常见的旁分泌因子有：心成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF);(2)Hedgehog家族蛋白，脊椎动物中至少有三个果蝇Hedgehog基因同源体：shh A(sonic hedgehog), dhh(desert hedgehog)和巾h(indian hedgehog);@Wnt家族蛋白，为富含半胱氨酸的糖蛋白，在脊椎动物中至少有15个家族成员，其名称由wingless和integrated融合而成。wingless为果蝇分节极性基因，integrated是它的脊椎动物同源体；＠TGF-!3超家子在胚胎的不同发育阶段以及处于不同位置的胚胎细胞中的表达差异，提供354第四篇细胞的基本生命活动了胚胎发育过程中的位置信息。典型的例子是含有产生sonic h edgehog蛋白的胚胎细胞团的移植实验。原位杂交结果显示，sonic hedge hog mRNA也存在于胚胎的翅芽中，但仅定位于将来发育为翅膀小趾的翅芽后部。如果把另一产生sonic hedgehog蛋白的翅芽后部细胞团移植到受体宿主翅芽的前部，那么，受体宿主在以后发育成的翅膀上将出现镜向的趾重复（图15-16)。位置信息还表现在不同部位胚胎细胞对同一种旁分泌因子的分化效应不同，如son ic hedgehog蛋白诱导翅芽细胞发育为趾，而由脊索产生的sonic hedgehog蛋白则诱导邻近的神经管细胞分化成底板(floor plate)和运动神经元。


医学细胞生物学 杯视体杯状视晶即上经氓上经育发翅哈前＼＼人』后 信号通路配体家族受体家族细胞外抑制或调节因子受体酪氨酸激酶EGF EGF受体Argos FGF(Bra nchless)FGF受体(B reat hl ess)ephn ns Eph受体TGF(3超家族TGF~TGF[3受体chordin(Sog), noggin BMP(Opp)BMP受体Nodal Wnt Wnt(Wmgless)Fnzzled Dickkopf, Cerberus Hedgehog Hedgehog Patched, Smoothened Notch Della Notch Fringe（二）胚胎细胞间的相互作用还表现为细胞分化的抑制效应抑制是指在胚胎发育中已分化的细胞抑制邻近细胞进行相同分化而产生的负反馈调节作用。例如，把发育中的蛙胚置于含蛙心组织碎片的培养液中，胚胎将受到抑制不能产生正常的心脏。这说明，已分化的细胞可产生某种物质，抑制邻近细胞向其相同方向分化，这种物质称为抑素(chalone)。


医学细胞生物学 杯视体杯状视晶即上经氓上经育发翅哈前＼＼人』后 另一种抑制现象表现为，在具有相同分化命运的胚胎细胞中，如果一个细胞＂试图”向某个特定方向分化，那么，这个细胞在启动分化指令的同时也发出另一个信号去抑制邻近细胞的分化，这种现象被称为侧向抑制(lateral i nhi bi tion)。比如在脊椎动物的神经板细胞向神经前体细胞(neuronal precursor cell)分化过程中，尽管这些神经板细胞均有发育为神经前体细胞的潜能，但只有其中的部分细胞可发育为神经前体细胞，其余的则分化为上皮性表皮细胞。这种现象是由神经板细胞间的侧向抑制作用所决定的。正是由于有诱导分化和抑制分化的存在，才使胚胎发育有序地进行，使发育的器官间得以相互区别、避免重复。


医学细胞生物学 二、激素对细胞分化的调节 激素是远距离细胞间相互作用的分化调节因子。在个体细胞分化与发育过程中，除相邻细胞间可发生相互作用之外，不相邻的远距离的细胞之间也可发生相互作用。与介导邻近细胞间相互作用的旁分泌因子不同，远距离细胞间的相互作用由经血液循环输送至各部位的激素来完成。激素所引起的反应是按预先决定的分化程序进行的，是个体发育晚期的细胞分化调控方式。激素可分为肖类激素和多肤类激素两大类淄类激素如类固醇激素、雌激素和昆虫的蜕皮素等为脂溶性，分子小，可穿过靶细胞的细胞膜进入细胞质，与细胞质内的特异受体结合形成受体－激素复合物，该复合物入核后，能作为转录调控物，直接结合到DNA调控位点上激活（或在一些情况下抑制）特异基因的转录；多肤类激素如促甲状腺素、肾上腺素、生长激素和胰岛素等为水溶性，分子量较大，不能穿过细胞膜，而是通过与质膜上的受体结合，并经过细胞内信号转导过程将信号传递到细胞核，影响核内DNA转录。如同许多其他的细胞内信号转导途径一样，这个过程包括蛋白激酶的顺序激活。


医学细胞生物学 二、激素对细胞分化的调节 激素影响细胞分化与发育的典型例子是动物发育过程中的变态(metam01JJhos is)效应。所谓变态，是指动物从幼体变为在形态结构和生活方式上有很大差异的成熟个体的发育过程。例如，蝇类和蛾类等昆虫，其幼虫身体被一坚硬的角质层所覆盖，运动能力有限，它需要经过多次蜕皮才能成为在空中飞舞的成虫；在两栖类，只能在水中生活的有尾蜊抖需经过变态发育才能形成可在陆地生活的无尾的蛙。研究表明，昆虫的变态发育受蜕皮激素的影响，而两栖类的变态则与甲状腺激素(T3'T4)有关。在哺乳动物和人类，乳腺的发育自胚胎期已开始，但直到青春期受雌激素的作用才开始迅速发育。


医学细胞生物学 三、环境因素对细胞分化的影响 细胞分化的方向可因环境影响而改变。环境因素在调节或影响动物细胞分化与发育方面的研究越来越受到人们的重视。目前已了解到，物理的、化学的和生物性因素均可对细胞的分化与发育产生重要影响。在两栖类动物，其受精卵的背－腹轴确定除了取决千精子穿透进入卵的位点之外，还和重力的影响有关。在低等脊椎动物，性别决定与分化受环境因素的影响较大，环境信号启动基因的表达不同，从而影响动物的性别。比如，孵化温度可以决定某些爬行动物（如鍔鱼）的性别，在其受精卵发育的一个特定时期，温度是性别分化的决定因子，在低温下孵化产生一种性别，在高温下孵化则产生另一种性别。而哺乳类动物（包括人类）B淋巴细胞的分化与发育则依赖于外来性抗原的刺激。目前已发现许多环境因素可干扰入类的正常发育。例如，殃缺乏将引起甲状腺肿、精神发育和生长发育迟缓；在妊娠期感染风疹病毒易引起发育畸形，该病毒主要作用千胚胎的视觉器官和心脏，引起先天性白内障和心脏发育畸形。有关环境因素影响细胞分化与发育的机制也是目前生物医学研究的重要领域之一。该领域的深入研究，可望为环境有害物质引起的出生缺陷和发育畸形等提供新的干预靶点。


医学细胞生物学 第四节细胞分化与医学 细胞分化是包括人类在内的多细胞生物个体发育的核心事件。细胞分化与发育异常将引起多种出生缺陷。许多疾病如肿瘤等与细胞分化密切相关。不仅如此，细胞分化的可塑性，即细胞分化状态的转变也与再生医学关系密切。这里以肿瘤和再生为例，简述细胞分化的医学意义。 —、细胞分化与肿瘤 (—)肿瘤细胞是异常分化的细胞肿瘤细胞和胚胎细胞具有许多相似的生物学特性，均呈现出未分化和低分化特点。肿瘤细胞除了具有其来源组织细胞的部分特性之外，主要表现出低分化、高增殖和高侵袭（即高迁移）的特征。1肿瘤细胞的异常分化肿瘤细胞具有某些其来源组织细胞的分化特点，但更多见的是缺少这种特点甚至完全缺如。高度恶性的肿瘤细胞，其形态结构特点为，细胞核大、核仁数目多，核膜和核仁轮廓清楚。电镜下的超微结构特点是，细胞质呈低分化状态，含有大量的游离核糖体和部分多聚核糖体；内膜系统、尤其是高尔基复合体不发达；微丝排列不够规则；细胞表面微绒毛增多变细；细胞间连接减少。分化程度低或未分化的肿瘤细胞缺乏正常分化细胞的功能，如胰岛细胞瘤可无胰岛素合成，结肠肿瘤可不合成黏蛋白，肝癌细胞不合成血浆白蛋白等。


医学细胞生物学 —、细胞分化与肿瘤 从细胞分化观点分析肿瘤，认为分化障碍是肿瘤细胞的一个重要生物学特性，甚至有人认为肿瘤本身是一种分化疾病，是由于正常基因功能受控于错误的表达程序所致。包括人类在内的复杂的多细胞生物，需要胚胎细胞分化为各种具有特殊功能的细胞，并进一步组成各种组织和器官。分化是一个定向的，严密调节的程序控制过程，其关键在于基因按一定的时空顺序有选择地被激活或抑制。多数情况下，终末分化细胞不再具有增殖能力，而肿瘤细胞在不同程度上缺乏分化成熟细胞的形态和完飞1:i整的功能，丧失某些终末分化细胞的性状，并常对正常的分化调节机制缺乏反应。因此，有学者提出，恶性肿瘤是细胞分化和胚胎发育过程中的一种异常表现。这一见解对于理解肿瘤起源和本质特征具有重要意义。


医学细胞生物学 —、细胞分化与肿瘤 2肿瘤细胞是丧失接触性抑制的高迁移性”永生“细胞一般情况下，体外培养的大部分正常细胞需要黏附千固定的表面进行生长（依赖铀泊），增殖的细胞达到一定密度，汇合成单层以后即停止分裂，此过程称为接触抑制或密度依赖性抑制(densi ty-depend e nt inh加tion)。而肿瘤细胞和转化细胞则缺乏这种生长限制，甚至可在半固体琼脂中呈悬浮生长，不需要依附于固定表面，不受密度限制，可持续分裂，达到很高密度而出现堆积生长，形成高出单层细胞的细胞灶。正常二倍体细胞的培养基中必须含有一定浓度的血清（5％以上）才能维持培养细胞分裂增殖。肿瘤细胞或转化细胞的生长对生长因子或血清的依赖性降低，甚至在缺乏生长因子或低血清(2%）状态下也可生长、分裂。人类正常细胞在体外培养传代一般不能超过50次，而恶性肿瘤细胞则可以无限传代成为“永生”的细胞系。在体内，肿瘤细胞不但增殖失控形成新的肿块，而且侵袭破坏周围正常组织，进入血管和淋巴管中，转移到身体其他部位滋生继发性的肿瘤，这些继发性的肿瘤再侵袭和破坏植入部位的组织，致使肿瘤细胞在宿主体内广泛散播。肿瘤细胞的这些特征与胚胎细胞具有共性，比如胚胎细胞的高迁移特性。


医学细胞生物学 —、细胞分化与肿瘤 肿瘤细胞的高转移特性也反映出细胞分化状态的转变在肿瘤进展中的重要作用。人们现在认识到，肿瘤细胞在发生转移之前，必须经过上皮－间质转换(epithelial mese nchymal transit ion, EMT)，即上皮细胞向具有高侵袭（或迁移）力的间质细胞的转变；同时，迁移到距离原发灶远处组织中的间质性肿瘤细胞也必须经过间质－上皮转换(MET)，才能形成转移性或继发性肿瘤。（二）细胞分化的研究进展促进了对肿瘤细胞起源的认识肿瘤细胞是从机体内正常细胞演变而来的，正常细胞转变为恶性肿瘤的过程称为癌变。绝大多数肿瘤呈单克隆生长的特性说明，肿瘤中的全部细胞都来源于同一个恶变细胞。根据生长动力学原理，肿瘤细胞群体大致可分为四种类型：心干细胞，它是肿瘤细胞群体的起源，具有无限分裂增殖及自我更新能力，维持整个群体的更新和生长；＠过渡细胞，它由干细胞分化而来，具备有限分裂增殖能力，但丧失自我更新特征；＠终末细胞，它是分化成熟细胞，已彻底丧失分裂增殖能力；＠G。期细胞，它是细胞群体中的后备细胞，有增殖潜能但不分裂，在一定条件下，可以更新进入增殖周期。其中肿瘤干细胞在肿瘤发生、发展中起关键作用。大量证据表明，肿瘤起源于一些未分化或微分化的干细胞，是由千组织更新时所产生的分化异常所致。组织更新存在千高等生物发育的各个时期。在成年生物组织如骨髓等，存在着未分化干细胞。干细胞的增生和分化使衰老和受损的组织、细胞更新或恢复，这些正常千细胞常是恶性变的靶细胞。肿瘤起源千未分化或微分化于细胞的直接证据来自小鼠的畸胎瘤(teratocarcinoma)实验：将12天胚龄的小鼠胚胎生殖啃移植到同系成年小鼠睾丸被膜下，移植17天后，发现80％的睾丸有胚胎性癌细胞病灶，并且很快发展成典型畸胎瘤细胞。胚胎性癌细胞形态上非常类似原始生殖细胞，都具有未分化的细胞质；同时，将早期发育阶段的胚胎包括受精卵移植至同系成年小鼠睾丸被膜下，也获得畸胎瘤。受精卵、原始生殖细胞都处于相同的未分化状态，因此，正常未分化生殖干细胞是畸胎瘤的起源细胞。白血病的发生也遵循这一规律，它起源千未分化或微分化的干细胞。这种认识可从白血病细胞免疫表型、免疫球蛋白和T细胞受体基因分析及其与正常造血干细胞发育、分化比较中找到依据。上皮细胞作为由干细胞自我更新的组织和细胞类型更容易发生癌变。据统计，目前入类肿瘤的90%以上是上皮源性的，这是因为上皮包含有许多分裂中的干细胞，易受到致癌因素的影响发生突变，转化为癌细胞。


医学细胞生物学 —、细胞分化与肿瘤 在正常组织更新过程中，致癌因素如放射线、化学致癌物等可作用于任何能合成DNA的正常干细胞，而受累细胞所处的分化状态可能决定了肿瘤细胞的恶性程度。一般认为，受累细胞分化程度越低所产生的肿瘤恶性程度越高；反之，若受累细胞分化程度越高，所产生肿瘤恶性程度越低，甚至只产生良性肿瘤。仍以小鼠畸胎瘤为例，若将E l2.5-El3d的小鼠胚胎生殖帷作异位移植，可致畸胎瘤，而将E13.5d的生殖崝作同样的异位移植，则丧失致畸胎瘤的能力，说明分化程度不同的细胞会产生截然不同的结果。 （三）肿瘤细胞可被诱导分化为成熟细胞 基于恶性肿瘤细胞的本质是增殖分化失去控制、正常程序化的增殖分化机制丧失特点，迄今探索出诱导肿瘤细胞”改邪归正＂的两种策略。1．小分子诱导剂诱导肿瘤细胞向成熟细胞分化肿瘤细胞可以在高浓度的分化信号诱导下，增殖减慢，分化加强，走向正常的终末分化。这种诱导分化信号分子被称为分化诱导剂，它可以是体内的或人工合成的。分化诱导剂对肿瘤的这种促分化作用，称为分化诱导作用。


医学细胞生物学 （三）肿瘤细胞可被诱导分化为成熟细胞 20世纪70年代，人们开始发现肿瘤细胞的诱导分化现象，先后发现细胞膜的环磷酸腺甘(cAMP)衍生物，如环丁酰cAMP、8－澳cAMP可使神经母细胞瘤的某些表型逆转，二甲亚砚(DMSO)在体外可使小鼠红白血病细胞发生部分分化。继而有入用微量注射法将小鼠睾丸畸胎瘤细胞注入小鼠痪胚，经培养后植入假孕的雌鼠子宫，结果生出“正常的小鼠＂。这证明恶性肿瘤细胞在某些物质作用下可以改变其生物学性状，使恶性增殖得到控制。但是，这些结果仅适用千实验研究而无临床应用价值。20世纪80年代，T. R. Breitman利用原代细胞培养实验，发现维生素A衍生物一维甲酸对人急性早幼粒细胞白血病具有诱导分化作用，并在两例队型病人中观察到疗效。Flynn使用13－顺维甲酸治疗病人取得成功。中国学者应用全反式维甲酸治疗急性早幼粒细胞白血病在大样本病例中获得成功，证明全反式维甲酸可诱导白血病细胞沿着粒细胞系进行终末分化。后来的研究相继证实，许多细胞因子、小剂量的化疗药物都具有诱导分化作用。


医学细胞生物学 （三）肿瘤细胞可被诱导分化为成熟细胞 至20世纪90年代以来，随着肿瘤外科手术治疗、化疗和放疗取得的成就，肿瘤的诱导分化治疗也从实验室走向临床。目前，诱导分化治疗的研究与观察巳涉及多种人类肿瘤，如结肠癌、胃癌、膀胱癌、肝癌等。但不同肿瘤细胞可有多种分化诱导剂，并有相对的专一性，其中研究及治疗最深入的是全反式维甲酸和三氧化二碑对人急性早幼粒细胞白血病的诱导分化治疗（见本章推荐读物）。全反式维甲酸和三氧化二珅联合应用可以使90％的患者达到5年无病生存，这是中国学者对人类的重大贡献。虽然诱导分化治疗仅在这单一病种上最为成功，但其意义重要。它揭示了一个肿瘤治疗的方向，即通过诱导肿瘤细胞分化来实现肿瘤细胞的”改邪归正＂，改变肿瘤细胞恶性生物学行为，达到治疗的目的。


医学细胞生物学 （三）肿瘤细胞可被诱导分化为成熟细胞 2细胞重编程促使肿瘤细胞逆分化为“正常“细胞目前人们对细胞重编的研究兴趣已扩展到肿瘤研究领域。肿瘤细胞，经细胞重新编程后将会如何呢？新近来自肉瘤细胞的重编程研究表明，肉瘤细胞经重编程后，分化成了具有类似间充质干细胞和类造血干细胞，并最终能分化为成熟的结缔组织和血红细胞。全基因组DNA启动子甲基化和基因表达谱分析显示，比对人类癌细胞和重编程细胞，发现重编程会导致癌基因和抑癌因子发生大幅表观遗传修饰。这些数据表明重编程能恢复癌细胞向终末细胞分化的潜力，并且无需恢复到胚胎（千细胞）状态。本领域研究将为解析肿瘤细胞癌变过程提供新途径，也让人们期盼细胞重编程能否成为癌症治疗的一个新方向。应当指出的是：将肿瘤细胞重新编程回归“正常”，虽如同电影中所描述的搭乘时间车回到了过去，但也要防止肿瘤细胞又搭乘时间车回到现状（肿瘤复发）。


医学细胞生物学 二、细胞分化与再生医学 一些发育成熟的成年动物个体有再生(regeneratio n)现象，表现为动物的整体或器官受外界因素作用发生创伤而部分丢失时，在剩余部分的基础上又生长出与丢失部分在形态结构和功能上相同的组织或器官的过程。机体在正常生理条件下由组织特异性成体干细胞完成的组织或细胞的更新，如血细胞的更新、上皮细胞的脱落和置换等，虽然与再生相似，但性质上有所不同。不同动物的再生能力有显著差异。一般来说，高等动物的再生能力低千低等动物，脊椎动物低千无脊椎动物，而哺乳动358第四篇细胞的基本生命活动物的再生能力很低，仅限于肝脏等少数器官。为什么低等动物有很好的再生能力，再生过程的机制是什么？阐明这些问题有重要的医学意义。


医学细胞生物学 (—)再生的本质是多潜能未分化细胞的再发音 自然界动物的再生方式并不完全相同。概括起来，有三种方式：第一种，如水螅等低等动物，其再生是通过已存在组织的重组分化，即组织中的多潜能未分化细胞的再分化和部分细胞的转分化，此现象称为变形再生或形态重组再生(morphallaxis regeneration)。第二种方式是，组织器官内没有干细胞，在受伤时，受伤部位组织中的部分细胞通过去分化过程形成未分化的细胞团（原基细胞），再重新分化形成再生器官。这种形式的再生称为微变态再生(epi morphosis regen erat ion)，是两栖类动物再生肢体的主要方式。第三种再生是一种中间形式，被认为是补偿性再生(compensatory regenerat ion)，表现为细胞分裂，产生与自己相似的细胞，保持它们的分化功能，如哺乳动物肝脏的再生。


医学细胞生物学 (—)再生的本质是多潜能未分化细胞的再发音 戏剧性的去分化：骨细胞、软骨细胞、成纤维细胞、肌细胞和神经元失去了它们的分化特性，其中在分化组织中表达的基因，例如在肌细胞中表达的MRF4和myf5基因被下调，而与胚胎样肢体的区域间充质增生过程有关的基因如msxl的表达则明显的升高了。由此在截面处的肢体组织区域形成了在顶端外胚层帽之下的不能辨别的去分化的细胞增殖团块，称为再生胚芽(regeneration blastema)，其中的细胞称为胚芽细胞。关于胚芽细胞，以往人们一直认为这是一组均一的多潜能未分化细胞，它能够再分化形成再生组织中所有类型细胞。新近基于GFP技术的特定组织细胞标记分析结果显示，胚芽细胞是一个不均一的各种类型前体细胞(progen itor cell)的“混合体”，每个前体细胞由残留肢体中的成熟组织细胞去分化而来，它们仍保持着其来源组织的＂记忆＂。例如由肌组织来源的肌前体细胞在再生时仅形成肌组织，而不是其他类型细胞。这表明，蛛螺肢体再生并不要求成体细胞完全去分化成一种多能状态。


医学细胞生物学 (—)再生的本质是多潜能未分化细胞的再发音 2胚芽细胞的增生和再分化胚芽细胞在经过分裂增殖之后即开始再分化，肌细胞开始合成肌蛋白，软骨细胞分泌软骨基质，等等，直至形成与原来肢体相同的新结构。3再生胚芽的模式形成再生胚芽在很多方面与肢体正常发育区域的肢芽相似。残肢和再生组织之间的腹－背轴和前－后轴是一致的，细胞和分子水平的研究证实了肢体再生与正常发育的机制十分相似。通过把再生肢体胚芽移植到发育中的肢体芽上，证明了胚芽细胞可对肢体芽的信号产生反应并有助于肢体发育。正如信号分子Sonic hedgehog被发现存在于肢芽发育区域间充质的后区一样，Sonic hedgehog也存在于早期再生胚芽的后部区域。以上蛛螺肢体切除再生的研究表明，再生的本质是成体动物为修复缺失组织器官的发育再活化，是部分细胞进入去分化的自我重编程(self-repro驴·amming)过程。


医学细胞生物学 (—)再生的本质是多潜能未分化细胞的再发音 尽管人类和其他哺乳动物没有蛛姬如此的幸运，但只要还有足够的指（趾）甲，就可以再生出指（趾）尖。最近纽约大学Mayumi Ito领导的研究小组揭示了指尖再生的秘密：在指甲根处下存在一个干细胞群，这些细胞可以协调修复部分切除的指头。哺乳动物指尖再生的分子程序与两栖类动物肢体的切除再生极为相似，指甲干细胞作为一个“信号传导中心”，利用了一种对于胚胎四肢发育至关重要的Wnt信号通路，在组织再生过程中帮助了神经、新指甲以及骨细胞协调信号传导。当小鼠趾尖被截去后，剩余趾甲下的上皮组织中的Wnt途径被激活，并将神经吸引至此，通过FGF2蛋白，神经驱动间充质细胞的生长（间充质细胞可恢复骨、肌腮及肌肉组织），数周后，小鼠的趾尖恢复如初。不过，如果趾尖被截断过多、趾甲上皮组织丢失过多或整个指甲被移除，则无法再生。


医学细胞生物学 （二）动物的再生策略给人类以重要启示 除肝脏之外，入类不会再生器官，至多在儿童期还可以再生指尖，但是至成人就丧失了这种能力。由千再生损伤组织在医学上的重要性，许多生命科学工作者根据低等动物的再生机制，试图找出激活曾经是人体器官形成的发育程序的方法。其中一种方法是寻找相对未分化的多潜能干细胞；另外一种方法是寻找能够允许这些细胞开始形成特定组织细胞的微环境。迄今在寻找未分化的多潜能干细胞及＂诱导“细胞具有多能性的方法上取得了新进展，例如人ES细胞的发现、iPS细胞的建立等。（三）细胞分化的可塑性研究显示体细胞重编程的巨大可能性哺乳动物中不同组织来源的成体干细胞具有横向分化和跨胚层分化潜能的发现，特别是iPS细胞被建立以来，基于细胞重编程技术而获取有治疗意义细胞的研究成果层出不穷。应用细胞重编程技术，不仅能将体细胞转变为多潜能未分化干细胞和组织特异性干细胞，而且还可绕开细胞重编程的干细胞阶段，将皮肤成纤维细胞(fibrob l ast)直接转化为血细胞、心肌细胞及神经元等（详见第十六章干细胞）。


医学细胞生物学 （二）动物的再生策略给人类以重要启示 人们对细胞分化机制的不断探索，包括体细胞核移植研究、细胞分化主控基因的发现和ES细胞研究，催生了细胞重编程技术的诞生。可以确信，随着对细胞分化机制研究特别是对低等动物再生本质和细胞分化可塑性认识的不断深入，真正实现按照人们的意愿去再生细胞和组织器官，以达到彻底修复和替代病变器官的时代将会逐渐变为现实。 （陈誉华）第十六章细胞衰老与细胞死亡 在高等动物，大多数机体细胞都经历了由未分化到分化、分化到衰老、衰老到死亡的过程。生物体内每时每刻都有细胞在衰老、死亡，同时又有增殖和新生的细胞进行补偿。细胞衰老与细胞死亡是生物界的普遍规律，是一种不可抗拒的生理现象。入体内有200多种细胞，它们的寿命各不相同，例如，红细胞的寿命仅为120天，肝细胞的寿命约18个月，神经元的寿命与机体寿命大致相同。阐明细胞的衰老与死亡的机制，对千揭示生命的奥秘和延缓个体的衰老具有重要的意义。


医学细胞生物学 第一节细胞衰老一、细胞衰老的概念 细胞衰老(cellul釭aging或cell senescence)是指随着时间的推移，细胞的增殖能力和生理功能逐渐发生衰退的变化过程。衰老的细胞呈现出一种不可逆的生长停滞状态，其最终结果将导致细胞死亡。细胞衰老是生物个体衰老的细胞基础，个体的自然衰老并不是疾病，但它与许多老年性疾病紧密关联。


医学细胞生物学 (—)细胞衰老与机体的衰老既有区别又有联系 机体衰老是指绝大多数生物性成熟以后，机体形态结构和生理功能逐渐退化或老化的过程，是一个受发育程序、环境因子等多种因素控制的、不可逆的生物学现象。机体的衰老与其物种的寿命密切相关。对多细胞生物来说，细胞的衰老与机体的衰老是两个不同的概念。个别细胞，甚至机体局部许多细胞的衰老与死亡并不影响机体的寿命；同样，机体衰老并不代表所有细胞的衰老，如70岁老人的生精细胞仍可以活跃地发生。同时，机体衰老与细胞衰老之间又有着密切的联系。个体的衰老是建立在总体细胞衰老的基础上的，各种衰老都有其细胞学基础，如老年人运动功能衰退与其体内的运动神经元的衰老密切相关。细胞是组成生物有机体的基本结构和功能单位，也是机体衰老的基本单位。因此，机体衰老是以细胞总体的衰老为基础的，细胞总体的衰老反映了机体的衰老。为此，阐明机体衰老机制必须从细胞衰老机制研究入手。


医学细胞生物学 （二）机体内各类细胞的寿命不同 在成年体内的组织器官中总有细胞不断地衰老，不同类型细胞的寿命很不一致。除于细胞外，根据寿命情况将细胞分为三类：第一类细胞的寿命接近千动物的整体寿命，如神经元、脂肪细胞、肌细胞等；第二类是缓慢更新的细胞，其寿命比机体的寿命短，如肝细胞、胃壁细胞等；第三类是快速更新且寿命较短的细胞，如皮肤的表皮细胞、红细胞和白细胞等。一般情况下，体内更新较快的细胞，其寿命较短。体内基本不更新的细胞，在分化成熟后可以保持与机体相同的寿命。细胞寿命除与细胞的种类有关外，也受到内、外环境条件的影响。


医学细胞生物学 （三）细胞在体外培养条件下的寿命 离体(in vitro)细胞与在体(in vivo)细胞一样，也有一定的寿命。对千体外培养的细胞，其寿命长短取决于培养细胞的平均代数，并与所取培养细胞的组织年龄、种属等特性密切相关。1961年，Hayflick首次报道了体外培养的人成纤维细胞(fibroblast)具有增殖分裂的极限，即Hayflick界限(Hayflick life span)。他利用来自胚胎和成体的成纤维细胞进行体外培养，发现胚胎的成纤维细胞分裂传代50次后，进入生长停滞状态；而来自成年组织的成纤维细胞只能培养15~30代就开始出现生长停362第四篇细胞的基本生命活动滞。Hayflick等还发现，动物体细胞在体外可传代的次数，与物种的寿命有关。同时，细胞分裂能力与个体的年龄有关。由千上述规律是Hayflick发现的，故称为Hayflick界限。


医学细胞生物学 二、细胞衰老的表现 细胞衰老的主要表现是对环境变化的适应能力，以及维待细胞内环境稳定的能力降低。这些都是以细胞的形态结构和生化方面的改变为基础的。（一）细胞衰老伴随着形态学改变衰老细胞的形态变化主要表现在细胞皱缩、膜通透性和脆性增加、核膜内陷和细胞器数量减少，特别是线粒体数量减少，胞内出现脂褐素等异常物质沉积，最终出现细胞凋亡或坏死。通常衰老细胞的各种结构呈退行性变化（表16-1)。 细胞组分形态变化 核增大染色深、核内有包含物染色质凝聚、固缩、碎裂、溶解质膜黏度增加、流动性降低细胞质色素积聚、空泡形成线粒体数目减少、体积增大、mtDNA突变或丢失高尔基复合体碎裂尼氏体消失包含物糖原减少、脂肪积聚核膜内陷（二）细胞衰老过程中有生物大分子和代谢的改变衰老细胞会出现脂类、蛋白质和DNA等细胞成分损伤，细胞代谢能力降低，主要表现在以下方面：(1)DNA复制与转录受到抑制，但也有个别基因会异常激活，端粒DNA丢失，线粒体DNA特异性缺失，DNA氧化、断裂、缺失和交联，甲基化程度降低。


医学细胞生物学 细胞组分形态变化 (2)RNA:mRNA和tRNA含量降低。(3)蛋白质：含量下降，细胞内蛋白质发生糖基化、氨甲酰化、脱氨基等修饰反应，导致蛋白质的稳定性、抗原性和可降解性下降，自由基使蛋白质肤键断裂，交联而变性。氨基酸由左旋变为右旋。(4)酶分子：活性中心被氧化，金属离子Ca2+,Zn2+,Mg2+,Fe2＋等丢失，酶分子的二级结构、溶解度第二代鼠成纤维细胞第八代鼠成纤维细胞图16-1衰老成纤维细胞6－半乳糖昔酶活性增强鼠成纤维细胞B－半乳糖昔酶(SA-i3gal)染色（中国医科大学曹流提供） 第十六章细胞衰老与细胞死亡363 和等电点发生改变，总的效应是酶失活；但B－半乳糖昔酶(senescence-associated[3-galactosidase, SA[3gal)活性增强（图16-1)。(5)脂类：不饱和脂肪酸被氧化，引起膜脂之间或与脂蛋白之间交联，膜的流动性降低。


医学细胞生物学 三、细胞衰老的学说与机制 由于衰老是一个十分复杂的生命现象，又受到多种因素包括环境因素和体内因素的影响，任一角度的阐述都难以使衰老机制得到圆满解释，因而仍未形成较为一致的观点。目前，关于细胞衰老的机制仍然是假说众多，但有关衰老的分子研究还是取得了较多进展。


医学细胞生物学 （一）有许多学说诠释细胞衰老过程 1.遗传决定学说认为衰老是遗传上的程序化过程该学说认为衰老是遗传上的程序化过程，其推动力和决定因素是遗传的基因组；控制生长发育和衰老的基因都在特定时期有序地开启和关闭。在人类，有两个典型的例子：一个是患婴幼儿早衰症(Hutchinson-Gilford syndrome)的儿童，患儿很早就出现明显的衰老症状（图16-2),12-18岁即过早夭折。该病是由于编码核膜蛋白的基因突变所引起的，为常染色体隐性遗传疾病；另一个是成人早衰症(Werner syndrome)，病人平均39岁时出现衰老，47岁左右生命结束。体外培养的成人早衰症患者的成纤维细胞与正常人的成纤维细胞相比，只分裂了较少的次数就发生了衰老和死亡，人们发现引起该病的基因与DNA的解旋有关（患者的DNA不图16-2早衰儿童（不足8岁就表现出衰能够正常修复）。这些都促使人们推测，衰老在一老特征）定程度上是由遗传决定的。（弓I自Gilbert S. F.,2006)迄今在人和动物体内已发现了多个与衰老有关的基因，根据其功能，可区分为衰老基因和抗衰老基因两大类。


医学细胞生物学 （一）有许多学说诠释细胞衰老过程 细胞衰老时，一些衰老相关基因(senescence associated gene)的表达水平显著高于年轻细胞。在人的1、2、4、6、7、11、18及X号染色体上都存在有这类基因，它们可使永生化细胞逆转而衰老，其丢失或激活可引起细胞永生化。例如：MORF4(mortality factor from chromosome4)基因，它能表达一种与细胞衰老死亡有关的转录因子，该基因突变可导致细胞永生化，将MORF4基因片段导入到缺失MORF4基因的永生化细胞后，可使永生化细胞衰老；p/6基因，其基因产物是细胞周期依赖性激酶抑制因子，研究发现，细胞衰老时，pl6基因mRNA的转录及蛋白质表达水平增高，p16表达增强将使细胞寿命缩短，抑制p/6基因的表达，细胞的寿命则延长。由此，p/6被视为细胞寿命的关键调控基因，是入类细胞衰老遗传控制程序中的关键效应物。


医学细胞生物学 （一）有许多学说诠释细胞衰老过程 抗衰老基因也称长寿基因(longevi ty gen e)。研究人员将蛋白质生物合成延长因子－压(EF－压）基因转入果蝇生殖细胞，结果发现子代果蝇的寿命延长了40%，说明EF-la具有长寿作用。在酵母中发现了一种sgsl基因突变体，其寿命明显短于野生型酵母，sgsl基因的编码产物为DNA解旋酶。前述提到的Werner早衰症，其体内8号染色体上编码DNA解旋酶的基因发生了突变，称为WRN基因，该基因与酵母中的sgs l基因同源，均是保证DNA复制所必需的基因，它们突变将引起衰老提前和寿命缩短。此外，还发现了一些抗衰老相关基因，例如，Klotho基因和SIRTI基因。Klotho基因缺陷的小鼠，在出生后4周左右即可出现一系列类似人类的早衰症状，Klotho基因的突变和低表达会引起衰老和相关性老年病；SIRTJ基因则与清除体内的胆固醇有关，被认为是能延长寿命的基因。


医学细胞生物学 364第四篇细胞的基本生命活动 2自由基学说认为活性氧基团导致细胞损伤和衰老自由基是指那些在原子核外层轨道上具有不成对电子的分子或原子基团。所谓未成对电子，是指在原子或分子轨道中未与其他电子配对而独占一个轨道的电子。如A、B两个原子各提供一个电子通过共价键形成一个分子A B，这两个电子是配对的。如果在化学反应中发生了均裂，A和B各带走一个电子，它们就是未成对电子。A·和．B就称为自由基。


医学细胞生物学 364第四篇细胞的基本生命活动 在正常条件下，人体内自由基的产生有两方面：一是环境中的高温、辐射、光解、化学物质等引起的外源性自由基；二是体内各种代谢反应产生的内源性自由基。内源性自由基是人体自由基的主要来源，其产生的主要途径有：CD由线粒体呼吸链电子泄漏产生；＠由经过氧化物酶体的多功能氧化酶(MFO)等催化底物胫化产生。此外，机体血红蛋白、肌红蛋白中还可通过非酶促反应产生自由基。自由基是一类高度活化的分子，当这种分子与其他物质反应时，力图得到电子，而对细胞及组织产生十分有害的生物效应。由千自由基活性强，容易与细胞内的生物大分子发生反应，过多的自由基会对许多细胞组分造成损伤。它们能使质膜中的不饱和脂肪酸氧化，从而使膜内酶活性破坏、膜蛋白变性、膜脆性增加、膜结构发生改变，因而膜的运输功能紊乱以致丧失；它们还能将蛋白质中的琉基氧化而造成蛋白质发生交联、变性，使酶失活。另外，它们还能使DNA链断裂、交联、碱基轻基化、碱基切除等，从而对DNA造成损伤。有学者认为，在衰老的原因中，99％是由自由基造成的。老年人皮肤上的老年斑(age spots)就是自由基对细胞破坏的见证。


医学细胞生物学 364第四篇细胞的基本生命活动 3端粒钟学说认为端粒随细胞分裂不断缩短为衰老的主要原因端粒(telomere)是染色体末端的一种特殊结构，其DNA由简单的串联重复序列组成。人的染色体端粒由TTAGGG/CCCTAA重复序列组成。在细胞分裂过程中，由千端粒不能为DNA聚合酶完全复制而逐渐变短，除非有端粒酶的存在。端粒酶是一种由RNA和蛋白质组成的核糖核蛋白酶，常见于生殖细胞和肿瘤细胞等细胞中，而正常的体细胞中则缺乏端粒酶或端粒酶活性很低。1990年，Harley等用人工合成的(TTAGGG汃作为探针，测定了不同年龄段的人成纤维细胞中的端粒长度，结果发现端粒长度随年龄增长而下降。在体外培养的成纤维细胞中，端粒长度也随分裂次数的增加而下降。在这些研究的基础上形成了细胞衰老的“有丝分裂钟“学说，或称＂端粒钟(telomere clock)学说＂。该学说认为，正常情况下，随着细胞的不断分裂，染色体末端的特殊结构“端粒“会逐渐缩短当端粒缩短到一定程度时，细胞增殖停滞，发生细胞衰老。1998年，Wri gh t等提供了更令人信服的证据，他们将人的端粒反转录酶亚基(hTRT)基因通过转染，引入正常的人二倍体细胞（入视网膜色素上皮细胞和成纤维细胞），发现表达端粒酶的转染细胞分裂旺盛，端粒长度明显增加，作为细胞衰老标志的B－半乳糖节酶活性则明显降低，这些与对照细胞存在鲜明的差异，而且表达端粒酶的细胞寿命比正常细胞至少长20代，且其核型正常。此外，对提前衰老的克隆羊“Dolly"的研究发现，其细胞中端粒的长度较同龄羊缩短20%。这些研究表明，端粒长度的确与衰老有着密切的关系。目前将端粒缩短诱发的细胞衰老称为复制性衰老(replicative senescence)。


医学细胞生物学 364第四篇细胞的基本生命活动 当然也有一些不支持这一学说的报道，在二倍体的仓鼠胚细胞分裂的各个阶段，细胞始终表达端粒酶，其端粒长度亦保持恒定，然而经过20~30代的分裂后，细胞仍然进入衰老；某些小鼠终生保持较长的端粒，但并未因此获得较长的寿命。特别是剔除端粒酶基因的小鼠，在其前5代中，并未观察到寿命缩短的现象。尽管如此，目前入们根据端粒与端粒酶在细胞衰老上的研究成果，已将细胞衰老区分为两大类：一类是与端粒、端粒酶直接相关的复制性衰老；另一类是氧化应激诱导的非端粒依赖性衰老，也被称为早熟性衰老(premature se n escence)。有研究者认为，某些终生保持较长端粒小鼠的衰老即属于氧化应激诱导的非端粒依赖性衰老。


医学细胞生物学 364第四篇细胞的基本生命活动 彸；4．细胞代谢废物累积可引起细胞衰老代谢废物累积（was le produ cl accu mulation)学说是指由第十六章细胞衰老与细胞死亡365于细胞功能下降，一方面细胞不能将代谢废物及时排出胞外，另一方面又不能将其降解与消化，这样代谢废物越积越多，在细胞中占据的空间越来越大，影响细胞代谢废物的运输，以致阻碍了细胞的正常生理功能，最终引起细胞的衰老。哺乳动物脂褐质的沉积是一个典型的例子。脂褐质是一些长寿命的蛋白质和DN八脂类共价缩合形成的巨交联物，次级溶酶体是形成脂褐质的场所，由于脂褐质结构致密，不能被彻底水解，又不能排出细胞，结果在细胞内沉积增多，阻碍细胞的物质交流和信号传递，最后导致细胞衰老。在老年性痴呆患者脑组织中有大械B淀粉样蛋白沉积，而B－淀粉样蛋白可作为老年性痴呆的鉴定指标。5基因转录或翻译差错导致细胞衰老随着年龄的增长，机体的细胞内不但DNA复制效率下降，而且常会发生核酸、蛋白质、酶等大分子的合成差错，这种逐渐累积的差错最终引起细胞功能降低，并逐渐导致细胞衰老、死亡，这就是细胞衰老的基因转录或翻译差错学说。


医学细胞生物学 364第四篇细胞的基本生命活动 6其他学说除了上述学说外，还有“神经免疫网络论”"钙调蛋白学说”“微量元素学说”等。（二）复制性细胞衰老和氧化应激诱导的非端粒依赖性细胞衰老的调控细胞衰老的主要变化是细胞进入一种不可逆的生长停滞状态。迄今对细胞衰老分子机制的认识，主要来源千对细胞衰老过程中细胞增殖周期停滞在G1期和S期的衔接期机制的研究。G l-S期是真核细胞周期中重要的限制调控点，其中G期限制点是增殖细胞唯一能够接受外界增殖和抑制信息的调控点。DNA复制发生在S期，在M期发生染色体的分离和胞质分裂，M期之后，细胞重返G。期而撤离细胞周期。研究表明，未能通过G1/S检查点的细胞也将退出细胞周期，并走向衰老（图16-3)。目前认为，主要有两条途径调控细胞的衰老：一是复G。期制性衰老的调控，它依赖于p53----+p21、pRb一E2F信号通（撤离细胞周期）路的调控；二是氧化应激诱导的非端粒依赖性细胞衰老，它受ERK一p38MAPK一p16一pRb信号通路的调控。在复制性衰老中，当细胞染色质末端端粒显著缩短时，p53G2期被激活，促进p2J c;p//Wafl基因转录，p2l Cipl/WaO为一种CKI,衰老它通过抑制Cdk的活性，使pRb蛋白磷酸化受阻，与S期（撤离细胞周期）相关的转录因子E2F不能被释放，DNA复制不能进行，S期细胞无法从GI期进入S期，导致细胞周期停滞；在氧化(DNA合成）图16-3细胞周期与细胞衰老应激诱导的非端粒依赖性细胞衰老中，ERK的激活促使丝裂原启动激酶(MKK3和MKK6)的积累，进而激活p38MAPK通过Cdk抑制因子p16影响Rb磷酸化而导致细胞周期停滞。总之，细胞衰老的原因及其机制是非常复杂的，虽然关于衰老的研究巳引起人们广泛的关注，近年来对其分子机制的探讨也取得了一些突出的、很有意义的成果，但要真正揭示衰老的机制，显然还有很长的一段路要走。


医学细胞生物学 364第四篇细胞的基本生命活动  四、细胞衰老与疾病 除前面提到的早老性疾病，如Hutchin son-Gilford和Werne1早衰症之外，一般认为，细胞衰老与老年性疾病如神经退行性疾病、动脉粥样硬化性心血管疾病、糖尿病及肿瘤等密切相关。许多研究表明，组织干细胞衰老是机体衰老的重要原因之一，也与某些老年性疾病的发生相关联。例如，人间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSC)随着年龄的增加，其增殖和分化能力逐渐下降；随着年龄的增长，神经干细胞分化为神经元的能力也逐渐下降。可以相信，尽管衰老与死亡是不可避免的生命规律，但随着衰老机制的阐明，延缓衰老特别是对阐述老年性疾病的发生机制和防治退行性疾病是能够做到的。


医学细胞生物学 366第四篇细胞的基本生命活动第二节细胞死亡 细胞死亡是指细胞生命现象的终结。细胞死亡的进程可以很快，如剧烈的理化因子可使细胞迅速死亡。但在非剧烈因素作用时，细胞死亡有一定的自然过程，尤其从细胞衰老到细胞死亡是一个渐进的过程，并且常有特征性的形态改变：细胞核对各种有害因子的反应最为敏感，如果核内的基因及其控制系统受到损伤，则转录、翻译等过程将中断，细胞的生命过程将改变或停止，细胞接近死亡时，核膜多发生断裂，DNA与蛋白质降解产物泄涌至核外，核仁亦逐渐溶解和消失；胞质内可发生内质网、线粒体肿胀，线粒体蜡断裂和消失；细胞表面微绒毛逐渐减少、消失；细胞的体积因失水而变小或因细胞间水分内渗而变大。由于细胞死亡原因的多样性，细胞死亡时形态改变的过程和程度也不完全一样。引起细胞死亡的原因很多，细胞死亡的现象也错综复杂。根据死亡原因的不同，可以将细胞死亡分为正常死亡和非正常死亡。正常死亡一般表现为个体发育过程中的生理性死亡，但在某些病理因素条件下也呈现出这种死亡状态；非正常死亡主要指超过细胞可以承受的强度或阙值的环境因子引起的死亡，以及由千机体病理状态导致的细胞死亡。


医学细胞生物学 一、细胞死亡的方式 在正常生理和病理条件下，细胞可呈现出多种类型的死亡方式，目前发现主要有以下几类：1.细胞凋亡细胞凋亡指在特定信号诱导下，细胞内的死亡级联反应被触发所致的生理或病理性、主动性的死亡过程。细胞凋亡多发生于生理情况下，也可发生在病理情况下。细胞凋亡时，质膜始终保持完整，胞膜内陷将细胞内容物包被成一些痪状小体，即凋亡小体(apoptot i c body)，后者被周围吞噬细胞吞噬，不引起炎症反应。近些年来发现，过度的细胞自噬将导致细胞死亡，因其死亡过程（程序性死亡）同细胞凋亡，被称为JI型凋亡。


医学细胞生物学 二、细胞凋亡的概念与特征 （一）细胞凋亡是由死亡信号诱发的受调节的细胞死亡过程细胞凋亡(apop tosi s)是细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命的过程。“apoptosis”来源于希腊语，“apo”意为“分离”,“plo si s”指花瓣或树叶的脱落、凋零。当时选用这个词，是为了强调这种细胞死亡是自然的生理学过程。目前很多情况下，细胞凋亡亦被称作程序性细胞死亡(programmed cell death, PCD)，即在一定时间内，细胞按特定的程序发生死亡，这种细胞死亡具有严格的基因时控性和选择性。但有些学者认为细胞凋亡与PCD有一定的区别，PCD是一个功能性概念，描述在一个多细胞生物体中，某些细胞的死亡是个体发育中一个预定的，并受到严格控制的正常组成部分，而凋亡是一个形态学概念，指与细胞坏死受到不同的基因控制的细胞死亡形式；PCD的第十六章细胞衰老与细胞死亡367最终结果是细胞凋亡，但细胞凋亡并非都是程序化的。此外，细胞凋亡也可见千PCD之外的病理状气硒态，如抗癌药所致的癌细胞死亡、循环负荷过重引起的细胞死亡等（动画16-1“细胞凋亡的动态过程”)。


医学细胞生物学 二、细胞凋亡的概念与特征 细胞凋亡现象普遍存在于人类及多种动、植物中，是多细胞生物体个体正常发育、维持成体组织结构不可缺少的部分，贯穿于生物全部的生命活动中，它是细胞生理性死亡的普遍形式。例如人体内每天有5xl011个血细胞通过细胞凋亡被清除，以平衡骨髓中新生的血细胞。哺乳动物神经系统的发生过程也是细胞凋亡的典型例子。在脊椎动物发育早期，一般先要产生过量的神经元，但后来近一半的神经元发生凋亡，只有那些与靶细胞（如肌肉细胞、腺体细胞等）建立起良好的突触联系，并充分接受了靶细胞分泌的存活因子的神经元才保留了下来（图16-4)。 :-©)．乙）．，／飞3..O)．0A靶细胞 图16-4细胞凋亡的事例A发育中神经细胞的凋亡；B哺乳动物手指和脚趾在发育早期是连在一起的，指（趾）间的蹊通过细胞凋亡被清除，使单个指（趾）分开；C幼体的蜊斛向成体发育过程中尾部细胞的凋亡一旦正常的细胞凋亡过程受到破坏，将引起一系列的疾病，包括癌症、感染性疾病、自身免疫性疾病等。例如，肿瘤的侵袭转移涉及肿瘤细胞黏附、基质降解、肿瘤细胞的迁移等，而失巢凋亡在肿瘤细胞的扩散和转移中起重要作用。


医学细胞生物学 :-©)．乙）．，／飞3..O)．0A靶细胞 （二）细胞凋亡呈现出特征性形态学变化主要包括细胞皱缩(cell shrinkage)、染色质凝聚(chromatin condensation)、凋亡小体形成、细胞骨架解体等，其中以胞核的变化最为显著。1细胞核的变化凅亡细胞的核DNA在核小体连接处断裂成核小体片段，并向核膜下或中央部异染色质区聚集，浓缩成染色质块，使细胞核呈现新月状、花瓣状等多种形态（图16-5)，染色质进一步聚集使核膜在核膜孔处断裂，形成核碎片或核残片。 368第四篇细胞的基本生命活动 2细胞质的变化由于脱水作用，凋亡细胞的胞质发生明显浓缩，其中的细胞器也发生不同程度的变化，尤其是线粒体和内质网。凋亡早期，可观察到细胞内线粒体增大，崝增多，接着线粒体出现空泡化。多数•情况下，凅亡细胞内的内质网腔增殖膨大，并为凋亡细胞形成的自噬体结构提供包裹膜。凋亡细胞原有的疏松有序的细胞骨架结构也变得致密和紊乱。细胞骨架的改变不仅仅是细胞凋亡的后果，还影响到细胞凋亡的过程。


医学细胞生物学 368第四篇细胞的基本生命活动 3.细胞膜的变化凋亡细胞表面原有的特化结构，如微绒毛、细胞突起及细胞间连接等逐渐消失，细图16-5凋亡细胞核的“新月状”结构（由浙江大学李继承提供）胞膜起泡，但细胞膜仍保持完整，没有失去选择通透性。一些与细胞间连接有关的蛋白质从凋亡细胞的膜上消失，但正常情况下位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine, PS)则从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露于细胞外环境中。这些分子可能与凋亡细胞的清除过程有关。


医学细胞生物学 368第四篇细胞的基本生命活动 4凋亡小体的形成凋亡小体的形成有三种方式：心发芽脱落机制。凋亡细胞内聚集的染色质块，形成大小不等的核碎片后，整个细胞通过发芽(budding汃起泡(zeiosis)等方式，形成一个球形的突起，并在根部绞窄脱落，形成一些大小不等，内含胞质、细胞器以及核碎片的膜包小体，即凋亡小体（图16-6);(2)分隔机制。在凋亡细胞内由内质网分隔成大小不等的分隔区，靠近细胞膜端的分隔膜与细胞膜融合并脱落形成凋亡小体；＠自噬体形成机制。凋亡细胞内线粒体、内质网等细胞器和其他胞质成分一起被内质网膜包裹形成自噬体，自噬体在与凋亡细胞膜融合后排出胞外，形成凋亡小体。有些细胞不形成凋亡小体，而仅仅发生核固缩和胞质浓缩，成为单个致密的结构，这也被称为凋亡小体。在病毒性肝炎中见到的嗜酸性小体(councilman body)就是凋亡小体的例子。


医学细胞生物学 368第四篇细胞的基本生命活动 图16-6扫描电镜下的凋亡细胞表面变化（山东大学辛华提供）A正常细胞；B微绒毛消失；C.凋亡小体（三）细胞凋亡时细胞生化改变的复杂性和多样性1. DNA片段化核小体(nucleosome)是基因组染色体的基本结构，它和连接区(linker)组成核心核小体亚单位(core n ucleosomal subunit)，总长度为180~200bp。细胞凋亡时，细胞的内源性核酸内切酶(endon uclease)活化，特异地在连接区切断DNA链。因此，形成长度为180~200bp整数倍的寡聚核背酸片段，这种DNA片段化(fragmentation)的结果是在进行琼脂糖凝胶电泳时，凋亡细胞表现出特征性的DNA梯状条带(DNA ladde1)（图16-7)。而细胞坏死时，DNA随意断裂为长度不一的片段，琼脂糖凝胶电泳呈＂弥散状”(smear)。因此，尽管不是所有凋亡细胞都出现DNA梯状条带，人们仍把它«？勹？作为细胞凋亡最典型的生化特征之一。


医学细胞生物学 第十六章细胞衰老与细胞死亡369亡凋慫笭`淤淤令心勹§吃DNA内切酶A核小体B 图16-7凅亡细胞DNA凝胶电泳时呈现梯状条带A细胞凋亡中DNA内切酶的活化；B细胞凋亡所形成的180~200bp整倍性DNA片段2细胞凋亡中的蛋白酶细胞凋亡的始动，以及发生、发展，主要是通过多种蛋白酶控制的，蛋白酶级联切割可能是凋亡最关键的过程，因此有学者提出蛋白酶的作用是凋亡机制的核心部分。控制凋亡的蛋白酶有多种，如胱夭蛋白酶(cystein aspa rtic acid specific proteas e, caspase)家族、端粒酶或分裂素及钙蛋白酶(calpain)等。


医学细胞生物学 第十六章细胞衰老与细胞死亡369亡凋慫笭`淤淤令心勹§吃DNA内切酶A核小体B 3胞质Ca气pH的变化有研究认为C汒能通过两条途径诱导细胞凋亡。一是胞内Ca2＋库释放，胞外C汒内流使胞质内Ca2＋持续升高，作为凋亡信号启动凋亡；二是Ca2＋的释放打破了细胞内结构的稳定，使细胞凋亡系统的关键成分与正常时不能接触到的基质发生反应，从而触发凋亡。胞内的W和Ca2＋一样，其浓度对生命活动影响重大。用地塞米松诱导巨噬细胞凋亡时，可观察到胞质内的pH先是急速升高，之后又缓慢降低，胞质逐渐碱化，这表明胞质碱化和酸化均能影响细胞凋亡，前者可能与细胞凋亡的启动有关，而后者可能是细胞凋亡的必然结果。


医学细胞生物学 第十六章细胞衰老与细胞死亡369亡凋慫笭`淤淤令心勹§吃DNA内切酶A核小体B 4线粒体在细胞凋亡中的作用细胞凋亡有胞核和胞质两条途径，即胞质中的细胞器也是凋亡的主要目标，尤其是凋亡时，线粒体发生一系列显著的变化：心线粒体呼吸链受损，能量代谢受到破坏，导致细胞死亡；＠线粒体释放细胞色素C(cytochrom e C, cyt C)，而cy t C是凋亡所必需的胱天蛋白酶家族的激活物；＠线粒体是细胞产生活性氧类物质(reactive oxygen species, ROS)的主要来源，ROS是细胞凋亡的信使分子和效应分子，凋亡时线粒体生成ROS增多；＠线粒体渗透转变孔(permeab山ty transition pore, PT pore)通透性增高这是凋亡早期的决定性变化。PT孔是线粒体内膜和外膜在接触部位协同组成的一条通道，PT孔的开放可导致线粒体呼吸链解耦联，并且线粒体内的cy t C可通过开放的PT孔释放至胞质，进而触发caspase级联反应。PT孔开放抑制剂，如环抱素(cyclosporin)，能够阻断细胞凋亡，表明PT孔在凋亡过程中具有重要作用。此外，有学者曾提出线粒体调控细胞凋亡的观点，可见线粒体在细胞凋亡过程中起很重要的作用。 （四）失巢凋亡是又一种形式的细胞程序死亡 失巢凋亡(ano如s)是又一种形式的细胞程序死亡，是因细胞与细胞外基质和其他细胞脱离接触而诱发的。正常的上皮或内皮细胞具有黏附依赖性，其存活依赖于细胞间和细胞与基质间的信号传递，称为铀定依赖。正常上皮细胞或不具备转移性质的实体瘤细胞从原位脱落进入血流后就会引发细胞凋亡，这种在脱离原来生存环境的特殊情况下发生的细胞凋亡称为失巢凋亡。这种现象在某些细胞分化生长周期短、组织更新快的细胞中表现更为明显。例如，小肠上皮是入体内更新最快的组织之一，小肠上皮细胞从基底膜移动到上皮表面只需要6~7天的时间。小肠上皮细胞的生长和分化对基底膜的依赖性更为明显。因此，一旦发生脱落，细胞就很容易发生凋亡。在体外培养的情况下，小肠上皮细胞也很容易出现凋亡现象，因此经常以小肠上皮细胞作为研究凋亡现象的对象。除上皮细胞和内皮细胞外，其他类型的细胞也出现失巢凋亡现象，如骨骼肌细胞某些致瘤潜力低的黑色素瘤370第四篇细胞的基本生命活动细胞以及胚胎成纤维细胞等。失巢凋亡的意义在于防止这些脱落的细胞种植并生长于其他不适宜的地方。而肿瘤细胞，尤其是一些容易发生远处转移的恶性肿瘤细胞，具有极强的抗失巢凋亡特性，从瘤体上脱落进入循环系统后并不发生凋亡，从而完成转移过程。恶性肿瘤的这种抗失巢凋亡特性已经在肺癌、肠癌、卵巢癌、恶性黑色素瘤、口腔鳞状细胞癌等的癌细胞体外培养实验中得到证实。


医学细胞生物学 （四）失巢凋亡是又一种形式的细胞程序死亡  （五）细胞凋亡与细胞坏死的比较 由于细胞凋亡是一种主动的、由基因决定的细胞自杀(cell su i cide)过程，其性质与细胞坏死完全不同，两者属千截然不同的细胞学现象。细胞坏死是指细胞受到激烈的物理、化学刺激或严重的病理性刺激后，引起的细胞损伤和死亡。细胞坏死时，细胞膜发生渗漏，细胞内容物（包括膨大、破碎的细胞器以及染色质片段等）释放到胞外，导致炎症反应；而在细胞凋亡过程中，细胞膜反折并包裹断裂的染色质片段或细胞器等，随后逐渐分离而形成众多的凋亡小体，并最终为邻近的吞噬细胞所吞噬破坏。行使吞噬功能的细胞一般是巨噬细胞，有时是上皮细胞或血管内皮细胞。整个凋亡过程中，细胞膜的完整性保持良好，死亡细胞的内容物不会逸散到胞外环境中，因此并不引发炎症反应（图16-8)。


医学细胞生物学 细胞坏死凋亡细胞器肿胀石染色质凝集呈絮状戎尽豐詈尽密呈半月状核固缩DNA片段化乙＼产凋亡小体形成霄勹1吞噬凋亡小体释放细胞内容物吞噬细胞炎症反应三、细胞凋亡的影响因素 随着细胞凋亡在医学、生物学方面研究的深入，人们发现能诱导细胞凋亡的因素越来越多。同一组织和细胞受到不同凋亡诱因的作用，其反应结果不尽相同，而同一因素对不同组织和细胞诱导凋亡的结果也各不相同。目前，多数研究者认为，细胞凋亡的发生受以下两种因素调节。B)、神经递质（谷氨酸，多巴胺，N－甲酰－D－天门冬氨酸）、Ca气糖皮质激素等。 第十六章细胞衰老与细胞死亡371 (2)损伤相关因子：热休克、病毒感染、细菌毒素、原癌基因（如myc, rel，腺病毒EJ A等）、抑癌基因（如野生型p53基因）、细胞毒性T淋巴细胞、氧化剂、自由基、缺血、缺氧等。(3)疾病治疗相关因子：化疗、放疗、生物治疗、中药治疗等。(4)其他有某些细胞毒性物质：如乙醇、氧化碑、B－淀粉样肤等。2细胞凋亡的抑制因素(1)生理性抑制因子：如bcl-2原癌基因、突变型p53、各种生长因子、细胞外基质、CD40配体、一些中性氨基酸、锌以及雌、雄激素。


医学细胞生物学 第十六章细胞衰老与细胞死亡371 (2)病毒基因：如腺病毒EJ B、杆状病毒、牛瘛病毒crmA、EB病毒BHRFJ及LMP-1、单纯疤疹病毒等基因。(3)其他：线虫的ced-9基因、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、钙蛋白酶抑制因子、促癌剂（如PMA等）。


医学细胞生物学 四、细胞凋亡的分子机制 大量的研究资料表明，细胞凋亡与某些基因的调控作用密切相关，因此人们将这些基因称为凋亡相关基因，并开始用它们来解释凋亡的分子机制。（一）细胞凋亡受多种基因调控1调控细胞凋亡的ced基因和caspase基因家族(1)从线虫中发现调控细胞凋亡的ced基因：有关细胞凋亡的基因调控资料，最早和最完整的都来自对线虫体细胞凋亡的研究。由于线虫成虫的体细胞仅有1090个，在发育过程中共有131个体细胞发生凋亡，研究者们可以从其受精卵起追踪每一个胚胎细胞的发育和分化过程。研究巳发现有15个基因在不同程度上与线虫的细胞凋亡有关，并可大致分为4组：第一组基因在线虫的凋亡调控中有重要意义，包含ced-3、ced-4和ced-9基因；第二组包含7个基因，即ced-1、ced-2、ced-5-ced-8以及ced10，它们与凋亡细胞被吞噬清除过程有关，但与细胞死亡本身无关；第3组包含核酸酶基因1(nmc-1),如果nmc-1发生突变，则DNA裂解受阻，但并不能抑制细胞死亡，这也表明nmc-1并非凋亡所必需；第4组是影响特异细胞类型凋亡的基因，包括ces-1、ces-2(ces表示线虫细胞存活的调控基因）以及egl-1和her-I，它们与某些神经元和生殖系统体细胞的凋亡有关。


医学细胞生物学 四、细胞凋亡的分子机制 ced-3和ced-4基因：在线虫所有凋亡细胞中，均有ced-3和ced-4的表达，这两个基因的激活是线虫细胞凋亡起始或继续所必需的。一旦基因突变使ced-3或ced-4灭活，将阻碍正常凋亡的发生，使发育过程中本该死亡的细胞也存活下来。ced-3和ced-4基因主要表达在线虫胚胎发生期，此期正是凋亡多发期。ced-9基因：ced-9基因的作用与ced-4基因相反。ced-9能抑制胱夭蛋白酶的活化，从而抑制线虫体细胞凋亡的发生，因此ced-9也被称为“抗凋亡基因“(an t i-apoptosis gene)。ced-9的显性突变可阻止那些注定要死亡的细胞不发生凋亡，而其突变失活则导致正常情况下应存活的细胞发生凋亡。


医学细胞生物学 四、细胞凋亡的分子机制 (2)哺乳动物的caspase家族蛋白是ced基因产物的同源体：人们已发现哺乳类细胞中存在ced-3的同源物胱夭蛋白酶家族，后者是一组半胱氨酸天冬氨酸酶，它们的共同特点是能特异性地断开天门冬氨酸残基后的肤键。胱夭蛋白酶家族有十余个成员，是凋亡过程最重要的影响因素之一，但不同成员在凋亡中起的作用不全相同，如caspase-1, caspase-11主要参与白细胞介素前体的活化，并不直接参加凋亡的信号转导；而caspase-2、caspase-8、caspase-9和caspase-10参与凋亡的起始；参与凋亡执行的是caspase-3、caspase-6和caspase-7，它们能降解多种底物，导致核纤层和细胞骨架的断裂崩解等。目前认为，凋亡的起始者（如caspase-8)与执行者（如caspase-3)之间存在上下游的关系，即起始者活化执行者。ced-4的哺乳类同源物直到1997年才被证明是细胞凋亡蛋白酶活化因子－1(apoptos is protease acti vating factor-I, Apaf-1); ced-9与哺乳动物的bcl-2家族具有一定的同源性。


医学细胞生物学 四、细胞凋亡的分子机制 经典实验：细胞程序性死亡相关基因的鉴定背景知识自20世纪60年代起人们认识到细胞死亡是动物发育过程中的正常事件，可能是某些注定死亡的细胞受到精细调控的结果。线虫作为生物发育研究中的重要的模式生物，在细胞程序性死亡的调节和机制研究方面起着至关重要的作用。70年代，通过显微分析的方法构建了线虫发育的图谱，这一研究成果使人们得以了解线虫胚胎起源和每个细胞的定向分化情况，尤其是引入了一种特殊的细胞程序性死亡模式。1977年，J. Sulston和H. R. Horvitz发现在线虫成虫发育早期的1090个细胞中，有131个发生程序性死亡。同一类型的细胞在所有的胚胎中同时死亡，说明这种类型的细胞在胚胎发育中死亡是正常的发育现象。并且这种类型的细胞在死亡过程中呈现出相似的形态学变化，提示这种细胞的程序性死亡过程受相同的机制调控。为进一步探讨线虫发育过程中细胞程序性死亡的机制和调节方式，Horvi tz等进行了一系列遗传学分析。在1986年发表于Cell的文章上，H. M. Ell is和Horvitz首次报道了2个线虫发育过程中的细胞程序性死亡相关基因。自此，拉开了凋亡分子生物学研究的序幕。


医学细胞生物学 第十六章细胞衰老与细胞死亡373后续影响 Ell is和Horv itz通过分离线虫突变体首次鉴定了细胞程序性死亡相关基因。ced-3、ced-4以及后未鉴定的ced-9基因编码的蛋白在生物进化中高度保守，是凋亡发生中的起主要作用的调节因子和效应因子的蛋白前体。ced-3的克隆和测序结果显示它与之前在哺乳动物中鉴定的caspase蛋白酶原同原。线虫ced-9基因与人B淋巴细胞中分离的凋亡抑制因子bcl-2原癌基因同源。Ced-4与人类凋亡蛋白酶原激活因子1(Apaf-1)同源。线虫中这些细胞程序性死亡相关基因的鉴定为深入理解凋亡的分子基础和正常组织发育的机制奠定了基础。由于凋亡的异常,调节与包括癌症、自主免疫系统疾病、神经退行性疾病在内的许多疾病相关，Ellis和Horvi tz的:科学发现在生物学和医学领域产生了深远的影呴。由于其贡献，Ho1-vitz和英国的S. Brenner以'及Suls ton共同荻得了2002年诺贝尔生理学或医学奖。


医学细胞生物学 第十六章细胞衰老与细胞死亡373后续影响 2既能抑制又能促进细胞凋亡的bcl-2基因家族bcl-2基因是B细胞淋巴瘤／白血病－2(B-cell lymphoma/leukemia-2, bcl-2)的缩写。bcl-2蛋白不仅存在千B细胞淋巴瘤中，也见千许多正常组织和胚胎组织中，如神经组织、分泌腺的导管细胞、人和胚胎的皮肤，以及胚胎的肾脏与软骨组织。随着研究的深入，bcl-2蛋白家族不断扩大，其中有的成员对凋亡起抑制作用，如bcl-2可防止或延迟由丫－辐射、糖皮质激素、热休克和多种化疗药物所诱导的细胞凋亡，故b cl-2基因也被称作“存活基因“(sm-vival gene)；但有的是凋亡的促进者，如bad、bax等。bcl-2家族的氨基酸序列除了在BHl、BH2和BH3三个区段有高度保守性外，在氨基端还有一个比较保守的区段S1，这可能是调节凋亡以及蛋白质相互作用所必需的结构。


医学细胞生物学 第十六章细胞衰老与细胞死亡373后续影响 3.可促进细胞凋亡的ice基因白细胞介素－1~转换酶(interleukin-!~converting enzyme, ICE)基因与线虫的ced-3基因在DNA序列上高度同源。ICE蛋白是一种半胱氨酸蛋白酶，其作用是将前白细胞介素－1~分解成有生理活性的白细胞介素－l B。ICE过度表达可诱导哺乳动物成纤维细胞发生凋亡，而ICE的抑制剂，如牛痉病毒cr-mA基因产物可通过抑制ICE阻断凋亡的发生。4可触发细胞凋亡的Fas和Fasl Fas是属于肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor, TNFR)和神经生长因子受体(nerve growth factor receptor, NGFR)超家族的细胞表面分子，Fas配体(Fas ligand, FasL)是TNF家族的细胞表面分子。多种哺乳动物细胞表达Fas，而FasL仅表达于活化的T细胞。FasL与其受体Fas结合将导致携带Fas的细胞凋亡。入的Fas基因位于第10号染色体的长臂上，FasL的基因定位于第1号染色体，在结构上与TNF-a基因相似。


医学细胞生物学 第十六章细胞衰老与细胞死亡373后续影响 Fas/FasL的重要生理作用表现在：(DFas/FasL触发细胞凋亡。抗Fas抗体、表达FasL的细胞，以及可溶性的FasL与Fas交联后均产生细胞凋亡信息；＠Fas/FasL对免疫系统细胞的死亡起重要作用。以Fas为基础的和以穿孔素为基础的机制，是迄今发现的两种T细胞介导的细胞毒机制；＠Fas/FasL介导免疫＂豁免＂。正常情况下，眼睛是免疫豁免区，因病毒感染而进入前房的炎症细胞将通过Fas/FasL系统出现凋亡，然而缺乏有功能的FasL的突变小鼠在受到感染时，眼内出现了明显的炎症反应。


医学细胞生物学 第十六章细胞衰老与细胞死亡373后续影响 Fas系统参与清除活化的淋巴细胞和病毒感染的细胞，而Fas和FasL功能丧失的突变可致淋巴细胞积聚，进而导致自身免疫疾病；另一方面，一次注射抗Fas抗体足以使成年小鼠在几个小时内死亡，这些研究结果表明Fas系统具有重要的病理学意义。、5参与调节细胞凋亡的p53基因1979年，Li nzer研究病毒转染的哺乳动物细胞时发现了分子量为53kD的p53蛋白。后来，用克隆的鼠p53基因和激活的ras基因共同转染细胞，成功地诱发了肿瘤。到1989年，发现此前转染所用的是突变型p53基因，而野生型p53对细胞的生长有负调节作用，从而认定p53是抑癌基因。p53基因是肿瘤中突变频率最高的抑癌基因，研究表明它能引起细胞周期阻滞，诱导凋亡和促进细胞终末分化，因此与细胞凋亡存在密切关系。人类p53蛋白存在两种形式—野生型(wt p53)和突变型(mt p53)，二者均参与调节细胞凋亡，但前者对细胞增殖、转化有抑Qi}374第四篇细胞的基本生命活动制作用，故能促进凋亡，而后者可灭活前者的功能，抑制凋亡并导致细胞转化和过度增殖而产生肿瘤行为。


医学细胞生物学 第十六章细胞衰老与细胞死亡373后续影响 现已明确化疗药物、放射线及多种细胞因子等诱导的肿瘤凋亡过程中需要p53基因的参加，而糖皮质激素、钙离子载体和衰老等引起的凋亡却无需p53蛋白的存在，其中的确切机制尚不清楚。目前认为，p53基因产物p53蛋白是转录激活蛋白，作为“基因警卫“维持细胞基因的完整性、DNA损伤的修复以及细胞周期的正常运转。当p53基因缺失或异常时，p53失去监视作用，使细胞带着损伤的DNA进入S期，结果细胞因遗传不稳定性而产生突变和畸变，最后导致细胞癌变。可见，p53基因产物诱导细胞凋亡可提供一种防护机制，使DNA损伤的细胞不能存活。6. c-myc基因既是凋亡的激活因子又是抑制因素c-myc基因可以产生两种翻译产物c-Mycl和c-Myc2，两者的作用不同，有时甚至是相反的。c-myc主要参与转录，在转录过程中可以激活并诱导细胞周期进程和分化，也可以阻止细胞分化或引起凋亡，因此它既是凋亡的激活子又是凋亡的抑制因素。c-Mycl和c-Myc2的作用不能一概而论，并受作用细胞的微环境、时期、位点以及自身的质和量的影响。


医学细胞生物学 第十六章细胞衰老与细胞死亡373后续影响 除了上述基因或蛋白产物，其他一些基因如jun基因、c-fos基因及myb基因等都已证明与凋亡有关。然而，由千凋亡的研究起步较晚，凋亡的过程又异常复杂，至今有很多间题尚无法阐明，因此我们只能将这些基因称为凋亡相关基因，而不能简单地称之为凋亡基因，它们所引起的凋亡是在一定条件下、对特定的细胞而言的。（二）细胞凋亡的信号转导通路主要由死亡受体和线粒体介导细胞凋亡与细胞生长、分化一样，其过程一方面受细胞内和胞外多种信号的调控，另一方面也借多种生物信号在细胞间和细胞内的传递而得以实现。目前的研究表明，细胞凋亡的信号传导途径具有以下特点：心传导途径的启动可因细胞的种类、来源、生长环境及诱因的不同而存在差异；＠凋亡信号传导系统具有多样性；＠细胞凋亡的信号途径与细胞增殖、分化的途径存在一些共同通路；＠凋亡的多条信号途径间存在互通的交叉部分。现有研究表明，死亡受体和线粒体介导的细胞信号转导通路在细胞凋亡中起重要作用（图16-9)。


医学细胞生物学 第十六章细胞衰老与细胞死亡373后续影响 1死亡受体介导的信号转导通路细胞外的许多信号分子可以与细胞表面相应的死亡受体(death recep tor, DR)结合，激活细胞凋亡信号通路，导致细胞凋亡。哺乳动物的死亡受体属千肿瘤坏死亡受体介导的细胞凋亡途径线粒体介导的细胞凋亡途径i歹包 -勹一——


医学细胞生物学 -勹一—— 靶细胞<—_图16-9哺乳动物细胞凋亡的主要信号转导通路第十六章细胞衰老与细胞死亡375死因子受体和神经生长因子受体超家族，主要成员有Fas/Apo-l/CD95、DR-4/TRAIL-Rl、DR3/WSL1/Apo-3/TRAM P等。配体FasL与死亡受体Fas结合后，诱导Fas胞质区内的死亡结构域(death domain,DD)结合Fas结合蛋白(FADD),FADD再以其氨基端的死亡效应结构域结合caspase-8前体，形成Fas-F ADD-caspase-8前体组成的死亡诱导复合物(deat h inducing signaling complex, DISC)，激活caspase-8，活化的caspase-8可以进一步激活执行死亡功能的效应蛋白caspase-3,6,7等，导致细胞凋亡。


医学细胞生物学 -勹一—— 2线粒体介导的信号转导通路研究表明，线粒体在细胞凋亡中处于凋亡调控的重要位置，许多凋亡信号（如DNA损伤、氧化剂等）都可以引起线粒体的损伤和膜渗透性改变。很多bcl-2家族的蛋白，如bcl-2、bax、bcl-XL等都定位于线粒体膜上，bcl-2通过阻止cyt C从线粒体释放来抑制凋亡；而bax则通过与线粒体上的膜通道结合，促使cyt C的释放而促进凋亡。进入胞质的cy l C可以与Apai--1一起与caspase-9的前体结合，从而导致caspase-9的活化，后者可以激活caspase-3，引起细胞凋亡。此外，活化的caspase-8，一方面作用于caspase-3前体，另一方面催化BID(bcl-2家族的促凋亡分子）裂解成两个片段，其中含有BH3结构域的C－端片段被运送到线粒体，引起线粒体内cyt C高效释放。BID诱导cyt C释放的效率远高于bax。最近的研究表明，线粒体内可能存在核酸内切酶G(endonuclease G)、凋亡诱导因子(AIF)和凋亡抑制因子(IAP)的抑制蛋白Smac/D iablo，这些蛋白因子可能参与了不依赖caspases的凋亡途径。


医学细胞生物学 -勹一—— 3其他转导通路内质网和溶酶体在细胞凋亡中也起重要作用。内质网与细胞凋亡的联系主要表现在两个方面：心内质网对Ca2窟离子浓度的调控。很多细胞在凋亡早期会出现胞质内Ca2•浓度的升高，这种浓度的升高由细胞外Ca2＋的内流和胞内钙库（内质网）中Ca2＋的释放所致。胞质内高浓度的Ca2＋一方面可以激活胞质中的钙依赖性蛋白激酶，另一方面可影响线粒体外膜的通透性促进细胞凋亡。而内质网膜上的凋亡抑制蛋白Bcl-2则具有维持胞质内Ca"浓度稳定、抑制凋亡的作用。(2)caspase在内质网的激活。胞质内Ca2＋浓度的升高等因素可激活位于内质网膜上caspase-12，活化的caspase-12被转运到胞质中参与caspase-9介导的凋亡过程。 五、细胞凋亡的检测 检测细胞凅亡的方法有很多，归纳起来，可分为三方面：形态学检测、生化检测和流式细胞仪检测。


医学细胞生物学 (—)形态学检测 形态学检测是鉴定细胞凋亡最可靠的方法之一。主要是通过光学显微镜和电子显微镜，对组织或细胞进行各种染色，如HE染色、甲基绿－派诺宁染色、Gi emsa染色，可在普通光学显微镜下观察；用荧光染料，如叮唗橙，Hoech s t33258染色，在荧光显微镜下观察；或制成超菏切片用电子显微镜观察，都可以区分细胞凋亡与坏死。 （二）生化特征检测 细胞凋亡最显著的生化特征是Ca2•,M忙依赖的内源性核酸酶激活后，将细胞核染色体从核小体间断裂，形成约为180-200b p或其多聚体组成的舞核昔酸片段。针对此寡核昔酸片段发展了检测凋亡的琼脂糖凝胶电泳法、原位末端标记法和ELISA法等，这些方法具有很高的特异性和敏感性，为凋亡的研究提供了强有力的工具和手段。


医学细胞生物学 （三）流式细胞仪检测 用流式细胞仪检测细胞凋亡有其他方法不可比拟的优越性，既可定性又可以定械，且具有简单、快速和敏感性高等优点通过流式细胞仪，还可以将细胞分类后作进一步形态学和生化分析。流式细胞仪检测凋亡的原理，主要是根据凋亡引发的在细胞、亚细胞和分子水平所发生的特征性改变（包括细胞膜细胞器和细胞核等的改变），造成染色体荧光染料(fluorochromes)对凋亡细胞DNA可染性(DNA s La inab山ty)发生改变，以及细胞形态的改变影响了光散射特性。用流式细胞仪可以检测出凋硕01}376第四篇细胞的基本生命活动亡的亚二倍体细胞，即凋亡细胞在DNA直方图上正常二倍体细胞的G。/GI峰前出现一个亚二倍体峰，即凋亡峰(apoptoti c peak, AP峰）。已有研究人员开发出用千检测细胞凋亡的试剂盒，如双重凋亡检测试剂盒，它利用凋亡细胞中NO合成水平的变化，以及胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸在凋亡时翻转到膜外的特点，结合荧光染色，实现在同一个细胞中检测上述两个凋亡事件，灵敏度和特异性都很高。


医学细胞生物学 六、细胞凋亡与疾病 细胞凋亡是机体维持自身稳定的一种生理机制。机体通过细胞凋亡清除损伤、衰老与突变的细胞，维持生理平衡。某些致病因子可使细胞凋亡的基因调控失常，致使细胞凋亡减弱或增强，从而破坏了机体细胞的自稳态，最终导致各种疾病的发生。 （一）细胞凋亡过低导致相关的疾病发生 1细胞凋亡与肿瘤细胞凋亡在肿瘤的发病机制中占有重要地位。癌变前的细胞可以通过细胞凋亡的正常调节而被清除。恶性肿瘤发病过程中，常可见到凋亡抑制基因和凋亡活化基因表达异常。如在入的肿瘤细胞中常常检测到p53基因的突变或缺失，使细胞对DNA损伤敏感性大大降低，细胞凋亡发生障碍进入无序、失控的生长状态。一般肿瘤细胞高表达FasL，借以凋亡淋巴细胞，而又低表达Fas，而降底凋亡，这就形成肿瘤细胞有逃逸免疫及凋亡耐受的特性。


医学细胞生物学 （一）细胞凋亡过低导致相关的疾病发生 2.细胞凋亡与系统性红斑狼疮系统性红斑狼疮(systemic lupus e1-ythematosus, SLE)是典型的自身免疫性疾病。由千Fas表达缺陷，引起自身反应性T细胞阴性选择的凋亡功能丧失，导致T淋巴细胞凋亡障碍，因此在外周淋巴器官出现大量CD4+,CD8十的T淋巴细胞，这些细胞具有自身反应性，从而引起SLE自身免疫性疾病。 （二）细胞凋亡过度导致相关的疾病发生 1.细胞凋亡与神经退行性疾病中枢神经系统不同部位特殊类型神经元的丧失是各种神经退行性疾病的病理特点，细胞凋亡与神经元的丢失密切相关。现已发现，caspase-3在神经退行性疾病的病理过程中担任重要的角色，它不仅是起着凋亡的效应器作用，还能直接与阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、亨廷顿舞蹈病、脊椎小脑失调等疾病的致病蛋白质分子相互作用，参与致病过程。AD伴随B－淀粉样蛋白在病灶中央进行性堆积，研究结果显示，B-淀粉样蛋白能诱导神经元凋亡，但能被抗氧化剂阻断。已经在肌萎缩患者体内发现有与神经元凋亡抑制蛋白有关的基因突变，使神经元凋亡抑制蛋白缺乏，导致脊髓前角运动神经元凋亡，肌肉出现失用性萎缩。


医学细胞生物学 （二）细胞凋亡过度导致相关的疾病发生 2细胞凋亡与AIDS病人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virns, HIV)感染，可导致艾滋病(AIDS)。HIV感染的宿主细胞膜表面，可表达gp l20，其受体存在于CD4+T淋巴细胞膜上。因此，当gpl20与CD4+T淋巴细胞结合后，可诱导CD4+T淋巴细胞凋亡，导致免疫系统崩溃。另外，HIV感染的外周血T淋巴细胞对TRAIL和FasL的诱导凋亡特别敏感。3.细胞凋亡与心血管疾病人类的血管内皮细胞、平滑肌细胞和心肌细胞的凋亡是多种心血管疾病发生与演变的病理学基础。在动脉粥样硬化、心肌病、急性心肌梗死，以及心力衰竭中均伴随着细胞凋亡。近年来对动脉粥样硬化的研究发现，细胞凋亡主要以血管平滑肌细胞和巨噬细胞凋亡为主。窦房结、房室结和希氏束细胞发生过多凋亡，引起心脏传导系统障碍而致心功能不全。 第三节细胞自噬 细胞自噬(autophagy)最早由T. P. Ashford和K. R. Porte t于1962年通过电子显微镜在人的肝细胞中观察到，是生物进化过程中被优先保留下来的一种维持细胞稳态的生理机制，其功能异常与许多疾病的发生发展密切相关。


医学细胞生物学 第十六章细胞衰老与细胞死亡—、细胞自噬的定义与分类 (—)细胞自噬的定义自噬源于古代希腊语，是“auto"(自我）与“phagy”（吞噬）的结合，顾名思义就是细胞的自我消化。自噬是指胞质内大分子物质和细胞器在膜包艇泡中大量降解的生物学过程。在自噬过程中，部分或整个细胞质、细胞器被包裹进双层膜的娱泡，形成自噬泡(autoph agic vac uole)或自噬体(au tophagosome)（图16-10)。自噬体形成后很快变成单层膜，然自噬体后与溶酶体结合形成自噬溶酶体(autop hagolysosome or autolysosome)。在自噬溶酶体中，待降解的物质在多种酶的作用下分解成氨基酸和核昔酸等，进入三狻酸循环，产生lµm小分子和能量，再被细胞所利用，实现细胞图16-10自噬体本身的代谢需要和细胞器的更新。所以，自显示在电镜下观察到的自噬体，自噬体内含有一个线粒噬作用在消化的同时，也为细胞内新细胞器体和一个过氧化物酶体的构建提供原料，即细胞结构的再循环。研究表明，细胞自噬与生物体的发育、分化相关，尤其是在低等生物中，受到环境胁迫因子的影响可以诱导细胞自噬现象的产生。因此，长期以来细胞自噬被认为是细胞的自救行为。但近年来发现，在某些条件下，细胞自噬也能导致细胞死亡，并证明细胞自噬的发生受多种基因的调控，如ATC(autophagyrelated)基因、蛋白激酶基因和磷酸酶基因等。目前的研究认为，细胞自噬只发生在细胞进入周期后，静止期细胞对自噬诱导因素不敏感。（二）细胞自噬可区分为几种类型根据细胞内底物运送到溶酶体腔方式的不同，哺乳动物细胞自噬可分为3种主要类型：微自噬(microautophagy)、巨自噬(macroautophagy)和分子伴侣介导的自噬(chaperone-medi ated autophagy, CMA)。巨自噬即通常所指的自噬，是自噬形式中最普遍的一种。巨自噬过程中，细胞质中的可溶性蛋白和变性坏死的细胞器被非溶酶体来源的双层膜结构包裹，即自噬泡，并被自噬泡携带到溶酶体中降解加工。微自噬主要是溶酶体的膜直接包裹，如长寿命蛋白并在溶酶体内降解。分子伴侣介导的自噬首先由胞质中的分子伴侣Hsc73识别底物蛋白分子的特定氨基酸序列并与之结合，分子伴侣－底物复合物与溶酶体膜上的受体结合后，转运到溶酶体腔中，被溶酶体酶降解，整个过程不需要痰泡的参与。CMA的底物是可溶的蛋白分子，所以，CMA降解途径在清除蛋白质时是有选择性的，而前两者无明显的选择性。为此，根据对降解底物的选择性，细胞自噬又分为非选择性自噬和选择性自噬两大类。非选择性自噬中，蛋白质或细胞器被随机运送到溶酶体中降解；而选择性自噬对降解的底物具有专一性，如线粒体自噬(mitophagy)就是这样一种通过自噬机制选择性清除受损伤或不必需的线粒体的过程，以保证细胞正常生命活动的进行。线粒体自噬的异常可能与神经退行性疾病，糖尿病和肿瘤的发生有密切关系。此外，分泌自噬(crinophagy)、过氧化物酶体自噬(pexophagy)、内质网自噬(reticulophagy)、核糖体自噬(ribophagy)、细胞核碎片状自噬(nucleophagy)、蛋白聚集物自噬(aggrephagy)、噬脂(l i poph agy汃异源自噬(xenophagy)等都属于有选择性的自噬。这些选择性自噬对特异性底物的清除通常包


医学细胞生物学 第十六章细胞衰老与细胞死亡—、细胞自噬的定义与分类 括两部分：待降解底物的识别与传递和利用自噬核心机制来实现降解。选择性自噬丰富了自噬的形式，使人们对自噬的形成机制有了更加深刻的认识。@378第四篇细胞的基本生命活动二、细胞自噬的发生过程与调控细胞自噬的发生过程主要包括4个阶段，即底物诱导自噬前体(proaulophagosome, PAS)的形成、自噬体形成、自噬体与溶酶体融合和自噬体内容物被降解。在即将发生自噬的细胞胞质中会出现许多游离双层膜结构，称为自噬前体。自噬前体逐渐形成杯状凹陷，包裹细胞质或损伤／衰老的细胞器（如线粒体、内质网等），形成自噬体（图16-llA)。然后与溶酶体融合成自噬溶酶体。在自噬溶酶体中，其内含物被水解酶重新降解成各自底物，如氨基酸、核昔酸等，供细胞重新利用。自噬体双层膜的起源尚不清楚，有人提出来源千粗面内质网，也有人认为来源千晚期高尔基复合体及其膜嵌泡，也有可能是重新合成的。因此，尚有待进一步研究证实。


医学细胞生物学 第十六章细胞衰老与细胞死亡—、细胞自噬的定义与分类 有多种基因产物参与到细胞自噬的发生过程。目前已经鉴定出几十种自噬相关基因ATC及其同源物，随着研究深入，越来越多ATC基因被发现。在哺乳动物自噬体形成过程中，由Atg3、Atg5、Atg7、AtglO、Atgl2参与的Atg复合蛋白过程和LC3(microtubule-associated protein l light chain3, MAP1-LC3)泛素化过程起着至关重要的作用。在自噬体形成的早期阶段，由Atgl2-Atg5-Atg16L形成的复合物即与其外膜结合，促进前自噬体的伸展扩张，使之由开始的小痰泡样、杯样结构逐渐发展为半环状、环状结构；此时，浆溶性LC3-I蛋白开始被泛素化修饰成LC3-II，并向膜上募集定位。当双层膜结构的自噬体即将形成环状闭合结构或刚刚闭合时，Atg5复合物便从膜上脱离下来，只留下膜结合形式的LC3-II定位千自噬泡膜上（图16-11B)。因此，LC3-II含址与自噬体数址的多少成正比，LC3-II蛋白表达水平或LC3II/I比可以用来衡量细胞自噬水平。（动画16-2“细胞自噬泡的形成过程及命运”).`.


医学细胞生物学 之，又R待降解物分隔膜包绕自噬体形成之飞}自噬体与溶酶体结合降解、再~环利用 图16-11细胞自噬过程A细胞自噬过程示意图；B自噬体（膜）形成（二）细胞自噬的调控细胞自噬作为生命现象中重要的生理性反应，其在不同条件下，以不同形式，形成不同程度的“动态平衡＂，这种平衡通常受到严格调控，以保持相对稳定。


医学细胞生物学 之，又R待降解物分隔膜包绕自噬体形成之飞}自噬体与溶酶体结合降解、再~环利用 岔，，自噬体的形成依赖千ill型磷脂酰肌醇三磷酸激酶(Class ill PI3K)的作用。Class ill PI3K可磷酸第十六章细胞衰老与细胞死亡379化磷脂酰肌醇(Ptdlns)，生成3－磷酸磷脂酰肌醇(Ptdlns3P)~Ptdlns3P募集胞质中含-FYVE－或－PX－基序的蛋白质，用千自噬体膜的形成，由此参与对细胞自噬的正向调控。此外，Class皿PI3K还可与Beclin l形成复合物参与自噬体的形成。自噬反应调控路径的mTOR信号途径，对细胞生长具有重要调节作用，可抑制自噬反应的发生，是重要的自噬反应直接负反馈调节分子。肿瘤抑制因子PTEN（为一磷酸酶）可促使PIP3去磷酸化，从而解除Class I PI3K/Akt(PKB)途径对自噬反应的抑制，是自噬反应的间接正反馈调节蛋白。p53作为重要的肿瘤抑制因子在多种生理和病理状态下参与自噬反应的正、负向调控，提示自噬反应在肿瘤的发生发展过程中起着重要作用。由千对细胞自噬研究时间不长，许多自噬相关基因的调控机制尚有待进一步深入研究。


医学细胞生物学 三、细胞自晊的医学意义 自噬可以帮助细胞抵抗衰老、饥饿等外界压力，但过度的自噬又将导致细胞发生程序性死亡，被称为Il犁凋亡。自噬对细胞的两面性作用导致其在疾病中起到复杂双刃剑效应。近期研究表明自噬作用在生物体生长发育、细胞分化及对环境应激的应答方面极为关键，对防止某些疾病如肿瘤、肌病、神经退行性疾病以及对抵御病原微生物的感染和延缓衰老、延长寿命等方面发挥重要作用。但在恶性肿瘤中，自噬的作用尚未确定。在恶性肿瘤的进展阶段，自噬可以帮助癌细胞对抗营养缺乏和缺氧，尤其是血供不良的实体性肿瘤。但研究表明，某些抗肿瘤治疗药物有可能通过自噬机制发挥作用，如被广泛用于乳腺癌治疗的药物它莫西芬可能通过激活细胞自噬，由神经酰胺介导上调Beclin1表达发挥作用。目前，自噬淜控机制、对疾病的意义尚有待进一步深入研究。随着科学研究的深入，自噬的进一步解密将帮助人们更好理解自身，基于自噬机制的临床治疗方法有望帮助人们缓解并治疗多种疾病。


医学细胞生物学 （李继承）岔。寸第五篇干细胞与细胞工程第十七章干细胞与组织的维持和再生 干细胞(stem cell)一词，最早出现千1896年E. B. Wilson关于蠕虫发育的研究论文中，但对于干细胞的深入研究，主要发生在近几十年。20世纪60年代，发现了小鼠骨髓中有造血干细胞的存在，并认识到了它可以分化为不同类型的血液细胞。80年代初，小鼠胚胎干细胞(embryon i c stem cell)被成功分离和培养，并证实了其具有形成三个胚层（外胚层、中胚层和内胚层）细胞的分化潜能。随后，干细胞研究领域便进入了一个快速发展阶段。特别是90年代以来，人类胚胎干细胞和一些组织干细胞陆续被分离培养成功，人们对其生物学特性认识也在不断深入，某些类型的干细胞（如造血干细胞、间充质干细胞等）巳经获批应用到疾病的临床治疗中。干细胞在肿瘤、衰老和再生等重大医学问题研究中的重要意义开始显现，干细胞治疗也逐渐成为最具潜力的新型治疗方法用来治疗某些难治性疾病，因此干细胞生物学已经成为连接生命科学和医学两大研究领域的一门重要学科。


医学细胞生物学 第一节干细胞概述一、干细胞的概念和分类 干细胞存在于人体或动物个体整个发育过程中的各种组织中，具有自我更新(self-renewal)和多向分化潜能(plurip o t e n cy)的基本生物学特性，是个体的生长发育、组织器官的结构和功能动态平衡的维持，以及其损伤后的再生修复等生命现象发生的重要基础。入和动物的个体都来自于一个单细胞，即受精卵。受精卯经过卵裂、燧胚、原肠胚及器官发生等胚胎发育阶段，以及胚后发育过程，最终发育成为一个成熟的个体，直至衰老死ICM亡。受精卯细胞的分裂即卵裂，在其分裂3次（即8细胞期）之前，所产生的每一个细胞（包括受精卵）都具有全能性，也胚胎胚泡期-i就是说，如果将处于这种状态的任何一个细胞植入子宫后，它,们都具有发育为一个完整个体的可能性。这种具有发育全能胚状体性的早期胚胎细胞，谓之全能干细胞(toti potent stem cell)。随/i\着发育的进行，早期胚胎形成一个中空的球性结构，称为胚外胚层中胚层内胚层泡。在胚泡内的一侧出现一个小的细胞团，即内细胞团(inne1i i i cell mass, ICM)。内细胞团细胞具有分化为成熟个体中所有类型细胞的潜能，是一种多能干细胞(pluripotent stem cell)。然而，单就内细胞团细胞来说，则没有形成一个完整个体的能力，因为它们不能分化为胎盘和其他一些发育时所必需的胚外组织。若将内细胞团细胞在体外培养，这就是习惯上所说图17-1胚胎干细胞的来源与早期分化目前胚胎干细胞(ES细胞）的主要来的胚胎干细胞(embryoni c stem cell, ES细胞）（图17-1)。随着源是植入前毅胚泡的内细胞团，在体外胚胎的继续发育，内细胞团细胞（即多能性细胞）将快速增殖培养环境中ES细胞首先形成胚状体和进一步地分化，逐步地形成三个胚层，以及相应的组织器(e mbryoid body)，并分化为三胚层干细官。这时，存在于各种胚胎组织器官发育的或在成体器官和胞，然后胚层干细胞再分化成不同的组组织中存在的干细胞，通常只分化成相应组织器官组成的细织细胞第十七章干细胞与组织的维持和再生383胞。如造血干细胞具有分化成血液系统所有细胞类型的潜能，参与肝脏发育的肝干细胞具有分化为成熟肝细胞和胆管上皮细胞的潜能，参与神经系统发育的神经干细胞具有分化为神经元、神经胶质细胞的潜能。这类在组织器官发育过程和成体组织修复和再生中起着重要作用的干细胞被称为组织特异性干细胞(tissue-specific stem cell，简称组织干细胞），或者成体干细胞(adult stem cell)，它是一种专能性干细胞(mult i potent stem cell)。另外成体组织中还有一种干细胞被称为单能干细胞(un ipotent stem cell)，但只能向一种密切相关的细胞类型分化，与分化细胞不同的是它具有自我更新能力，如上皮组织基底层干细胞，肌肉中的成肌细胞等。


医学细胞生物学 第一节干细胞概述一、干细胞的概念和分类 从以上叙述可以看出，个体发育的各个阶段都有干细胞的存在。从全能性的受精卯到多能性的内细胞团再到专能性的成体干细胞直至成体内的单能干细胞，随着个体发育的进行，干细胞的分化潜能是一个逐渐变窄的过程。可以说，受精卵、内细胞团细胞的增殖和分化是机体发育的基础，成体干细胞的增殖和分化是成年动物组织和器官稳态的维持、损伤修复以及再生的基础。


医学细胞生物学 第一节干细胞概述一、干细胞的概念和分类 经典实验：小鼠胚胎干细胞的分离培养背景知识早期胚胎细胞具有独特的增殖和分化的能力，它可以分化为身体的各种细胞，并形成相应的组织和器官。早在1970年，就有人发现小鼠的早期胚胎细胞从子宫移植到其他部位后有易发畸胎瘤(teratocarcinoma)的现象。而且发现，畸胎瘤细胞可在体外培养，并可分化为许多不同类型的细胞。进而也发现，如果采用显微注射的方法将它们移植到小鼠的袁胚内，它们还可以参与其胚胎小鼠的个体发育。这些结果，暗示了畸胎瘤细胞可能具有正常胚胎干细胞特性的可能性，但并没有涉及畸胎瘤发生的原理。G. R. Marti n曾假设在畸胎瘤中的畸胎瘤细胞可能是正常的胚胎细胞，而它们在异常部位易发畸胎瘤的现象，可能是因为它们在异常的部位得不到本来在子宫中应有信号的诱导的结果。基于这一假说，她培养了小鼠的胚胎细胞，而且得到正常的小鼠胚胎干细胞系。她的研究与当时M. J. Evans和M. H. Kaufman的类似研究都为小鼠的遗传操作和发育分析，以及后来的人胚胎干细胞的研究奠定了基础。


医学细胞生物学 二、干细胞的基本特征 已有的证据表明，所有干细胞在形态学上都具有原始细胞的一些基本特征，其主要表现为细胞的体积较小（相对千所在组织中的细胞而言）、核／质比例相对较大，以及细胞质中各种细胞器（如内质网高尔基复合体及线粒体等）不够发达等。


医学细胞生物学 二、干细胞的基本特征 胚胎干细胞和组织干细胞的生化特性具有明显差异，而不同组织的干细胞更是具有各自特有的生化特性，而且与其所处的分化等级有关，常被用作鉴定干细胞在组织中存在和评价其分化程度的标志。如胚胎于细胞表达OCT4(oc tamer-binding transcription factor4)、SOX2[(s ex determini ng region Y)box2]、Nanog、STAT3(s ignal transducer and activator of transcript ion3), SSEA-1(stage-spec ific embryonic antigens I)碱性磷酸酶等分子；神经干细胞表达中间纤维nes li n、EGF(e pidermal growth facto)受体和FGF2(fibroblast growth factor2)受体等分子。细胞角蛋白是特异性存在于上皮细胞中的细胞骨架成分，也常被用作上皮组织干细胞的标志分子；造血干细胞的端粒酶(telomerase)活性很高，但当它分化后，其端粒酶活性便随之降低。


医学细胞生物学 第二节胚胎干细胞 在个体发育的袋胚阶段，其嵌胚腔中的内细胞团细胞具有多向分化潜能，它可以分化为胎儿或成体组织中的各种细胞类型。若采用实验的手段，将内细胞团细胞分离出来，并将其在体外稳定培养，所得到的这种细胞就是一般所说是的胚胎干细胞(ES细胞）。胚胎干细胞的另一个来源是原肠胚之后的原始性腺中分离获得的，也被称为EG细胞(embryon i c germ cell)，与ES细胞具有相似的性质。 —、胚胎干细胞的生物学特性 胚胎干细胞为未分化多能性细胞，它可表达早期胚胎细胞的分子标记，但在不同的物种之间，其表面抗原的表达情况可有很大的差异，例如，小鼠的胚胎干细胞可以表达阶段特异性胚胎抗原－1(SSEA-1)、不表达SSEA-3和SSEA-4，但人的胚胎干细胞则不表达SSEA-1，而表达SSEA-3和SSEA-4。此外，分离自内细胞团发育阶段之后的早期胚胎中的具有多向分化潜能的EG细胞(e mbryoni c germ cell)，由千细胞所处的发育阶段不同，其分子标志与胚胎干细胞也是不完全一致的。例如，人EG细胞可表达SSEA-1，但入胚胎干细胞则不表达SSEA-1。


医学细胞生物学 —、胚胎干细胞的生物学特性 (—)胚胎干细胞体外培养中呈现克隆化生长和快速增殖的特性胚胎干细胞具有原始细胞的形态和生化特征。胚胎干细胞的体积较小，核质比例较大，内质网及第十七章干细胞与组织的维持和再生385高尔基复合体等细胞器不发达。在娱胚中，它们以致密的集落样的形式（即内细胞团）生长，并附着于裴胚的内侧壁。在体外培养的条件下，胚胎干细胞的体积仍然很小，核质比例很大，核中可有多个核仁，它们也是以致密的集落样的形式生长，形似鸟巢（图17-2)。胚胎干细胞可以在体外无限扩增，增殖迅速，可以进行传代、遗传操作和冻存，表现并保持稳定的、正常的二倍体核型。现在已经知道，各种哺乳动物的胚胎干细胞在体外培养条件下都具有相似的形态特征。图17-2体外培养的人胚胎干细胞A内细胞团细胞形成的原代克隆，标尺l OOµm; B H9株人胚胎干细胞的克隆，标尺100µ,m; C放大的H9株人胚胎干细胞的克隆，标尺50µ,m; D. l-19株人胚胎干细胞分化后的形态，标尺100µ,m（二）胚胎干细胞具有向三个胚层分化的潜能在个体发育中，存在于痪胚内细胞团中的千细胞具有分化为后续发育个体的任何组织细胞的潜能。由千胚胎千细胞体外培养的成功，这一概念已经通过实验的方法得到了充分的证实。其大致的做法有三个方面：少将培养的胚胎干细胞在体外条件下进行诱导分化，然后观察其分化的情况。例如，将人胚胎干细胞在没有胎鼠成纤维细胞作为饲养层的条件下进行培养，其胚胎千细胞就会发生分化，而且在其培养液中还可以检测到a-甲胎蛋白和人绒毛膜促性腺激素(h CG)的存在，这表明有向内胚层和滋养层方向分化的现象发生。又如，将胚胎生殖细胞置于白血病抑制因子存在的条件下，其中的部分细胞能分化成胚状体(embroyoid body，曾称类胚体、拟胚体）。在所形成的类胚体中，可以发现有属千三个胚层的各种类型的分化细胞的存在，这就说明了胚胎生殖细胞具有多能性干细胞的特性。＠将体外培养的胚胎干细胞移植到免疫缺陷型小鼠的皮下，然后观察是否可以形成混合组织瘤。例如，将人胚胎干细胞移植到重症联合免疫缺陷小鼠的皮下，其移植细胞就可以产生胚胎组织瘤，而且在其瘤组织中观察到了胃上皮（内胚层），骨和软骨组织、平滑肌和横纹肌（中胚层），神经表皮、神经节及复层鳞状上皮（外胚层）等细胞的存在，这就提示了人胚胎干细胞具有形成内、中、外三个胚层的潜能。＠＂嵌合体”实验。将体外培养的胚胎干细胞移植到小鼠娱胚腔中，观察植入的细胞是否可以分化为各组织细胞。1990年，A. Nagy等通过显微注射的方法，将体外培养的小鼠胚胎千细胞植入小鼠的痪胚腔，使其参与内细胞团的继续发育，进而通过对所发育小鼠的各种组织的分析，发现组成这些组织的细胞有些来源千植入毅胚腔的外源ES细胞，故称该小鼠为＂嵌合体小鼠＂。该实验证明了胚胎千细胞确实具有分化为包括生殖细胞在内的各种组织细胞的潜能。这种形成＂嵌合体”的实验被认为是证明ES细胞多分化潜能的“金标准＂。然而，由于伦理道德等方面的原因，这种方法不能用于人胚胎千细胞的分化评价（图17-3)。


医学细胞生物学 —、胚胎干细胞的生物学特性  巨尸壬体外培养低密度培养＼巨氢三，2拟胚体注射入NOD/SCIO小鼠皮下组织学分析析记的E::｀'未标记的宿主胚胎 目前，随着研究的深入，ES细胞多能性、自我更新与定向分化机制也被逐渐阐明。当前研究证明，入与小鼠的胚胎干细胞在诸多方面存在差异，比如两种胚胎干细胞所需的培养条件完全不同，细胞所形成克隆的形态、生长、表面标记及潜能状态均不一样，但是不论小鼠还是人类，细胞的多能性主要由一个由转录因子Oct4为核心，同时包括Sox2与Nanog的多能性网络调控。尽管该多能性环路在人与小鼠多能干细胞中相对保守，但多能性因子的下游通路以及相应的精细调控可能并不完全一致。至于这种差别是由种系的不同引起，抑或是由千发育时程的不匹配所致，目前还没有确切的结论。 二、胚胎干细胞的体外分化 一般认为，ESC的分化受到内源性和外源性因素的共同调节。内源性因素即不同基因在不同时间和空间的开启和关闭，涉及各种转录因子的作用。外源性因素则是指细胞间的分化诱导、分化抑制作用及细胞外物质的介导作用。


医学细胞生物学 二、胚胎干细胞的体外分化 ESC的分化研究分为一般诱导分化和定向诱导分化两类。前者是指加入一定的分化诱导剂，常用的是全反式维甲酸(RA),ESC就可以同时或先后分化出不同类型的细胞，这反映了ESC不受约束的自我分化，应用意义不大。目前主要目标是针对不同的终末目标细胞，通过改进培养方式、选择分化诱导剂，研究ESC的定向分化。目前已报道的由ES细胞诱导分化的细胞主要有造血细胞、心肌细胞、神经细胞、脂肪细胞、胰岛细胞、内皮细胞、上皮细胞、肝细胞、成骨细胞和软骨细胞、胰岛素分泌细胞等等。目前的研究方法大约分成两大类，一种方法是胚状体的诱导分化。先诱导胚胎干细胞形成胚状体，然后再从胚状体中分离所需要的目标细胞，进而扩大培养获得一定数量的目标细胞。胚状体通常由具有三个胚层特性的衍生物所组成，可以认为是大多数成熟体细胞系的前体细胞。中胚层和外胚层的前体细胞在几天内便可形成，而一些内胚层的细胞类型则需要较长的时间，一般在10天以后。第二种方法是不经过胚状体，而是利用单层培养的ES细胞，直接诱导获得目标细胞，当然这种诱导往彸凸？往要经过分步诱导才能完成。


医学细胞生物学 第十七章干细胞与组织的维持和再生(—)将ESC诱导分化为中胚层细胞 胚状体形成之后，可将其调整为一般的正置状态进行培养，使其附着千培养皿的表面上生长，这时有可能在胚状体上观察到个别正在发生＂搏动”的区域。在随后的正置贴壁培养中，可以看到大片状的、呈同步收缩的细胞。在具有收缩特性的细胞群中，反映心脏不同特殊功能的细胞可以用电生理方法检测出来，包括心房样细胞、心室样细胞、浦肯野细胞样细胞和结细胞样细胞。研究发现，将胚胎于细胞来源的心肌细胞植入小鼠体内之后，这些胚胎千细胞来源的心肌细胞能够整合入小鼠心脏组织中，并参与血管形成，而且还能在所植入的位置上继续增殖与分化。目前，巳经可以基千鼠胚胎干细胞诱导分化的方案，从人类胚胎干细胞中产生心肌细胞，这无疑为再生医学中的心脏组织工程提供了一个全新的思路。但是，该方案也存在一些问题。例如，除了组织免疫相容性的问题之外，胚胎干细胞来源的心肌细胞的分化状态也正在得到关注，这些在体外状态下所得到的分化细胞更多地表现为胎儿心肌细胞的特征，而没有成人心肌细胞的基本表型。也有研究发现，植入的具有自主＂搏动”特性的心肌细胞还可能会引发严重的心律失常，这些细胞一旦整合入内源性的心脏组织中，这种心律失常则很难加以纠正。因此，胚胎干细胞的治疗在从实验室研究到临床应用之前，还有许多问题需要解决，其中最为重要的一点就是要证实，由胚胎干细胞分化产生的各种类型的分化细胞是否具有与宿主组织之间发生完全的功能性整合的能力。


医学细胞生物学 第十七章干细胞与组织的维持和再生(—)将ESC诱导分化为中胚层细胞  （二）将ESC细胞诱导分化为外胚层细胞 依据发育生物学的基本理论，现已在体外建立起了一套化学成分确定的人类多能干细胞向神经定向分化的诱导系统，能较好地模拟了人类神经发育早期的主要过程，且时间区分明显，各时期的标记物清楚，是研究人类神经发育的良好模型。例如，由ES细胞形成的胚状体在不加额外的诱导因子的清况下，细胞在第7天开始表达转录因子Pax6(Pai red box protein6)。如果生长于培养皿面上，这些早期的神经上皮细胞于一周后形成明显的花环状结构，并开始表达其他神经系的标记物如Soxl。激活FGF信号通路，或抑制SMAD通路，会明显促神经分化。细胞表达Pa:x6但尚未表达Soxl时，它们能在塑型因子的作用被定向分化至特定细胞谱系。例如，在视黄酸RA作用下，本来向颅侧分化的细胞转而向脊髓分化。但是，RA能对细胞起作用的时间窗口往往非常短暂，只有几天时间，一旦细胞开始表达Soxl，这些细胞便不能再被分化为脊髓细胞。


医学细胞生物学 （二）将ESC细胞诱导分化为外胚层细胞 小鼠胚胎干细胞向神经外胚层的分化相对容易，目前已有几种不同的方案来得到大量的神经元样、星形胶质细胞样或少突胶质细胞样细胞。这些方案可以不必经过胚状体的步骤，而是直接通过胚胎于细胞的单细胞层培养的方式，使其分化为神经外胚层细胞。这种分化方案可以将超过80％的人多能干细胞转变为PAX6十神经系细胞，进而能分化为各种细胞亚类。有研究表明，这些分化细胞被植入小鼠模型后，仍然具有功能活性（即可以形成突触并产生动作电位），而且能够整合入大脑，并可纠正某些神经变性疾病的表型。 （三）将ESC细胞诱导分化为内胚层细胞 由于在胚胎发育过程中，内胚层的出现最晚，所以其细胞特化过程较为复杂，所以ES细胞的体外诱导分化获得内胚层细胞，理论上也更困难一些。关于胚胎干细胞向肺泡上皮细胞的分化，虽然目前也有一些工作，但由于肺的细胞组成和组织结构复杂性以及对肺前体细胞缺乏确切的定义，以及诱导效率较低而且纯化困难而始终无法得到广泛推广。


医学细胞生物学 （三）将ESC细胞诱导分化为内胚层细胞 目前也有通过先将ES细胞诱导成内胚层来源的前体细胞然后再进一步诱导成肺、肝、胰腺等组织细胞。随着胚胎发育的分子机制研究的深入，控制分化的关键基因逐渐清晰，通过优化体外诱导体系获得内胚层细胞也是比较可行的路线。尽管目前在实验室里确实可以将胚胎干细胞诱导分化为许多类型的具有相应表型的细胞，但在其分化的效率、成熟的程度、分离的纯度以及在活体中是否具有真正的功能等方面则仍然还有许多问题需要解决。


医学细胞生物学 388第五篇干细胞与细胞工程三、诱导性多潜能干细胞的获得及生物学特性 2006年，日本科学家山中伸弥团队成功地利用病毒载体转染将四个转录因子Klf4、Sox2、Oct4及c-Myc导入小鼠成纤维细胞获得了多潜能细胞，仅仅一年后，人的多潜能细胞也通过相同的转录因子体系或不含有c-Myc的转录因子体系而成功建立，这些重编程的多潜能细胞现在被称为诱导性多潜能干细胞(induced Pluripo lent Stem Cells, i PSCs)。虽然这些人iPS细胞的多潜能性质与人ES细胞并不完全一致，但是他们的确在形态和分化能力上面与人ES细胞极其相似，比如在体外能分化成三胚层而且能在免疫缺陷小夙体内形成畸胎瘤。


医学细胞生物学 388第五篇干细胞与细胞工程三、诱导性多潜能干细胞的获得及生物学特性 人们最初对iPS的兴趣主要集中在iPS细胞在药物筛选、模拟人类疾病和病人个体化治疗方面的潜在应用前景上。最初的诱导体系使用了逆转录或慢病毒载体基因转导体系来构建iPS细胞，其潜在的不利后果是转基因可随机插入到基因组中，可能会破坏正常基因表达，所以后来很多实验室的工作集中在如何避免使用病毒和不引起插入突变方面。最近出现的方法中有利用非整合型质粒载体和可移除的转座子进行基因转染的，有通过直接导入转录因子雷组蛋白的方法进行重编程的。比较有临床应用价值的是利用某些小分子化合物来诱导细胞重编程为iPS细胞的方法。通过高通扯药物筛选可以获得这些有效小分子的最佳组合，这种方法由于诱导成分明确而且没有外源基因的导入，安全性会更高。


医学细胞生物学 388第五篇干细胞与细胞工程三、诱导性多潜能干细胞的获得及生物学特性 虽然目前还没有利用iPS治疗疾病的临床前和临床实验报道，但是由于其来自于病人自身，使用中不会产生免疫排斥反应，使得i PS细胞在某些疾病治疗方面显示出ES细胞所没有的优越性。对某些遗传缺陷的病人，可以将他们的iPS细胞进行基因打靶或者基因编辑技术对基因缺陷进行修复，然后再移植到病人体内，达到恢复正常基因功能的目的，这种设想在小鼠锁刀型贫血症的治疗中已经取得成功。基因修正的iPS细胞来源的肺前体细胞也同样被证明在治疗遗传突变引起的肺病，像森性纤维化、al－抗胰蛋白酶缺乏，和表面活性蛋白不足等疾病治疗中具有很好的效果。


医学细胞生物学 第三节组织干细胞 组织干细胞是在成体组织内具有自我更新能力及能分化产生一种或一种以上特化细胞的原始细胞。在活体内，组织干细胞存在千特定的微环境(mi croenv i ronme nl)中，具有直接参与其组织器官结构和功能动态平衡的维持的功能。所以，对于组织干细胞生物学特性的认识，不仅需要研究干细胞本身，而且更需要研究千细胞与其微环境之间的关系。随着研究的深入和研究手段的不断进步，人们对组织干细胞自身的生物学特性有了逐渐深入的认识，包括造血干细胞在内的许多其他组织的细胞已被成功分离或鉴定（图17-4)，而且对其生物学行为和其发生机制也开始有了很深入的研究。 —、组织干细胞的基本特征 (—)组织干细胞的增殖相对缓慢而且具有自稳定性1干细胞的增殖速率相对较缓慢生理状态下成体组织中干细胞的分裂比较慢，例如小鼠的造血干细胞每2.5周才复制一次，人的造血干细胞每10个月才复制一次。目前认为，于细胞的这种缓慢增殖对维持组织稳态具有重要意义。一方面有利于干细胞对特定的外界信号作出反应，以决定其细胞是进入增殖状态，还是进入特定的分化程序，另一方面还可以减少DNA复制过程中基因发生突变的概率，降低突变的累积。


医学细胞生物学 —、组织干细胞的基本特征 2.干细胞增殖系统具有自稳定性自稳定性(self-maintenance)是指干细胞可以在生物个体生命期间内自我更新(self-ren ewing)并维持其自身数目恒定的特性，它是干细胞的基本特征之一。干细胞要维持自我更新，干细胞必须要进入细胞周期进行分裂，而且后代细胞必须至少有一个细胞能保待未分化状态，这两个方面如果不能保持相对平衡就会导致细胞缺损或者组织异常。研究表明，这种平衡第十七章干细胞与组织的维持和再生389. 期皮曼』一』一』－－ 细胞维持自身数目恒定的基本方式。例如，在果蝇的外周神经组织中，其感觉器官的前体细胞的不对称分裂是受一系列基因调控的，insc基因就是其中的一个。该基因的表达产物（即Insc蛋白）至少在三个方面对不对称分裂进行调控：心不对称地A.干细胞的简单不对称分裂；B干细胞的群体不对称分裂Numb;＠不对称地分配细胞内mRNA;＠决定细胞分裂时纺锤体的取向。


医学细胞生物学 期皮曼』一』一』－－ 但对哺乳动物而言，却并非如此简单。除了存在与上诉类似的单个细胞的不对称分裂外，在有些哺乳动物的可自我更新的组织中，干细胞产生的两个子细胞既可能是两个千细胞，也可能是两个特定分化细胞，即所谓的对称分裂。但平均而言，每一个干细胞可以产生一个子代干细胞和一个特定分化细胞。因此，从某种意义上讲，哺乳动物的干细胞是种群不对称分裂(populational asy mmetry division)。干细胞不对称分裂机制的存在，使得机体对干细胞的询控更具灵活性，可以更灵活的应对机体生理变化的需要。为了保持千细胞数目的恒定，机体需要对干细胞的分裂进行十分精密的调控。有研究表明，在小肠隐窝(crypt)中，如果额外多产生一个干细胞，则该干细胞进而就会多产生64-128个子代细胞，而每个正常隐窝仅由大约250个细胞组成。由此可见，维持干细胞数目的恒定有保持组织的稳定和功能的重要性。以此，哺乳动物干细胞分裂方式的调控机制也一度成为研究入员关注的热点。


医学细胞生物学 期皮曼』一』一』－－ 不对称分裂是维持干细胞数量和干细胞特性的重要条件，但分裂后千细胞静息状态的维持和激活的调控更是在组织维持、再生、功能发挥、可塑性以及组织衰老和死亡中起决定作用的因素。目前研究试图解释干细胞维持静息状态的机制，比如E. Llorens-Bobadilla等2015年利用二代测序技术（见第三章），从成体脑室管膜下区中分离出几种神经干细胞并对其单细胞基因表达谱进行了分析，发现＼。叮i}头D大脑，C小肠隐窝干细胞；B毛痰，千细胞位于膨胀部位表皮组织，干细胞位于基底层；A；干细胞位于室管膜或下脑室（V：脑室区；SVC：下脑室区；E：室管膜；OB：嗅觉球）；E造血系统(HSC：造血干细胞；A：脂肪细胞；M：巨噬细胞；T-L:T沿巴细胞；B-L:B淋巴细胞；B：嗜碱性粒细胞；E：嗜酸性粒细胞；N：中性粒细胞心：红细胞；P：血小板；S：基质细胞；V：静脉；Arl：动脉）


医学细胞生物学 期皮曼』一』一』－－ 的实现，即干细胞自我更新的维持，是通过干细胞不对称分裂来实现的。当干细胞发生分裂后，如果所产生的两个子代细胞都是干细胞或都是分化细胞，这种分裂方式称为对称分裂(symme try di vision)；如果产生一个干细胞和一个分化细胞，则称之为不对称分裂(asymmet1-y divi s i on)（图17-5)。"对无脊椎动物而言，不对称分裂是干分配细胞膜上的膜联细胞命运因子(mem图17-5干细胞的不对称分裂加ne-associated cell fate determinant)，如 埏毛生长毛,壬驳.初／突质层层层鳍卿赞黜化分A表皮胞间细干390第五篇干细胞与细胞工程 这些细胞对大脑急性缺血性损伤的反应各不相同。这些处于从静息到激活之间各种状态的于细胞共存于一个干细胞巢内。单细胞基因表达谱的分析为解释千细胞静息状态的维持和激活机制提供了重要的资料。此外，毛痪干细胞也是研究这一问题的很好的模型。但是静息干细胞由千缺乏明确的分子标志而且数量较少，所以分离和鉴定都非常困难，而通过组织损伤等手段分离获得的干细胞往往被认为是被激活的干细胞。3过渡放大细胞的增殖速率远高于干细胞在发育过程中，当新的组织和器官形成需要时，干细胞分裂会相应加快，但是，当机体成熟，干细胞分裂会逐渐变慢，并逐渐进入静息状态，以避免成熟前过度消耗和减少突变概率。过渡放大细胞(tran s it amplifying cell,TAC)是激活的干细胞经过不对称分裂产生的位千干细胞和分化细胞之间的一种细胞类型（图17-6)，具有一定的分化潜能，所以也有人将其称为过渡放大前体细胞(transit amplifying progenitor cell, TAP)，其主要特性就是其增殖速率显著高于千细胞。如小肠过渡放大细胞比小肠干细胞分裂速度大约快一倍。目前发现有很多组织干细胞都会通过不对称分裂产生过渡放大细胞，包括人和小鼠的角膜干细胞、人乳腺干细胞、前列腺上皮、哺乳动物表皮、胃肠道干细胞、哺乳动物毛溪干细胞等。一方面，干细胞可以借助这种不对称分裂，保持自身干细胞特性和数目的稳定性，另一方面可以借助千过渡放大细胞较高的增殖速率和分化潜能来增加分化细胞的数目，以满足组织更新或修复的需要。例如小鼠表皮基底层的干细胞所产生的过渡放大细胞对维持表皮的组织稳态有重要作用。表皮基底层细胞通过不对称分裂产生一个子代细胞（干细胞）保留在基底层，另一个子代细胞位千基底上层，也就是会快速分裂的过渡放大细胞。由千不对称分裂，基底层的干细胞数目能够保持稳定，而过渡放大细胞的数址快速上升，并继而分化产生新的表皮层或进行组织修复。可以观察到在成层活动发生时，在基底表皮层中，有丝分裂纺锤体超过70％的是垂直朝向基底膜的。


医学细胞生物学 埏毛生长毛,壬驳.初／突质层层层鳍卿赞黜化分A表皮胞间细干390第五篇干细胞与细胞工程  （二）组织干细胞分化具有很强的可塑性 1组织干细胞的分化具有谱系限定性在个体发育的整个过程中，其个体的各种组织中都有干细胞的存在，处于不同发育阶段和不同组织器官中的干细胞的分化潜能，则具有严格的谱系限定性。一种组织干细胞它通常只能分化产生其所在组织内的或与之相应的特定功能的细胞，即只产生其细胞谱系以内的细胞类型，而不产生其他组织中的细胞类型，如小肠干细胞可分化产生小肠组织细胞（即吸收细胞、杯细胞、嗜酸细胞和肠内分泌细胞），神经干细胞只能产生神经组织细胞（即神经元、星形胶质细胞或少突胶质细胞）。干细胞（包括全能干细胞、多能干细胞和位于各种成体组织中的组织特异性干细胞）分化谱系的限定性有其复杂而严格的调控机制，由于它是认识和理解许多生物医学现象的复杂性以及其发生机制的基础，所以，干细胞分化调控机制的研究是当今干细胞生物学中的重要研究领域之一。2组织干细胞的分化潜能又可称之为干细胞分化的可塑性可塑性是指细胞对外源和内源因子作出反应从而改变细胞现有状况的能力。从分化的角度，干细胞的分化潜能又可称之为细胞的可塑性，比如神经千细胞可以分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。而在某些特殊的条件下，神经千细胞的分化为造血细胞，甚至有的研究结果提示植入小鼠胚胎内的神经干细胞可以分化成三个胚层来源的细胞，这也是干细胞分化的可塑性。1997年，M. A. Egli t i s等人将从成年雄性C57BU6j小鼠中分离的造血干细胞移植到受亚致死扯照射的雌性WBB6F l/J-kitW/k itW-V小鼠体内，三天后在受体雌鼠的胶质细胞中检测到Y染色体的存在，虽然该实验方法受到一定的质疑，但这暗示了成年动物的造血干细胞可分化成为脑组织中的胶质细胞。随后，类似的发现还包括成体造血千细胞分化形成肌细胞和肝细胞。然而，在活体内（包括在生理状态和病理状态下），组织千细胞是否具有这种特性，则目前尚不明确，但要强悯的是，不论是离体还是载体研究，都要通过利用报告基因追踪观察这些细胞的活动，不仅要证明被标记的成体干细胞具备新组织的关键结构和生化特性，还要证明这些细胞能适应新组织的内环境并能生存下来，同时也能像该组织内的其他成熟细胞那样发挥作用。


医学细胞生物学 （二）组织干细胞分化具有很强的可塑性 3分化细胞可以通过去分化过程获得组织干细胞可塑性一般认为，组织和器官稳态的维持主第十七盎干细胞与组织的维持和再生391要是靠组织千细胞的增殖和分化来补充或替代受损细胞来实现，但近年来研究表明，内源性的非干细胞在组织更新中的作用也是非常重要的，该结论在三肠涡虫、两栖类、鱼类、甚至是哺乳动物非上皮组织中都得到了证实。研究发现，非千细胞参与损伤组织的修复主要是通过自身的去分化和转分化的过程实现的，这也可以说是组织细胞的”可塑性”。所谓去分化(dedifferentiation),用分化细胞失去原来的分化特性获得了同样组织谱系的前体细胞的能力，而转分化(transdifferentialio.1走指分化细胞在某个既定的组织中变成了相同组织谱系的分化细胞（图17-6)。虽然转分化的过程中似乎并不涉及干细胞可塑性的获得，但是也并不排除该组织细胞经过了短暂的千细胞阶段然后形成另外一种组织细胞的可能性。


医学细胞生物学 静息干细胞活化的干细胞霆二＠勹自我更新干细胞巢信号z z过渡放大细胞,,/-于己）包芦婴 /\D)/@l\aI/＿转砰、v勹/＼三分化的细胞近年来细胞重编程(cellular reprogramming)领域的发展也支待了包括干细胞在内的许多其他类型的细胞的分化行为的可塑性，研究人员可以在体外对干细胞或分化细胞进行各种诱导转变，除了转分化和去分化，还可以将一种分化细胞直接诱导为另一细胞谱系的干细胞，但是入们最关心的还是在体内，分化末端的细胞是否能通过转分化和去分化从而获得干细胞的特性，然后行使组织千细胞在组织修复中的作用呢？


医学细胞生物学 静息干细胞活化的干细胞霆二＠勹自我更新干细胞巢信号z z过渡放大细胞,,/-于己）包芦婴 目前很多利用谱系示踪(lineage tracing)方法进行的体内研究，从多个角度证实了体内分化细胞的可塑性。比如小肠中Lgr5十小肠干细胞的活动是正常生理状况下小肠隐窝维持的主要成员，它能分化成多种细胞，其中Biml十细胞就是由Lgr5十小肠干细胞分化而来，但是在小肠干细胞－巢单元受到破坏时，Biml十细胞能通过去分化形成新干细胞池行使干细胞功能（图17-7)；哺乳动物成体肾中的上皮细胞可以通过去分化执行肾修复的功能；在毒物损伤和胆管结扎的清况下，成熟肝细胞可以转分化为胆管细胞。据此有人提出组织特异性的再生策略除了“干细胞策略“外，如何在体内或体外唤醒分化细胞的可塑性也是值得深入探讨的。


医学细胞生物学 二、组织干细胞生理活动的微环境 增殖与分化是调控组织中干细胞群体稳定性的基本方式，也是调控组织器官结构和功能动态平衡的基本方式。目前一般认为，干细胞的增殖与分化存在一个严密的调控机制，这个调控机制可能就A LgrS十肠干细胞（绿色）谱系追踪观察肠隐窝稳态B肠隐窝底部Lgr5十肠干细胞（绿色）动态演变标记阳性细胞几周后几个月后C肠隐窝边缘区Lgr5十肠干细胞（绿色）动态演变D Lgr5十肠干细胞缺失时肠稳态维待依靠Bmil十细胞在隐窝内肠隐窝边缘区Lgr5十细胞形成克隆E每个Lgr5十肠干细胞（用不同颜色代表）均可-以形成完整的肠隐窝”>与它所在的组织中的微环境有关，这种微环境也可称为干细胞巢或干细胞龛(stem cell niche)。目前已经知道，不同干细胞巢的结构和组成存在很大的差别，这也许就是不同千细胞的生物学行为都受到特定机制调控的结构基础。目前一般认为，干细胞巢中各种因素的相互作用决定了干细胞的休眠、增殖或分化状态的转变。于细胞巢的重要性还体现在，即使在没有于细胞的情况下（如通过照射治疗去除干细胞后），干细胞巢的微环境仍可保留其关键作用，允许招募外源性干细胞并使其归巢到原有的干细胞巢。另外，干细胞巢的功能紊乱与干细胞衰老或肿瘤转化有密切关系。由千干细胞与赖以生存和维持功能的微环境之间不可分割的关系，所以目前经常会用“干细胞－巢单元”(stem cell-niche u n it)来代替“干细胞巢”或“干细胞龛＂的惯用名词。


医学细胞生物学 二、组织干细胞生理活动的微环境 （一）“干细胞巢单元”由执行不同功能的异源性成员组成1干细胞巢单元不仅仅指干细胞的定居的物理位置各种组织干细胞的存在虽然都有相对固定的组织学部位，但千细胞－巢单元却不仅仅后代细胞是指干细胞定居的物理部位。这里是干细胞细胞|与外源性信号发生相互作用的场所，在结构上是一个由干细胞及其外围细胞、细胞外基细胞夕质以及参与其增殖分化调控的相关因子所组成的，并具有动态平衡特性的局部环境（图17-8)。


医学细胞生物学 二、组织干细胞生理活动的微环境 2整联蛋白和胞外基质参与干细胞－巢单元的结构体系的形成整联蛋白(in tegr·in)彸•.；户是一类细胞黏附分子，其作用依赖于Ca2+，介第十七章干细胞与组织的维持和再生导细胞与细胞间的相互作用以及细胞与细胞外基质间的相互作用。现在已经知道，几乎所有动植物细胞均表达整联蛋白。其中细胞与胞外基质的附着可以由多种受体介导，但目前认识最多的是整联蛋白。高表达B－整联蛋白对维持表皮干细胞(epidermal stem cell)的增殖分化至关重要。B－整联蛋白还通过MAP激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)途径调节角质化细胞等细胞的分化。此外，整联蛋白有维系干细胞在组织中空间位置的作用，否则干细胞会脱离生存环境而分化或凋亡。胞外基质还有调节干细胞微环境中局部分泌因子浓度的作用，整联蛋白的激活和表达也要受胞外基质蛋白的调节。


医学细胞生物学 二、组织干细胞生理活动的微环境 3.干细胞－巢单元中的分泌因子是干细胞增殖分化的调控因子在干细胞－巢单元中，分泌因子(secreted fac tors)可以是干细胞自身分泌的，也可以来自外围细胞或者其他组织细胞。它们对于干细胞增殖与分化的调控具有重要作用。在不同的干细胞微环境中，以及不同的生理或发育状态下，分泌因子的种类及其水平可有很大差别，但这种差异总是与机体发育或生理状态的需求是相适应的。目前发现，TGF-!3(tran sforming growth factor be ta)和Wnt家族的信号分子在多种干细胞的不对称分裂以及维持干细胞自我更新方面起重要作用。4.干细胞巢单元中过渡放大细胞和分化的子代细胞对干细胞产生反馈调控由干细胞不对称分裂产生的过渡放大细胞也成为干细胞－巢单元的一个组成部分。目前认为干细胞－巢单元成员通过刺激活化的干细胞进行分裂从而建立“过渡放大细胞池”(TAC pool)，过渡放大细胞池又能够反过来作为信号中心提供某些干细胞－巢单元信号，从而调控干细胞的增殖状态，体现出调控的“双向性”。


医学细胞生物学 二、组织干细胞生理活动的微环境 最近的研究提出一些分化的干细胞后代也能够作为巢成员并对干细胞产生反馈调控。例如，毛毅中已经分化的干细胞在干细胞－巢单元内形成由分化的Keratin6飞K6+）细胞组成的隆起的内层，这层细胞能够抑制隆起外层干细胞的激活；造血系统中，分化的巨噬细胞归巢到骨髓后，能增强造血干细胞的滞留，限制其向外周血移动。总之，目前认为，处于分化末端的子代细胞形成的＂谱系反馈循环”在其所处的千细胞巢单元中发挥调控干细胞分化的作用。（二）器官水平上各干细胞－巢单元之间存在协同作用“干细胞－巢单元”的研究让我们了解到干细胞－巢单元和干细胞之间相互作用的基本模式，但是放眼千器官或组织再生、重塑等问题的研究，研究人员不能忽略的是散布在整个组织和器官的所有干细胞－巢单元之间的相互协同作用。这些单元组成成员的分子特性、分裂模式、群体大小的差异非常大。目前也有越来越多的研究结果支持大部分自我更新的组织是受到多维度千细胞－巢单元的支持的，所以组织和器官更新过程所面临的挑战呈现多层次的特点，不但包括单个干细胞－巢单元内部的调控，还包括组织和器官中所有巢之间的协同调控。这也是干细胞生物学研究所面临的下一个挑战。


医学细胞生物学 三、几种组织干细胞的研究现状(—)造血干细胞 20世纪40年代后期，在核辐射对造血系统损伤的动物实验发现，正常骨髓可以修复巳被严重损伤的骨髓，由此出现了造血干细胞(h ematopo山c stem cell, HSC)的概念。l961年，J. E. Till和E. A. McCuUoch首次通过小鼠脾集落形成实验(spleen colony-forming assay)证实了造血干细胞在成体内的存在。造血干细胞在所有骨韵细胞中所占的实际比例很少，但它们却具有强大的增殖和分化能力。有研究表明，一个单独的造血干细胞就可以重建整个造血系统。在哺乳动物的个体发育中，造血干细胞最早被发现于早期胚胎的卵黄痪毅壁的血岛(blood I sland)中，随后被发现千”主动脉－性腺－中肾"(Aorta-gonad-mesonephros, AGM)区，进而被发现于肝和脾中，最后被发现于骨髓中。骨韵是胚胎中后期和出生后整个生命期间的造血场所。


医学细胞生物学 三、几种组织干细胞的研究现状(—)造血干细胞 造血干细胞的分离纯化可以通过表面标志来实现。目前比较明确的人造血干细胞的表面标志有CD34+,CD38-、L面、HLA-、DR-、Thy\c-K正、CD45RA和CD71等。其中，CD34是临床上应用最多的造血干细胞标志物。 394第五篇干细胞与细胞工程 造血干细胞特性的维持与细胞分化方向的抉择与造血微环境有着密切的关系。研究发现，在哺乳动物骨髓中，一部分HSC存在千骨小梁的骨内膜区，紧靠成骨细胞；另一部分HSC与血窦周围的血管内皮细胞相连。这提示HSC栖息于两种微环境一成骨巢和血管周围巢。研究显示成骨巢维持HSC的静态，成骨细胞提供了涸节HSC数量及功能所需的调节因子；血管巢调控HSC的增殖、分化和动员等行为。


医学细胞生物学 394第五篇干细胞与细胞工程 目前临床上常用的骨髓移植或造血干细胞移植疗法，实际上就是利用了造血干细胞可以再殖(repop ulate)损伤骨髓的生物学特性。这种疗法在白血病的治疗中取得巨大的成功，使白血病患者的长期生存率提高到50%~70%，其疗效远远地胜于化疗。美国医学家托马斯(E. D. Thomas)千1956年成功执行了世界上首例人类骨髓移植手术，他也因此而获得了1990年度的诺贝尔医学奖。 （二）间充质干细胞 间充质千细胞(mesenchymal stem cell, MSC)起源于胚胎期中胚层的间充质，已发现在许多由间充质分化来的成体组织都可以分离出来，包括脂肪组织、胎盘、皮肤、肪带血、肪带血管周细胞、牙髓、羊水、滑膜，以及母乳等。目前已有的研究结果证明了间充质干细胞的多向分化潜能，在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌健、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞。


医学细胞生物学 （二）间充质干细胞 尽管间充质干细胞的研究已有很多，但这些研究大多是基千培养的间充质干细胞的体外研究，而MSC的体内鉴定则迟迟没有令人信服的方法和结论，所以关于间充质干细胞的基本生物学特性的认识基本上都是体外培养的间充质干细胞的特性。不同来源的MSC的生物学特性存在着一定差异，这与组织来源，供体种属特性、分离技术，培养条件以及传代次数都有关系。目前根据国际细胞治疗学会(Internatio nal Society for Cellular Therapy,2006)的标准，MSC的基本特性是：心能够在塑料培养皿上黏附生长；＠具有“三向分化”(tri-li neage differentiation)潜能，即脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞。在此基础上，还要求具有的特性是，其细胞表面表达CDI05(e ndoglin, SH2)、CD73(ecto-50-nucleotidase)及CD90(Thyl)等分子标志，不表达CD45、CD19或CD79、CD14或CDll b及HLA-DR等分子标志。尽管这样，单就MSC的鉴定来说，目前存在的一个最大的问题仍然是缺乏特异性的分子标志。


医学细胞生物学 （二）间充质干细胞 在近十年中，虽然间充质干细胞的基础研究仍存在很多问题，但是间充质干细胞临床应用却得到飞速发展，成为了干细胞研究中的热点领域之一，主要应用包括：心造血千细胞移植，包括增强造血功能，促使造血干细胞移植物的植入，治疗移植物抗宿主病。＠组织损伤的修复，包括骨、软骨、关节损伤，心脏损伤；肝脏损伤；脊髓损伤和神经系统疾病。＠自身免疫性疾病，包括系统性红斑狼疮、硬皮病、炎性肠炎等。＠作为基因治疗的载体。有学者认为，MSC在临床应用方面取得如此大的发展，很大一方面原因并不因为它的干细胞性质，而是得益千MSC的免疫调节功能，这一独特的性质使临床研究为异基因型MSC的移植打开了方便之门。（三）神经干细胞哺乳动物胚胎发育中，在神经外胚层形成后，神经分化就开始了。在邻近神经诱导信号的作用下，神经外胚层形成一个盘样结构，称为神经盘。最早的神经干细胞就位于神经盘中。传统观点认为，哺乳动物的中枢神经系统在出生后不久就丧失其再生能力，成人脑组织一经损伤就不能再生。然而，近些年的研究发现，在大多数成体哺乳动物神经系统的侧脑室壁的室管膜下区(s ubventricular zone, SVZ)和海马齿状回的颗粒下区(subgranular zone, SGZ)有神经干细胞(n eu ral stem cells, NSC)的存在（图17～趴图17-10)。NSC具有自我更新能力和分化产生成熟神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的潜能，由此而赋予了成年个体整个生命期间神经系统特定结构和功能维持的基础。在正常生理情况下，SVZ NSC通常处于静息状态。但在损伤或其他特定病理清况下，这种细胞可以分化产生增殖性的过渡放大细胞，进而可以产生具有迁移特性的神经母细胞(neuroblast)。然后，第十七章干细胞与组织的维持和再生395图17-9成年哺乳动物SVZ部位NSC的微环境与神经发生过程A成年小鼠脑冠状切面(LV：充满脑脊液的侧脑室）；B为A图中方框显示部分的放大图，示SVZ结构[B细胞：SVZ中的干细胞，有些B细胞形成一根纤毛，与脑室腔接触；C细胞：正在快速分裂的过渡放大细胞，由B细胞生成；A细胞：由C细胞产生的神经母细胞，它们能向嗅球部位迁移；BV：血管，周围有巨噬细胞（点状）；BL：基底膜，从血管伸出，并与SVZ细胞发生广泛的交叉；纤毛状的室管膜细胞沿着室管膜壁排列，室管膜细胞能够产生对于干细胞微环境很重要的Noggin分子；Noggin, BMPs, Shh, Notch, TGF-et, Eph/ephri ns和VEGF在神经干细胞微环境的调控中发挥重要作用】；C. SVZ细胞谱系发生简图(C细胞能够在EGF信号的作用下发挥干细胞的功能）


医学细胞生物学 c0嘈气；，飞 图17-10成年哺乳动物SGZ部位N SC的微环境与神经发生过程A在海马部位的成年小鼠脑冠状切面(DG：齿状回，布满深色点状物，如箭头所指）；B.显示SGZ神经千细胞微环境的结构。图中As细胞（神经干细胞）产生神经前体细胞（图中的D细胞），神经前体细胞成熟后形成新的颗粒神经元（图中G细胞，绿色），之后这些颗粒神经元掺入到齿状回的颗粒层（图中呈棕色的G细胞），血管(BV)与SGZ邻近，在SGZ部位的血管周的基底膜(BL)与在SVZ中发现的基底膜层相似。Sh h和VEGF在体内SGZ神经干细胞微环境中起到调控作用；C. SGZ细胞谱系发生简图神经母细胞可以通过由胶质细胞所形成的轨道网络从SVZ区域向嗅球迁移。SVZ NSC的分子表型为：GFAP+,nesti旷及Lex/CD15飞过渡放大细胞的分子表型为：Dlx+, nestin+, Tbr2十及Lex/CD15飞神经母细胞的分子表型为：Dex·'mx2·'PSA-NCAM+及nestin飞嗅球神经元的分子标志为：NeuN十和DABA飞同样地，在海马齿状回SGZ区域中的NSC的分子标志与SVZ NSC相似，而且也可以分化为神经元，但其产生的过程有些特殊性。SVZ和SGZ这两个神经干细胞微环境中，主要包括下述细胞组分：CD星形胶质细胞，该细胞是微环境中的主要细胞组成成分；＠基底膜以及伴随基底膜生成的血管，它们是微环境中的重要成分；＠在微环境中存在着某些“胚胎”形态发生因子，这些因子在成年个体的神经发生中发挥重要作用。NSC的体外培养由B. A. Reynolds和S. Weiss千1992年首先建立。他们发现，这种细胞在EGF存在的条件下以非贴壁的球形（可称其为“神经球”)的方式生长，当在生长因子被撤出后，就可分化为神经元和胶质细胞。（四）肝脏干细胞肝脏起源于前肠内胚层，与胚胎心脏相接触的前肠部分受到来自心脏间充质细胞分泌的FGF家族细胞因子的作用而形成肝脏的原基。在肝的原基中，存在肝脏的前体细胞也被称为肝母细胞(h epatoblast)。成体肝脏于细胞(hepatic stem cell或liver stem cell)是指存在千成年个体肝脏中，具有分化为肝细胞和胆管细胞能力的一类干细胞。通过多年的研究，目前通常认为存在于肝细胞和小叶内胆管交界处的赫令管(canal of Hering)或者小叶间胆管的胆管腺(peribiliary gland)上（图17-11)，但是成体肝干细胞对肝脏稳态的维持方面的贡献，一直是颇受争议的。 管管霆＿,,,.勹共同肝胰导肝胰管壶腹 图17-11肝脏内肝干细胞巢和肝外胆管系统肝脏内肝干细胞巢位于赫令管（红色圆圈）。肝干细胞是肝母细胞(hepat ic blast cells)的前体细胞，即过渡放大细胞，该细胞首先产生定向前体细胞，然后产生肝细胞和胆管。胆周腺也包含干细胞巢（蓝色圆圈），分布比较广泛肝脏是一个十分独特的器官。与造血、小肠和皮肤等器官不同，生理状况下肝脏细胞的新旧更替是通过成熟的肝细胞和胆管细胞的增殖来实现的，特别是巳高度分化的成熟肝细胞，具有强大的增殖能力。1931年G. M. Higgins和R. M. Anderson建立了肝再生的经典实验模型，即通过简单的手术方式切除大鼠2/3的肝组织，大鼠的肝脏可进行再生并在两星期内恢复至原来大小。在一些慢性药物损伤中，肝细胞也发挥了主要的修复作用。肝细胞强大的自我修复能力削弱甚至掩盖了肝干细胞的贡献。虽然目前还没有发现肝干细胞在2/3切除后的肝再生过程中起作用，也没有证据表明肝干细胞在肝脏的生理性更新中起作用，但是，有些实验室观察到在经典肝损伤模型中包括饲喂DDC(3,5-d氐thoxycarbonyl-1,4小hydror.ollidine)饲料，CDE饮食（胆碱缺乏、甲硫氨酸补充饲料）或者四氯化碳长期损伤后，源于胆管的肝干／前体细胞，可以一定程度的参与肝脏损伤修复，分化为成熟肝细胞或者胆管细胞。随着近年来体内细胞示踪技术的发展，许多研究团队陆续证明了成体肝脏中不同细胞的作用，这也同时揭示了肝脏稳态维持机制的复杂性，肝细胞，肝星状细胞，胆管细胞在不同的肝损伤情况下都有可能参与肝脏的修复。


医学细胞生物学 管管霆＿,,,.勹共同肝胰导肝胰管壶腹  （五）精原干细胞 精原干细胞(spermatogon i al stem cell)存在千睾丸曲细精管内，紧贴于曲细精管的基底膜。精原干细胞在曲细精管内的精原细胞(spermatogon ium)中所占的比例很小，是分化程度最低的一类原始细胞，它是精子发生的细胞基础，对维持睾丸曲细精管结构和功能的稳定与平衡具有重要作用。精原干细胞是研究较早、较多的组织于细胞。早在60多年前，E. Rolshoven(1941)关千精原细胞的研究实际上就已经涉及了精原干细胞的内容。经过这些年的发展，目前对千精原千细胞的生物学特性已经有第十七童干细胞与组织的维持和再生397了较多的认识，并在技术上也已经能够对精原干细胞进行分离培养和活体睾丸内移植，这在一定程度上显示了它在生殖医学中的意义和作用。


医学细胞生物学 （五）精原干细胞 精原干细胞是精子发生的细胞基础。精子发生(spermatogenesi s)的全过程都发生在睾丸的曲细精管内，其过程详见第十四章。对于所有哺乳动物来说，其精子发生都遵循这一基本规律。但目前已经知道，精子发生的细节在哺乳动物的不同物种之间则存在一定的差异，而这种差异主要存在千从精原干细胞到初级精母细胞形成的这一分化阶段。小鼠为嗤齿类哺乳动物，它的精原细胞分A、B两型。从精子发生的角度来讲，它们是处于两个连续分化阶段的细胞，即A型精原细胞是较原始的精原细胞，B型精原细胞是由A型精原细胞分化而来的精原细胞。根据各种精原细胞的形态特征，以及其在曲细精管的管壁内的空间排布特征，可以观察到的A型精原细胞有单体A型精原细胞(Asingle, As)、双合体A型精原细胞(Apai red, Ap1)及链状体A型精原细胞(Aaligned, Aal)三型。现在一般认为，As才是真正的精原干细胞，而Apr和Aa1仅为精子发生的前体细胞(progenitor cell)。As分裂可能有两种方式：一是其子细胞是互相分离的两个干细胞（即仍然是As型精原细胞）。通过这种分裂方式，可以保持干细胞数量的平衡，以维持其干细胞库的稳定性；二是其细胞核分裂，但其细胞质分裂不完全，成为以胞质间桥(cytoplasm i c bridge)相连的Apr。Ap1的形成，就标志着该细胞已经进入精子发生的程序。在此基础上，Apr便可以同样的方式进行多次分裂（即细胞核分裂而细胞质为不完全分裂），由此可以形成四合体细胞、八合体细胞、十六合体细胞，甚至三十二合体细胞。由于这些合体细胞中的核呈线性排列，其间是以胞质间桥连接，故将它们统称为链状体A型精原细胞。接下来，链状体A型精原细胞将连续分裂6次，所产生的子细胞依次称为Al、A2、A3、A4、In(intermediate，中间型）和B型精原细胞。B型精原细胞的分裂形成初级精母细胞，进而通过减数分裂I形成次级精母细胞，再通过减数分裂lI形成精细胞，进而演变为成熟的精子。如果将链状体A型精原细胞按十六合体计算，那么，1个精原干细胞（即As)进入精子发生的程序后，经过10次有丝分裂，就可产生1024个初级精母细胞，再经过两次减数分裂，就可产生4096个染色体为单倍体的精细胞。


医学细胞生物学 （五）精原干细胞 人和非灵长类动物的精子发生过程的细节目前尚不十分明确。研究表明，基底膜的曲细精管上皮含有未分化型的精原干细胞(Ada,k and Apale)和分化型精原干细胞(B型）。A，lurk是最初的精原千细胞，它经过AP·,1仁阶段而分化为B型细胞。B型精原千细胞产生初级精母细胞进入减数分裂并从基底膜移出，后续经减数分裂和精子发生依次产生精母细胞、精子细胞、和终末分化的精子，并释放到曲细精管的管腔。精原干细胞的分化具有一个复杂的调控机制。目前已获较多进展，如已发现Kit受体是精原细胞分化早期的一个关键的调控因素，而干细胞因子(stem cell factor, SCF)是Kit受体的配体，它可通过Ki t受体促进细胞增殖。而且已经知道，精原细胞能表达kit受体，而支持细胞表达其配体一—SCF。


医学细胞生物学 第四节干细胞与医学 随着对干细胞与个体生长发育相互关系的认识的不断加深，科学家们开始意识到了许多重大疾病或特殊生物学现象的发生机制都可以从干细胞角度进行重新认识，这意味着临床上的许多疾病的防治研究可以从干细胞的角度进行，也意味着一些新的防治方法和手段的产生。现就以下几个方面为例，以显示干细胞生物学在医学科学中的地位和作用。 —、干细胞与器官和个体衰老 细胞衰老是细胞的一个基本的生命现象。尽管从形态学和分子生物学方面已有很多的认识，但仍有很多细节尚不清楚，特别是细胞衰老与组织、器官和个体衰老之间的关系仍知道甚少。近几年中，干细胞概念的引入，形成了以组织特异性干细胞为基础，以个体生长发育为主线的四维研究思路，使得这一领域的研究进入了一个新的发展阶段。


医学细胞生物学 —、干细胞与器官和个体衰老 通过前文的叙述我们知道，几乎所有的组织器官中都有干细胞的存在，它们的基本功能是要维持其组织器官的结构和功能在其生命过程中的稳定性和平衡性，而且要避免过度生长（如丿l巾瘤）或萎缩的发生。随着年龄的增加，组织干细胞发生了显著的变化，表现为干细胞数批的变化，静息和活化状态的改变以及增殖和分化能力的降低等（图17-12)，最终导致机体组织退化和功能啼碍，产生衰老相关的疾病，如贫血、帕金森、老年痴呆、肿瘤、肌肉萎缩及骨质疏松等。 干细胞后代细胞八年轻庙, C, `...


医学细胞生物学 Q19=谱系特异性丢失....细胞恶性转化 目前，已有一系列研究证据表明组织干细胞衰老是器官和个体衰老及疾病发生的先决条件。例如：C. Kollman(2001)就曾分析过6978例骨髓造血干细胞移植病人，骨髓造血干细胞供体的年龄越大，其成功率就越低，并发症的发生率也越高。这一研究，就暗示了老年个体骨髓造血干细胞的增殖和分化能力的下降导致了移植后骨髓重建失败。而且，这一概念在小鼠的研究中也得到了证实，并由此形成了一个解释造血干细胞衰老与个体相关疾病发生的关系的模型。按此模型，在自然的状态下，造血干细胞的衰老表现为髓系细胞分化的潜能增加和淋巴性细胞的分化潜能的下降。前者会导致髓性白血病基因表达增加和骨髓疾病发生率上升，后者则与免疫能力下降有直接关系。这一机制与临床数据相符，即急性淋巴细胞白血病主要是青少年疾病，发病率随着年龄而下降，而急性骨髓性白血病的发病率随年龄而增加。随着年龄增加，人头发的密度逐渐降低，并且花白，这也归功于毛袭干细胞衰老后表现出静息期的延长和生长期的缩短以及黑色素干细胞分化为黑素细胞能力的降低。同样地，机体其他器官老年疾病产生和生理功能的下降都与干细胞的衰老有着密切的联系。然而随着对组织千细胞衰老认识的不断加深，如何减缓干细胞衰老问题或衰老疾病的发生越来越受到关注。组织干细胞存在千机体微环境中，其从静息到活化、增殖和分化都受到微环圾内因子和一系列转录信号的调控，因此，组织干细胞的衰老不可避免受到这些内在因素和外在环境的影响。成体干细胞的衰老一直被认为不可逆转，但随着入们对干细胞衰老机制的认识和研究，发现可以通过认为干预干细胞本身的基因表达水平，信号通路、微环境因子或者清除衰老细胞等方式，有望使成体干第十七章干细胞与组织的维持和再生细胞发生衰老逆转。近年来，年轻个体血液逆转干细胞衰老的研究成果为实现真正的＂返老还童”带来了新的希望。研究显示，通过联体共生(parabiosis)的模型，使得年轻和老年小鼠血液、体液进行交互共享，年轻小鼠血液可以让老年小鼠骨骼肌千细胞回到更年轻状态，也可以逆转老年小鼠衰弱的心脏功能。而后科学家又发现年轻血液中存在着某些蛋白，如GDFll和TIMP2，这些蛋白不仅可以改善小鼠骨骼肌干细胞、心肌细胞的功能，还可以改善老年小鼠大脑功能，提高学习和记忆功能。因此，随着对干细胞衰老与微环境稳态的进一步理解和研究，有望建立临床上衰老相关疾病治疗和防治的可行方法，改善老年人的健康状况。


医学细胞生物学 二、干细胞与肿瘤的发生和复发 肿瘤的发生和复发问题一直是困扰学术界和临床医生的难题，入们一直在试图从各种角度解释和找到根源以便能够彻底根治肿瘤。T. Lapidot在1994年最早提出急性髓样白血病干细胞的概念，他们的研究证明了在体外培养的白血病细胞中只有不到1％的细胞能够在小鼠模型中重建白血病，而且只有CD34+CD38一细胞具有在小鼠体内形成白血病的能力，该分子表型与造血干细胞的分子表型一致。2001年，通过类比干细胞与肿瘤细胞，T. Reya等提出了肿瘤干细胞应该具有组织干细胞相似的性质，比如数蜇少；具有自我更新和分化潜能；对组织的形成起决定性作用；表达独特的与富集和鉴定相关的标记，使用相同的信号传导通路等等。2004年，M. Al-Hajj等第一次证明了乳腺癌干细胞的存在，认为在乳腺癌组织中存在的CD44+CD24-细胞对乳腺癌的形成起着决定性的作用。2006年美国癌症研究协会专题讨论会将｝仲瘤干细胞定义为＂肿瘤组织中具有无限自我更新能力、能够产生肿瘤细胞的异源性后代并进而形成肿瘤的细胞＂，并将“在免疫缺陷型小鼠体内形成与原发肿瘤类型相同的肿瘤”作为鉴定肿瘤干细胞的金标准。这个定义的提出为肿瘤干细胞的研究打开了一道门。由于这个概念为临床药物研发提供了新的思路，所以引起了研究人员的广泛兴趣，随后脑瘤干细胞、慢性髓系白血病干细胞、结肠癌干细胞、胰腺癌干细胞、肺癌干细胞、前列腺癌千细胞、肝癌干细胞等相继被鉴定，但是同时也有很多相反的研究结果频频出现，甚至有研究表明肿瘤干细胞实际上是不存在的。2012年来自美国、荷兰和比利时的研究组分别在《自然》和《科学》杂志报道，首次利用谱系示踪的方法在肿瘤的自然栖息地(native h abitat)中证明了癌千细胞的存在。


医学细胞生物学 二、干细胞与肿瘤的发生和复发 随着研究的深入，人们对肿瘤干细胞的认识也更加全面和完整。在肿瘤干细胞学说出现后，对肿瘤的发生问题就有了三种模型，一是随机模型，这是一直以来人们对肿瘤的认识，认为所有的肿瘤细胞都有相同的形成肿瘤的能力，但是哪个细胞能形成肿瘤是随机事件；二是等级模型，即只有肿瘤干细胞能够形成肿瘤，所以治疗肿瘤的关键是杀死肿瘤干细胞；第三种模型是演化模型，这个模型引入了肿瘤微环境的概念，结合了上述两种模型的观点，但是认为肿瘤微环境的改变创造了普通肿瘤细胞演化为肿瘤干细胞的条件，所以近年来人们在关注肿瘤干细胞的同时，特别关注肿瘤微环境的检测和控制，也有很多研究证实了微环境的改变能够引起肿瘤细胞“去分化”，这也符合某些组织干细胞的性质。也有实验证实放疗和某些化疗药物能够“激活＂静息的肿瘤干细胞从而促进了肿瘤的发生。因此在利用肿瘤干细胞理论研究肿瘤发生、复发、转移时要将肿瘤细胞和其存在的微环境看成一个完整的＂肿瘤生态环境＂，肿瘤干细胞、肿瘤细胞可以在这个生态系统中相互转化，它们与肿瘤微环境之间更是相互依存和相互作用的，并在这个微环境中“物竞天择，适者生存”，从这样的角度去考虑，才能辩证地找出对付肿瘤的有效方法。至于肿瘤干细胞的来源，目前尚无定论。从理论上来讲，组织特异性干细胞、过渡细胞和成熟细胞都有可能是肿瘤干细胞的源头细胞，但组织中的干细胞发生突变的可能性为最大。因为在那些细胞更新旺盛的组织器官内，总是持续地需要有分化成熟的细胞的补充，而这些分化成熟细胞是从所存在的其相应组织器官中的组织特异性干细胞分化而来的，这些细胞更新旺盛的组织器官中的干细胞发生突变和积累突变的可能性会很高，出现增殖和分化特性失控的异常干细胞系（即肿瘤干细胞系或癌干细胞系）的可能性也就相应地增大。就现有的知识和活体内的实际情况的复杂性来看，肿瘤的发生是由其组织中的过渡细胞和成熟细胞的转化而来，或由其他因素所致的可能性还是不能排除的。 三、干细胞与组织再生 当组织器官受到某些外来因素的损伤或破坏时，机体可以启动一种修复机制，以使其受损的组织器官的结构和功能得以恢复。在此过程中，在其损伤组织的局部可有大量的细胞增殖，并可伴随有细胞的分化和组织的形成，从而使得损伤部位在空间结构上得到修复，以及其功能的恢复。机体修复组织器官损伤的这种现象就叫做组织再生。在成年个体中，组织再生的细胞生物学基础可有多种情况。其损伤较轻且其邻近的正常组织还有一定的增殖能力时，邻近组织的正常细胞就可以分裂而产生新生的细胞，以修复其损伤。但如果其损伤的程度很重，而且涉及多种组织的损伤，此时就可能启动分化等级更低的细胞（如过渡细胞、前体细胞，甚至组织特异性干细胞）群体的增殖与分化。例如，若采用外科手术的方法，将肝的2/3切除，剩余肝的细胞可以快速分裂增殖，并在一周左右便可使其肝体积恢复到本来的大小。这一情况，说明了成熟的肝细胞也有强大的增殖能力，以使之能够适应各种有害因素所致肝急性损伤修复。在此基础上，也有研究发现这种再生修复是通过成熟肝细胞的直接分裂来实现的，而并未直接涉及干细胞。因为有证据表明，若用倒千里光碱(retrorsine，为一种生物碱）处理小鼠一个月后（以抑制其成熟肝细胞分裂增殖），再采用手术的方法将其小鼠的2/3肝切除，随后便可在肝组织中Hering管的附近发现有胆管反应的发生，而且可以直接观察到卵圆细胞(oval cell，为目前公认的一种肝干细胞）的出现。进而，还可观察到肝再生现象的发生。这一现象暗示，尽管这种再生修复现象可能是通过成熟肝细胞的直接分裂来实现的，但成熟肝细胞更替的来源则还是干细胞。目前已有许多证据表明，在一般的组织中，都有处于不同分化状态的细胞群体的存在。如果从分化程度的角度来看，它们之间有一个潜在的从低到高的等级关系。其中，组织特异性干细胞处于最为基础的位置，随后是过渡细胞，最后是成熟细胞。如果从时间顺序和空间结果的角度考虑，则可将它们比喻为一个“树枝＂样的结构，位于基部的相当千组织特异性干细胞，处于树叶位置的则相当于成熟细胞。而且已经知道，从组织特异性干细胞到成熟细胞的发育过程中，其增殖能力和分化特性呈逐步降低趋势，到成熟细胞时，其增殖和分化的能力已经十分有限（成熟的肝细胞可以分裂2~3次），甚至已经完全丧失（人体内耳的毛细胞就不能增殖）。其他组织器官也可能会有类似的修复机制，即：根据损伤程度的高低，以启动其组织中不同分化等级的细胞的增殖与分化的程序，来实现其修复的需求。然而，不同的损伤程度和不同组织类型的修复结果是不一样的。如果损伤程度较轻，而且邻近的正常成熟细胞还有一定的分裂增殖能力，其修复后的组织在结构上和功能上可与原先的组织完全一样，这种修复在医学上称为“完全修复＂。但如果损伤的程度很重，或者涉及多种组织的损伤，或者其邻近正常成熟细胞己没有增殖能力，其修复后的组织在结构上和功能上都有可能与原先的组织不同（如形成肉芽组织或瘢痕组织），这种修复在医学上称为“不完全修复＂。由此可见，组织再生的能力和类型与其组织中千细胞的功能行为是直接相关的。


医学细胞生物学 三、干细胞与组织再生  四、干细胞与细胞治疗 许多疾病都是细胞功能缺陷或身体器官损伤造成的。作为细胞治疗的选择之一，可以将正常的于细胞或由其分化产生的功能细胞植入病变部位并代偿病变细胞丧失的功能。理论上，干细胞治疗最吸引人的地方在千它可以治疗一些常规治疗方法目前无法治愈的疾病，这些疾病几乎涉及各种器官系统，包括阿尔茨海默病、脑卒中、癫病、泰－萨克斯(Tay-Sachs)病、心脏病、股骨头坏死、关节炎、糖尿病、系统性红斑狼疮等。目前可用于干细胞治疗的干细胞有两大类，一是多潜能干细胞，主要包括胚胎干细胞(ESCs)和第十七窒干细胞与组织的维持和再生401诱导型胚胎干细胞(iPSCs)，二是组织干细胞。这两类细胞应用于临床治疗的主要策略如图17-13所示。虽然在基础研究领域，针对这些干细胞的形态、生化特性、自我更新和分化潜能等诸多方面进行了深入而广泛的研究，利用动物疾病模型进行干细胞治疗效果评价也有很多成功的例子，但针对于临床应用的研究还是近几年的工作。


医学细胞生物学 ES细胞成了二言：干细胞 ES细胞和iPS细胞具有多向分化潜能，是进行干细胞治疗的理想细胞，但是其成瘤性又成为一个致命的缺点。而对那些难以获得功能性组织千细胞或者相应的组织干细胞难以在体外获得足够数量的疾病，ES细胞和iPS细胞就显示出应用上的优势。据美国国立卫生研究院(NIH)的临床试验数据库(clin ical trial)的数据，现注册的利用人的ES细胞来源的视网膜色素上皮细胞治疗黄斑变性，利用ES细胞来源的胰腺内皮细胞治疗I型糖尿病，利用前体细胞治疗心脏衰竭，利用ES细胞来源的少突细胞治疗脊椎损伤，都进入了临床1期或2期研究，而利用iPS细胞诱导分化的实验研究目前还没有进入临床试验阶段。组织干细胞的种类繁多，目前开展临床研究的涉猎范圃很广，就细胞而言包括间充质干细胞，内皮细胞和前体细胞，神经干细胞，角膜缘干细胞，胎盘来源干细胞等等；从治疗的疾病而言，单就神经干细胞，治疗疾病就包括肌萎缩侧索硬化症和慢性脊髓损伤、下肢缺血和休克、神经元蜡样脂褐质沉积症、颈髓损伤、黄斑退化、脊髓损伤、佩利措伊斯－梅茨巴赫病，等等。


医学细胞生物学 ES细胞成了二言：干细胞 造血干细胞移植己应用于临床，它是目前治疗血液系统恶性疾病、先天性遗传病，以及多发性和转移性恶性肿瘤疾病的最有效的方法之一。早在20世纪50年代，临床上已开始应用骨髓移植方法来治疗血液系统肿瘤。至80年代末，外周血干细胞移植发展成熟，在提高治疗有效率和缩短疗程方面优于常规疗法，且有令入满意的效果。近年来，随着跻血干细胞移植技术的不断改善，可以部分代替目前自体外周血干细胞移植，为血液病及恶性肿瘤患者带来福音。到2017年，在美国FDA网站上公布的已经批准上市的涉及干细胞的产品共有7个，其中5个是利用肪带血造血前体细胞进行造血和免疫系统重建的，可以进行异体移植。近年来，非造血系统干细胞应用于临床治疗上最为成功的是角膜缘干细胞。2015年，欧盟委员会批准可有条件用于治疗角膜缘干细胞缺乏症。研究人员将患者未受伤眼的少量角膜缘干细胞取出、扩增并制成干细胞蒲膜，然后植入到经手术去除灼烧伤的角膜瘢痕组织的部位，结果薄膜能成长为新的角膜组织，取代旧有受损组织。该项实验在十年间共治疗106名患者，其中完全恢复视力者81人、部分恢复者14人。


医学细胞生物学 ES细胞成了二言：干细胞 间充质干细胞(MSC)的临床应用研究也正在大范围的展开。临床上应用的MSC，一般是借助千细胞的贴壁性质进行分离和大量培养，这些间质细胞都表达成纤维细胞的标志物。因获取方法简单，安全性受到肯定。2011年以来，在美国NIH临床试验数据库中注册的MSC相关项目不断增加，但大部分都处千临床一期研究阶段，个别项目（跻带血MSC治疗再生障碍性贫血）进入临床四期研究。目前干细胞治疗的临床试验出现了较多的失败案例，其根本原因是对千细胞的生物学行为规律认识不够。此外，干细胞治疗的伦理和法规问题，也应受到关注。 小结邑----·嘈一一一一· 个体的正常发育及其功能维持，有赖于干细胞在空间上和时间上的有序增殖与分化。目前对于干细胞的认识还很初步，其概念正在被不断地补充和修正。但在近些年中，干细胞分离培养技术的快速发展，以及对其分化特性的认识和其科学意义与实用价值的显示，使得干细胞研究领域一跃成为了医学科学，乃至整个生命科学关注的热点，并很快成为了相关领域知识体系的重要组成部分。


医学细胞生物学 小结邑----·嘈一一一一· 干细胞是指那些具有无限增殖能力、并能分化产生一种或一种以上特化细胞的原始细胞。在个体的整个生长发育过程中的各种组织器官中，几乎都发现了干细胞的存在。这些不同种类的干细胞的分化潜能，以及发挥的生物学作用可有很大的差别。但一般地说，它们总是与其所在组织器官的结构与功能相适应。现在已经知道，干细胞具有一般细胞的基本生命现象，如分裂、分化、迁移、衰老及死亡等，而且也同样地服从于一般细胞调控的基本原理。但是，干细胞也有不同于一般细胞的生物学特性，如在增殖分裂方面的缓慢性和自稳性、以及在分化方面的多潜能性和可塑性等。当然，存在于不同的组织器官、不同的发育阶段，以及不同的生理与病理状态下的干细胞的基本生物学特性和功能行为也是不同的，而且也相应地存在着不同的调控机制。也许正是由于这种生物学基础的存在，干细胞才具备了调控个体生长发育和功能维持的基本能力。目前，胚胎干细胞的培养体系已经比较成熟，已经能够常规地分离培养人类和小鼠等多个物种的胚胎干细胞。但是，组织干细胞的培养技术则还有待发展。这是因为组织干细胞的种类繁多，而每一种组织干细胞在活体中生活的微环境都是不同，即便是同一类干细胞，它们在不同生理或病理状态下生活的微环境也都会有很大的差别，因此，组织干细胞的培养技术的发展将是一个长期的任务。关于干细胞的生物学特性及其功能行为调控机制的研究策略和技术体系，目前发展较快。这主要是分子生物学的研究思路和研究技术的介入，以及细胞生物学中细胞培养技术（如三维培养）和分析方法（如各种示踪分析）发展的结果。特别是各种生长因子、细胞因子、激素和黏附因子的发现与应用，以及其分化诱导体系的建立和各种定点干扰技术的应用，使干细胞的研究进入了一个全新的快速发展时期。但人们也意识到了，对于干细胞各种生命现象发生机制的认识，以及人为干预能力的形成，还有待于系统生物学的概念和其相关技术的综合应用。特别是时空的概念和整体的概念，以及各种高通量的、活体（如基因工程动物体系）的和定量的分析技术，将一定是必不可少的。干细胞在人类疾病的治疗中已经显示出了很好的应用前景，但要真正地进入临床，则还有赖于干细胞生物学基础研究的进步。


医学细胞生物学 小结邑----·嘈一一一一· 就目前来看，干细胞的研究有两个方面最为人们所关注，一是干细胞在发育过程中和成体中的基第十七章干细胞与组织的维持和再生403本生物学特性的细节，二是干细胞在生物医学领域（如组织修复等再生医学问题）中的应用。但是，无论其目的是基础生物学研究，还是生物医学应用，关键的问题还是在于是否能够以定量手段和系统生物学的概念，在分子水平上搞清楚干细胞的功能行为是如何控制的。很显然，这一领域的未未发展是极其具有挑战性的。例如，如何确认调控干细胞功能行为的关键信号以及其相关条件，如何有效地将这些信息应用于各种生物医药问题的解决，等等。 （朱每英）第十八章细胞工程 生物工程(bioeng in eerin g)是指用生物体或其组成成分在最适条件下产生有益产物及进行有效生产过程的技术，所以又称为生物技术(biotechnology)。到了近代，随着微生物学、细胞生物学、遗传学和分子生物学的发展，生物技术在内容、层次上有了迅速发展。如今它已包含有基因与基因组工程、酶工程、发酵工程、细胞与组织工程、生化工程、微生物工程等诸多方面。


医学细胞生物学 （朱每英）第十八章细胞工程 细胞工程(cell e ngin ee ring)，顾名思义，是将细胞生物学知识与生物工程学技术相结合而形成的一门新的学科领域。具体说来，它主要是通过细胞融合或拆合、核质交换或核移植、染色体或基因转移以及经由细胞培养和筛选，按照人们预先的设计，产生出新的细胞，并最终用于生产或医疗实践，或进行更深层次的研究及开发。组织工程(tissue engin ee ring)则更强调利用生物学和工程学的原理与技术，研究与开发出可修复或取代人体的组织或器官，用于医学实践。种子细胞、支架材料和调控因子是构成组织工程的三大要素。因此，细胞工程是组织工程的基础之一。


医学细胞生物学 （朱每英）第十八章细胞工程 细胞工程在技术程序中避免了基因分离、提纯、剪切、拼接等分子水平的操作，一般只需将细胞遗传物质直接转移到受体细胞即可形成杂交细胞，因此，其过程相对比较简捷，不致造成对受体细胞的较大损伤，同时转移效率提高。此外，细胞工程不仅可以在动物之间、植物之间、微生物之间进行，还可以在动物与植物间、动物与微生物间、植物与微生物之间进行，从而可产生新的品种，甚至物种。目前，根据操作对象不同，细胞工程又分为动物细胞工程、植物细胞工程以及微生物细胞工程，本章介绍动物细胞工程。正由于细胞工程有上述优势，近年来发展极为迅速，尤其在细胞治疗、动物克隆、转基因动物、再生医学等方面的研究与实践，已经引起全球的剧烈竞争以及科学研究之外的关注。 第一节细胞工程的主要相关技术 细胞工程涉及面很宽，所用技术方法也很多，但就总体来说，细胞工程可以认为是不同层次上的细胞拆合与重组工程。这些层次是细胞整体层次，如细胞培养、细胞融合、细胞重编程；细胞器层次，如核移植；以及分子层次，如基因转移等。


医学细胞生物学 一、大规模细胞培养 细胞培养是细胞工程中最基本、最常用的技术之一。有关细胞培养的基本原理以及基本过程已在第一篇第三章叙述。本节只介绍大规模细胞培养。所谓大规模细胞培养(large scale cell c ulture)是指细胞的高密度(density)或高浓度(concenu·ation)培养，培养容噩在2L以上，需要借助细胞培养容器，目的是制备大噩的细胞或是以此来生产更多的细胞产物。一般说来，lxlO9~l x lO10个细胞可以在1~lOL容积的简单搅拌瓶培养获得。但lx lO11~l X1012个细胞的更大规模培养则需要一系列设备如生物反应器，培养规模可以是1OOL实验室规模，l00~lOOO L中试规模，5000-20000L产业化规模。目前，大规模细胞培养的方法很多，大致可分为悬浮细胞培养和贴壁细胞培养两大体系。但在实际应用中，常分为悬浮培养、固定化培养和微载体培养三种方法。


医学细胞生物学 第十八章细胞工程405（一）悬浮培养 细胞在培养液中呈悬浮状态生长和增殖的培养方法称悬浮培养(suspension c ulture)。悬浮培养适用于血液淋巴组织细胞及其肿瘤细胞（小鼠骨髓瘤细胞SP2/0、NSO)、转化细胞(Namalwa细胞）、融合细胞（杂交瘤细胞）的培养。随着规模化培养技术的不断发展，许多贴壁生长细胞如CHO细胞经悬浮驯化后也可进行悬浮培养。悬浮培养多用于大量生产抗体、疫苗和细胞因子等重组蛋白类药物。悬浮培养的优点是设备相对比较简单而容积可选择性大，培养容积最大可以达25OOO L。这种方式培养可连续收集培养细胞或其产物进行分析，也可适时地传代，操作和控制简便。还有一个优点是传代时无需消化，细胞不会因胰酶和EDTA（乙二胺四乙酸，elhylened iamine lelra acetic acid)的处理以及激烈的机械力分散而受损伤，而且细胞回收率高。再者，由于细胞呈悬浮生长，而且处千不断搅动的动态生长过程之中，细胞的浓度（细胞数／ml)均一，因此可在线直接监测细胞生长情况，工艺可控性强，细胞的浓度可以得到及时有效的调控，细胞的产岳比较恒定。


医学细胞生物学 第十八章细胞工程405（一）悬浮培养 悬浮培养的技术关键在于不断搅拌培养液以及连续通气供给CO2和空气，以便使细胞均匀有效地进行营养物质和气体交换（图18-1)，同时不致产生细胞沉降。总体而言，营养物质和氧气的传递效率较好，培养条件均一。悬浮培养条件下，渗透压、剪切力、气泡破裂均可引起细胞损伤。非离子表面活性剂Pluroni c家族可有效保护细胞免受搅拌和通气反应器中的流体机械破坏作用。常用保护性添加剂包括Plu ronic F68(0.01%-0.1%)，狻甲基纤维素(j%-2%）等。（二）固定化培养加入细胞，排出CO2,使细胞限制或定位千特定空间位挡的培养技术称之为固定化培养。几乎所有动物细胞都可采用固定化培养。固定化培养的制备方法很0.22µm滤膜刁｀多，包括吸附法、共价贴附法、离子／共价交联如果培搅拌培养瓶>50cm,/法、包埋法和微毅化等，常用吸附法和包埋法两大方法。磁化的旋转摆吸附法是最简单的固定化培养技术，即让细胞在适当的条件下贴附在载体（如陶瓷颗凹人的底-勹芒，屯夕粒、玻璃珠或硅胶颗粒）表面，或附着于中空纤维膜，或附着于培养容器表面。包埋法是将细胞包埋于多聚物（如蛋白质、碳氢化物等）


医学细胞生物学 等海绵状基质中进行培养的技术。常用蛋白 速度控制开／关控制信号灯质多聚物有明胶、海藻酸钙疑胶、胶原和纤维图18-1搅拌瓶（容积8L)蛋白质等；对于贴壁依赖性细胞通常采用胶原包埋，而对于非贴壁依赖性细胞则常用海藻酸钙包埋。最简单的固定`化培养系统是N un c细胞工厂。该系统由一组长方形的Pe tri培养板组成，总面积可达600-2400cm2（图18-2)。此外常用的还有中空纤维灌流法（图18-3汃螺旋卷膜培养等。固定化培养对贴壁依赖性细胞和非贴壁依赖性细胞均适用，其优点在于细胞可维持在较小体积培养液中生长，细胞生长密度可达到很高。如N un c工厂一次产认可高达3X108-3X l09个细胞。此外，细胞易于产物分开，有利千产物的分离纯化。 （三）微载体培养 细胞贴附在一定的固相表而进行单层培养的技术称为贴壁细胞培养。贴壁培养系统主要有滚瓶中空纤维、微载体等，尤以微载体常见。微载体培养是让细胞吸附于微载体(m i croc釭ri ers)表面或内部进行生长与增殖的细胞培养技术，旋转细胞工厂，短边朝下，放平，使培养面呈水平位，开口位于最上方。通入5%C02 中断培养液供应使细胞工厂长边


医学细胞生物学 中断培养液供应使细胞工厂长边 勹了细胞人口大分子产品出口如Vero细胞的培养（图18-4)。细胞的贴附与细胞表面及t t微载体表面的化学物理性质有关。微载体表面带有正电荷而细胞表面带有负电荷，这种静电吸引作用使细胞易千贴附于微载体表面。用于制备微载体的材料首先应对细胞没有毒性作用；其次，应能够承受高压灭菌，并可重复利用。微载体是直径在150~250µm的透明小颗粒，常用的材料有交联葡聚糖、塑料基质、聚苯乙烯、明胶、玻璃介质、胶原或胶原涂层、纤维素、生物玻璃等。


医学细胞生物学 （四）三维细胞培养 三维细胞培养(three-dimensional cell cultur e, TDCC)是指将具有三维结构不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养，使细胞能够在载体的三维立体空间结构培养液储存器中迁移、生长，构成三维的细胞载体复合物。三维培养体系以及氧和CO2交换为细胞提供类似体内生长环境，细胞通过紧密连接和（或）缝隙连接等连接方式建立细胞间及细胞与胞外基质间的联图18-3中空纤维灌流（截面图）系，形成一定的三维结构；这种培养方法获得的细胞在基因培养液通过蠕动泵从培养液储存器循环到培养小室；培养液储存器内进行换气表达、基质分泌及细胞功能活动、细胞分化等方面与传统二和C O2交换维培养的细胞均有明显差异，与体内细胞生长情况更为相似。三维细胞培养既能保留体内细胞微环境的物质结构基础，又能体现细胞培养的直观性及条件可控性；它将单层细胞培养体系与组织器官及整体研究联系起米，甚至打一定程度上可以替代动物，进行药物研发与毒性试验。


医学细胞生物学 二、细胞融合 细胞融合(cell fu s i o n)，又称细胞杂交(cell hybridization)，是指2个或2个以上的细胞合并成1个细胞的过程，所产生的细胞称杂交细胞(h y bri d)。该过程涉及质膜的连接与融合，胞质合并，染色体、细胞器以及各种胞质成分的混合。基因型相同的细胞融合所形成的杂交细胞称为同核体(homokaryon)，基因型不同的细胞融合所形成的杂交细胞称为异核体(he terokaryon)。细胞融合现象最早是由G. Bars如等入于1961年图18-4猴肾成纤维细胞Vero在发现，他们将高度恶性与低度恶性肿瘤细胞混合培养，微载体表面上的生长观察到细胞能自发融合产生杂交细胞。1962年，Y. Okada和J. Tadokoro发现利用紫外线灭活的仙台病毒可以促进细胞的融合。除了灭活的病毒之外，某些化学物质，如聚乙二醇(polyethyleneglycol, PEG)、溶血卵磷脂、油酸等以及物理性刺激，如电场、电脉冲等都可以促进细胞的融合。


医学细胞生物学 二、细胞融合 细胞融合是否成功最为关键的技术之一在千对杂交细胞的筛选，即挑选出所需要的杂交细胞。通常有下列三种方法：1抗药性筛选常用HAT培养基筛选。HAT是由次黄嗦呤(hypoxanthino, H)、氨基蝶呤(aminopterin,A)和胸腺啼唗脱氧核昔(thymidine, T)组成的培养基，其原理是当一种胸腺啼唗核昔激酶缺陷(TK-)细胞与次黄噤呤鸟嗦呤磷酸核糖转移酶缺陷(HGPRT-）细胞融合后所得的是一种既含有TK的能力（图18-5)。酶又含有HGPRT酶的杂交细胞，只有这两种基因互补的细胞才具有在HAT选择培养基中存活下来性顷。:`GG酗ig（两个相似的（两个不同的亲代细胞亲代）亲代）同核体细胞亲代细胞2.营养缺陷筛选某些细胞在缺乏某种营养成分的培养基中不能存活，称之为营养缺陷型细胞，如5－漠脱氧尿瞪唗核昔(5-bromouridine deoxyribose)缺陷(BUdR-）细胞。因此可以利用分裂细胞DNA中因掺入有BUdR而对紫外线更敏感的特性，先用光照来杀伤未融合细胞，再将存活下来的缺陷型细胞培养于完全培养基中使其增殖生长。


医学细胞生物学 二、细胞融合 3.温度敏感筛选正常哺乳动物细胞可在32~40"C环境中存活，最适温度为37~38"C。利用化学诱变的方法可使细胞发生突变，然后用非允许温度即38~39屯进行筛选，让温度敏感突变型细胞存活下来，这样的细胞株称为热敏感突变株。反之，我们也可用低温来筛选，所得到的细胞为冷敏感突变株。温度敏感突变的机制在于温度依赖性基因的产物只有在一定的温度下才具有功能，非此温度没有活性。细胞融合技术的不仅为研究细胞的遗传变异、进化、发育等基础研究提供了有利的方法，而且它也是细胞工程的重要工具。因为借此技术，人们可以在种内、种间、甚至动植物间进行细胞融合，产生新的品种，甚至物种，更可以借此生产单克隆抗体这样的生物制剂，用于临床实践。


医学细胞生物学 二、细胞融合 在核移植的研究与实践中，最令入瞩目的是克隆羊多利(Dolly)的出生。1997年2月23日，英国Roslin研究所宣布世界第一头克隆绵羊诞生。该克隆羊的产生过程如图18-7所示。首先从一个苏格兰母羊(A)体内取出卵母细胞，将其核去掉成为无细胞核的卵细胞。再从另一头芬兰母羊(B)的乳腺上皮分离得到体细胞，将其细胞核取出，然后让它与上述去核的卵细胞融合，产生杂交细胞，这种杂交细胞在体外可以发育至痰胚期，然后再将该艇胚（胚泡）植入另一头苏格兰母羊(C)的子宫内，最后生产出小羊。由于该小羊的遗传特性来源于供核母羊(B)，因此，该小羊是供核母羊的克隆。母羊(A)主要是提供了细胞核发育所需的营养与环境，而母羊(C)只是＂代孕“母亲。


医学细胞生物学 二、细胞融合 由于Roslin研究所I. Wilmut在克隆羊多利中所用的是乳腺细胞核，所以该过程称为体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer)。多利羊的成功在理论上具有重要意义，即证明高度分化的成体体细胞核在成熟卵母细胞中仍然可以被激活并且重新编程(reprogramming)；另外，它还可以发育成为一个完整的个体。因此，这种核仍然具有分化全能性(totipotency)，但是该细胞核－质间的相互作用过程及机制尚未完全阐明。随着千细胞技术和核移植技术的快速发展，科学家成功制备了核移植胚胎干(nuclear-tran sfered embryonic stem, ntES)细胞。尽管ntES细胞像ES细胞一样来自痰胚的内细胞团，具有多分化潜能和细胞核移植(nuclear transfer)是指通过显微操作(micromanipulation)将一个细胞的细胞核移植到一个去核的卵母细胞内的技术过程。1938年德国发育生物学家H. Spemann最早提出了进行两栖类动物核移植试验的设想。1953年R. Briggs和T. J. King将一个已分化的细胞核移植入去除卵细胞核的豹蛙(Rana pipiens)卵中，观察到这种卵仍然可发育至豹蛙幼体。1962年，J. Gurdon将已分化的蜊斛肠上皮细胞核移植入去除细胞核的非洲爪蟾(Xenopus laevis)卵中，得到了发育完全正常的成体爪蟾。1963年，我国科学家童第周将金鱼的袭胚细胞核植入去核的未受精卵内，首次得到了克隆鱼。在细胞核移植方法方面，除了可用显微操作仪(micromanipulato1)外，利用游离的细胞核也可进行（图18-6)，即用细胞松弛素(cytochalasin)处理细胞结合离心方法使细胞脱核，然后经PEG将该细胞核融合进另一完整的细胞中，或者融合入一个胞质体内，这种杂交细胞称为胞质杂种(cybrid)，以别于有核间融合所产生的杂交细胞。


医学细胞生物学 二、细胞融合  盖玻片昙哥或气二细离用及仿儿第十八章细胞工程409．有核卵细胞｀细胞核`．无核卵细胞取出细胞叭＠二，兰。融合细胞融合细胞分裂（胚胎） 高增殖特性，可以向任何一种胚层的细胞发育，但是，它与传统意义上的胚胎干细胞具有很大的区别。ntES细胞来自核移植胚胎而不是正常发育的胚胎，ntES的遗传物质与供体核完全一致，所以，ntES移植到供核体体内，理论上不会引起免疫排斥反应。此外，就人胚胎干细胞(hESCs)建系，还可从三原核人受精卵(tripronuclera human zygote)获得二倍体(diploid)或三倍体(triploid)的干细胞，在动物还可从孤雌(parthenogenesis)激活的卵细胞建立千细胞系。除了理论意义外，体细胞核移植技术更是细胞工程领域中的一个极为重大的突破，因为借此技术人们可以进行同种动物克隆以及异种间的克隆，还可以进行同源克隆(homologous cloning)，即将一个个体的体细胞核植入同一个体的去核的卵母细胞中，由此获得的干细胞植入供核（也供卵母细胞）供体体内不发生免疫排斥。因此，具有极大的细胞治疗价值。例如，治疗性克隆(th erape utic cloning)是胚胎干细胞技术与核移植技术相结合，用于产生疾病替代治疗细胞的新技术。它以患者的体细胞核为供核，将重构胚培育至艇胚，从内细胞团中分离出ES细胞，为患者提供与其自身遗传物质一致的组织细胞或器官用千疾病治疗，这样就可以避免异种或同种间细胞／器官移植的免疫排斥反应。该技术使许多目前医学上没有有效治疗方案的疾病获得了重新治愈的可能。另一个核移植技术的应用是生殖性克隆(reproductive cloning)，指的是体细胞核移植后，任其发育直至产生一个新个体。多利绵羊即是通过生殖性克隆产生的。生殖性克隆技术应用于人类的实践即为克隆人。对此，世界多数国家，包括我国政府均坚决反对，但赞同治疗性克隆的研究，因为它可以造福多种疾病的广大患者。


医学细胞生物学 盖玻片昙哥或气二细离用及仿儿第十八章细胞工程409．有核卵细胞｀细胞核`．无核卵细胞取出细胞叭＠二，兰。融合细胞融合细胞分裂（胚胎）  四、基因转移 基因转移(gene tran sfer)指的是将外源基因导入受体细胞并整合至受体细胞的基因组中，使受体细胞遗传性状及表型发生一定改变的技术。借此过程人们可以选择出所需的新型细胞，乃至新的个体。若外源基因不但能在动物体内表达，并且可以遗传，则该动物称为转基因动物(transgeni c a nimal)。一般说来该技术包括如下过程：心选择与提取外源目的基因；＠用一定的方法将外源目的基因导入受体细胞；＠对整合有目的基因的细胞进行筛选、扩增及鉴定；＠若受体为卵细胞，则进行体外培育，并植入合适的动物子宫内；＠筛选并获得转基因动物以及进行后续的所需研究。由上可知，基因转移是获得转基因动物的核心技术，图18-8示基因转移的基本步骤。


医学细胞生物学 四、基因转移 基因转移的方法很多，通常可分为：心物理学方法，包括电穿孔法、显微注射法、裸DNA直接注射法等；＠化学方法，包括DEAE-葡聚糖法、磷酸钙共沉淀法、脂质体包埋法等；＠生物学方法，包括病毒提取DNA或掺入至有扭取RNA并制备cDNA限制性内切酶酶切选择性标记的质粒中1r在选择性培养基中生长用磷酸钙、脂质体转染或然后检测表达电穿孔技术转染至受体细胞介导法、体细胞核移植法、精子载体法以及胚胎干细胞转染法等。下面简述几种常用的外源基因导入受体细胞的技术，即细胞转染(transfection)技术。(—)磷酸钙介导的转染1973年F. L. Graham等最早采用磷酸钙将外源基因导入哺乳动物细胞，由于该方法操作简单，无需昂贵的设备，迄今仍被实验室广泛采用。其原理及基本过程是将氯化钙与外源DNA混合，然后加入到含磷酸根离子的溶液中，即可形成钙－磷酸－DNA共沉淀物；接着，该沉淀物可被培养的细胞内吞摄取进入细胞质，随后进入细胞核，DNA整合入细胞基因组中，并最终得到表达。


医学细胞生物学 四、基因转移 多种因素可以影响磷酸钙介导的转染效率，其中包括细胞的生长状态（一般以70％汇合为佳）、外源质粒DNA的纯度、所形成的磷酸钙沉淀颗粒的大小以及溶液pH。为了保证DNA的高纯度、无内毒素，常通过阴离子交换层析提纯或CsCl离心纯化DNA。 （二）脂质体介导的转染 1987年P. L. Felgne1等建立了阳离子脂质体介导的细胞DNA转染方法，其原理及基本过程是以一种多价阳离子脂质体(lipofectamine)取代单价阳离子载体，当DNA与脂质体通过离子相互作用时，可被直径为600-1200nm阳离子单层脂质体包被形成复合物，该复合物可与培养细胞的细胞膜融合，使DNA进入细胞并整合至受体细胞的基因组中得以表达。阴离子脂质体也可作为细胞转染的试剂。与其他转染方法相比，阳离子脂质体的主要优点在于转染成功率较高，70%-80％的离体细胞均可瞬时表达外源基因。该方法用于大片段DNA、RNA、寡聚核节酸等转染，具有适应性广，细胞毒性较低的优点。但脂质体作转染试剂比较昂贵，不利于大规模使用。


医学细胞生物学 （三）电穿孔法 当把高浓度细胞悬液短暂地暴露于高压脉冲电流时，DNA可通过高电压在细胞膜上所形成的可复性小孔进入细胞质内，然后整合入细胞的基因组并得到表达。电穿孔方法可用于对化学法转染不敏感的细胞。在实践中，一般选择恒定的脉冲，在室温下进行电穿孔，即在500-1500kV/cm的场强下轰击细胞；然后将细胞置于冰上，以延长细胞膜孔道的开放时间。一般情况下，经轰击后能有20%50％的细胞可以存活下来。由于贴壁生长的细胞必须附着在培养皿表面才能生长，因此，与贴壁生长的细胞相比，悬浮细胞更适合用电穿孔法进行转染。另外，该方法所需的细胞及DNA要比化学法更多，而且不同细胞间的最佳转染参数差异较大，因此常须摸索最适实验条件。


医学细胞生物学 （四）病毒感染法 彷，这是一种通过病毒感染途径将外源目的基因导入受体细胞的方法。根据受体细胞的类型不同，可选择具有不同宿主范围和不同感染途径的病毒基因组作为转染载体。常用的病毒载体包括DNA病毒载体（腺病蒋载体、腺相关病毒载体、牛疮病毒载体等）和RNA病毒载体（逆转录病毒载体、慢病毒载体等）。用作基因转染的病毒载体均为复制缺陷型病毒，感染细胞后仅能将基因组整合至细胞，但不能产生包装的病毒颗粒。在各类病毒载体中，比较常用的是逆转录病毒载体和腺病毒载体。逆转录病毒(retrovirus)是一种单链RNA病毒，它进入细胞后，在反转录酶作用下，RNA反转录为DNA，由于反转录病毒的长末端重复序列(LTRs)具有转录启动子的活性，因此将外源DNA连接到LTRs下游可进行重组，再包装为高滴度的病毒颗粒；转染方法为病毒直接感染细胞，或者注射病毒至动物体内，携带外源基因的反转录病毒DNA便可整合入受体的基因组内。诱导多能干细胞即是利用逆转录病毒作为载体将OCT3/4、SOX2、c-myc和RFIA导入小鼠成体细胞而获得的。


医学细胞生物学 （四）病毒感染法 腺病毒(adenovirus)为线型双链DNA，无包膜，其优点是安全性好，不整合入人染色体，不会导致肿瘤发生。此外适用的受体细胞广，有多种血清型(serotypes)选择。外源基因在载体上容易高效表达。 （五）显微注射法 该方法主要用千制备转基因动物，即在显微操作仪下，实验人员通过玻质注射针将DNA迅速注入受精卯内，通常注入雄性原核内或者在其附近，然后将受精卵移植至假孕动物的输卵管中，最后产生转基因动物。该方法需要装备较昂贵的显微操作仪（图18-9)，操作人员必须经过培训方能操作自如，保证一定的成功率。此外，由于成熟卵母细胞数量少，需用超数排卵(superovulation)技术方能获得较多的卵以供实验。


医学细胞生物学 倒置显微镜注射器卵细胞DNA显微操作仪显微操作夜＼/五、细胞重编程 细胞重编程(cellular reprogramming)是指已分化细胞的核基因组恢复其分化前的功能状态。该技术是不改变基因序列的情况下，通过表观遗传修饰如DNA甲基化来改变细胞的命运，分为多能性重编程和谱系重编程两大类。利用多能性重编程技术获得的诱导型多能干细胞，或谱系重编程技术获得的组织干细胞或组织细胞，既具有类似胚胎干细胞的多能性，又避开了胚胎干细胞应用的伦理学限制，同时具有患者特异性或疾病特异性，可显著减少免疫反应，因而极大程度缩短药物研发进程，并使细胞治疗的临床应用成为可能。


医学细胞生物学 （一）多能性重编程 多能性重编程(pluripotent reprogramming)是指已分化细胞在特定条件下去分化恢复到全能性或多能性状态，通常可采取核移植、细胞融合、多能细胞提取物共培养以及诱导性重编程等手段实现。其中，诱导性重编程是细胞重编程的一项重大进展，为干细胞研究领域，乃至整个生命科学领域带来了概念性的革新。其他重编程技术，如核移植技术涉及伦理问题；而细胞融合方法即将体细胞与胚胎癌细胞、胚胎生殖细胞或者胚胎干细胞进行细胞融合方法得到的重编程细胞是四倍体，存在很大程度的基因组不稳定；使用多能细胞提取物与体细胞共培养依然需要干细胞，依然不能克服伦理学问题。


医学细胞生物学 （一）多能性重编程 2006年，日本京都大学Yamanaka实验室利用逆转录病毒介导，将4种转录因子OCT3/4、SOX2、Cmyc和KFI.A导入小鼠分化细胞中，成功逆转了分化过程并得到功能上类似胚胎干细胞的细胞，将其命名为诱导多能千细胞(induced pluripotent stem cell, iPSC)。iPSC对医学领域最直接的贡献在千为疾病研究提供了体外模型。一方面，利用从患者身上建立iPSC疾病模型，可以简化疾病模型建立过程，用于疾病发病机制研究；另一方面，iPSC可以为新药开发提供评价模型，用于测试候选药物的疗效、毒性等。2014年，日本进行了世界首例iPSC应用的临床研究。科学家将iPSC分化出的视网膜色素上皮细胞移植到患者体内，用千治疗老年性黄斑，这是重编程细胞首次移植到人体内，展示了iPSC在临床疾病治疗方面应用前景。 （二）谱系重编程 谱系重编程(lineage reprogramming)指不经过多能性干细胞阶段，直接将已经分化的成熟细胞（或祖细胞）转换为另外一种成熟细胞或于／祖细胞的重编程策略，包括转分化、去分化、转决定、特定类型的化生等。


医学细胞生物学 （二）谱系重编程 转分化(trans-differentiation)是指直接将一类已分化细胞重编程为另一类已分化细胞，且不经过多能性细胞阶段，也称为谱系转换。去分化(de-differentiation)是指已分化细胞失去原有的分化结构和功能成为未分化细胞的过程；随后可将细胞再分化成另一种细胞。诱导性重编程即是最彻底的一个去分化过程。转决定(trans-determination)是指将一种定向的但尚未完全分化的细胞类型重编程为另一种细胞类型，如成体造血干细胞、间充质干细胞的可塑性研究。化生(metaplas ia)是指组织中一种分化细胞被另一种分化细胞替代的过程，通常由慢性炎症刺激导致，常见的有鳞状上皮化生、肠上皮化生、间叶组织化生等。SCNT细胞融合iPS谱系转化Oct4~Sox2+0c-Myc1贤腺


医学细胞生物学 转录因子ES细胞融合细胞ES细胞肝细胞 图18-10细胞重编程的主要策略A体细胞核转移(SCNT)：将体细胞核注射到去核的卵细胞，在体外特殊培养条件下，可以产生ES细胞；B细胞融合：将体细胞与ES细胞融合，可以产生杂合细胞，具备多能ES细胞的一些生物学特性；C. iPS细胞：将体细胞通过诱导表达某些特定基因转变为多能干细胞，例如导入Oct3/4、Sox2、C-Myc和Kif4基因可以将小鼠成纤维细胞转变为多能干细胞；D谱系转化：例如直接将胰腺细胞转化为肝细胞。在此过程中，将一种细胞类型转化为另一种细胞的特异性转录因子是非借助细胞工程技术可对细胞的遗传表型进行定向改造并获得新型细胞，以至新的个体。因此，无论是细胞本身或是细胞的产物在医学实践中均具有广阔的应用领域，尤其是干细胞的研究与技术的兴起与发展，为治疗入类某些以往难以治疗的疾病开辟了前所未有的前景。 —、单克隆抗体的制备 自1975年G. Kohler和C. Milstein创建杂交瘤(hybridoma)技术之后，单克隆抗体(monoclonal antibody)已成为科学研究和疾病诊疗中不可缺少的重要工具，它也成为细胞工程中卓有成效的支柱技术之一。


医学细胞生物学 —、单克隆抗体的制备 经典的单克隆抗体制备方法是借助于聚二乙醇将不分泌抗体的骨髓瘤细胞与分泌抗体的B淋_巴细胞进行融合，并通过HAT选择培养基筛选得与TK一小鼠到杂交瘤细胞（图18-11)。杂交瘤细胞从双方亲骨髓瘤细胞融合＼芦臂巨代细胞中获得遗传信息，一方面可如同骨髓瘤细胞那样无限生长，另一方面又如同B淋巴细胞那样分泌抗体。由这种杂交瘤细胞产生的抗体称为在HAT中长成克隆~\单克隆抗体，它是一种免疫球蛋白，可用ELISA等测定克隆株，方法筛选杂交瘤细胞培养上清液中的抗体，并对$扩增阳性克隆株，阳性细胞进行亚克隆(sub-clone)，确定它们产生检测抗体产物及其特异性，冻存克隆的细胞系抗体的特异性。由于这种抗体是针对单一表位(epitope)，因此它对于特定抗原具有高亲和力和图18-11杂交瘤的制备高特异性。单克隆抗体在生物医学研究、临床诊断和治疗方面都得到了广泛的应用，是近年来最为成功的生物技术药物，现已上市73个抗体药物。在实践中，人们多利用小鼠腹水和离体悬浮培养方法在体内(in vivo)或体外(in vitro)大量制备单克隆抗体。杂交瘤细胞也可在多种中空纤维系统及搅拌罐生物反应器进行大规模悬浮培养。


医学细胞生物学 二、药用蛋白的生产 用生物工程技术生产的制剂通称为生物制品，其中药用蛋白是重要的类别，包括疫苗（口蹄疫苗、狂犬病毒疫苗、脊髓灰质炎疫苗、牛白血病病毒疫苗、乙型肝炎病毒疫苗、瘛疹病毒I型及II型疫苗、巨细胞病毒疫苗等）、细胞因子（凝血因子Vlil和IX、促红细胞生成素、生长激素、IL-2、神经生长因子等）、免疫调节剂(a、B、丫干扰素）以及单克隆抗体等。常用的表达系统分为细菌、酵母、昆虫以及哺乳动物细胞四大类。就制备的方式而言，包括哺乳动物细胞生物反应器和动物生物反应器，其优点是投资少、污染少、工艺相对简单，而且产品的特异性较高等。哺乳动物细胞生物反应器（下称生物反应器）是指在人工条件下，高密度大量培养动物细胞并生产有应用价值的细胞蛋白质产品的设备。本章第一节中所介绍的细胞培养系统均属于生物反应器范畴。20世纪90年代初，美国宇航局的生物反应器(NASA b i oreactor)即为一种旋转培养系统，它以一定的速度转动使得不会发生细胞沉降，并且细胞往往形成三维聚集体以增加产品的生成；当停止转动时，细胞聚集物沉降，此时可收集细胞以及同时更换新鲜培养液。


医学细胞生物学 二、药用蛋白的生产 以转基因动物作为一种生物反应器来生产蛋白质最早由美国K. Gordon等人于1987年报道，他们以小鼠乳腺细胞表达组织型纤溶酶原激活因子(tPA)。2009年，美国GTC Biotherapeutics公司研制的世界上第一个利用转基因山羊奶液生产的药物一一重组人抗凝血酶皿(Atryn)上市，标志着转基因动物药物真正迈入产业化时代。乳腺作为生物反应器具有许多优点：首先，动物乳腺是一个自我封闭的系统，乳腺细胞表达的蛋白质绝大部分随乳汁分泌，不会进入机体的血液系统中，这样便可以避免大量表达的外源型蛋白质干扰宿主动物的生理状况以及可能造成的伤害；此外，不论是转基因牛、绵羊、山羊、兔、或是猪等，它们乳汁的产量较高，而且源源不断，因此，可以获得较多的蛋白产品。除了乳腺之外，血液、尿液也常是收集蛋白产品的原始材料。 三、疾病的细胞治疗 细胞治疗是将体外培养的具有正常功能的细胞植入患者体内（或直接导入病变部位）以代偿病变细胞（或细胞丢失）所丧失的功能。另外，也可采用基因工程技术，将所培养的细胞进行体外遗传修饰，然后再将其导入体内，治疗机体的疾病。


医学细胞生物学 (—)干细胞治疗 干细胞是个体的生长发育、组织器官的结构和功能的动态平衡以及其损伤后再生修复等生命现象的细胞学基础（详见第17章）。正因为干细胞具有这些特性，因此可以用来治疗某些疾病，以替代机体内因细胞衰老退化、死亡或丢失所导致的功能障碍性疾病，即进行干细胞治疗。截至2016年12月，全球已批准13项干细胞治疗产品。通常，干细胞的获取、诱导分化以及在疾病治疗中的应用称之为干细胞工程。1神经系统疾病不少神经系统的疾病都涉及神经元的损伤或死亡。神经干细胞移植为诸如此类的神经系统疾病的治疗带来了曙光。


医学细胞生物学 (—)干细胞治疗 帕金森病是大脑黑质(substantia nigra)多巴胺分泌性神经元退化所引起的一种疾病。黑质是中脑内一个很小的区域，它有协助控制运动的功能，该区的神经元一旦退化、死亡便不能再生。黑质细胞释放神经递质多巴胺(dopamine)，多巴胺不足或缺如，患者便会出现运动障碍，即不随意肌的颤擂及反复的肌肉运动。神经干细胞具有被诱导分化成为多巴胺神经元的潜能，将体外扩增的人神经干细胞移植至帕金森病大鼠模型中，能在大鼠体内分化为成熟的多巴胺神经元，并可建立突触连接，改善大鼠模型的帕金森病的症状。帕金森病入接受人胚中脑组织移植已有十余年的历史，这也为干细胞治疗提供了研究与实践的基础。2.心肌梗死这是由冠状动脉阻塞引起的心脏疾病。人胚胎干细胞可被诱导形成胚胎样体，然后自发或诱导生成心肌祖细胞，它们不但具有心肌特征，而且当这些细胞聚集在一起时，它们可起始有规律的搏动，这为心肌梗死的治疗提供了前提（见第十七章）。此外，间充质干细胞也可被诱导分化为心肌干细胞。2011年7月，韩国FDA批准了FCB-Pharmicell公司的自体骨髓间充质干细胞上市，可被诱导分化为心肌细胞，用于急性心肌梗死治疗。


医学细胞生物学 (—)干细胞治疗 3.糖尿病该病的特征是机体不能分泌（或分泌不足）或不能（或有效）利用胰岛素所导致。2001年美国科学家N. Lumelsky从小鼠胚胎干细胞中获得可分泌胰岛素的细胞，将它们注入糖尿病小鼠的脾脏内，24小时后发现小鼠不仅可产生胰岛素，血糖水平也恢复正常。以色列学者S. Assady证明人胚胎干细胞也可诱导出分泌胰岛素的细胞，这为糖尿病干细胞移植治疗提供了细胞源泉。此外，用异种细胞（如猪）进行移植的研究也在进行中。所以选择猪，原因在千猪的生理、解剖结构与人有一定的相似性。猪胰岛素与人胰岛素结构也极相似。4.肿瘤对千多数肿瘤，目前1岱床尚无有效治疗手段。随着干细胞研究的不断深入，干细胞治疗恶性肿瘤的研究也有了一定的进展。干细胞通过自身多功能分化的特性对肿瘤进行直接杀伤，且干细胞还能对已损伤的机体组织进行修复和治疗，并可以主动修复免疫系统。目前，造血千细胞移植现已成为根治恶性血液病（白血病、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤）的有效手段。间充质干细胞也是一,种骨髓来源的具有多功能分化能力的细胞，间充质干细胞移植是通过采集自体或供体的干细胞，扩增培养后，再由多种途径输入患者体内。


医学细胞生物学 (—)干细胞治疗 5.其他疾病干细胞研究的逐步深入，可为其他疾病的细胞治疗提供前景。事实上早在上个世纪由E. D. Thomus提出的骨髓移植其本质是干细胞治疗。如今骨髓移植可用于白血病外，也用千再生障碍性贫血以及某些血液遗传性疾病的治疗。肿瘤放疗或化疗后对造血系统的损伤也可用造血细胞移植的方法来重建及恢复其造血的功能。此外，体细胞治疗角膜再生、用脂肪干细胞治疗消化道痰管、以干细胞再生肺组织均已取得较好效果。 （二）工程细胞的治疗运用 工程细胞是指采用基因工程手段对体外培养的细胞进行遗传修饰，并由此筛选出可以稳定高水平地表达外源基因的细胞系，进而将这些细胞进行体外扩增后植入患者体内或直接植入病变部位，从而达到治疗效果。


医学细胞生物学 （二）工程细胞的治疗运用 2001年，A. Marti nez-Serrano利用温度敏感性Hi-85永生化细胞建立了高效神经生长因子(NGF)分泌的细胞系。该细胞系含有神经生长因子基因的多个拷贝。将这种细胞移植至切断穹隆的大鼠纹状体及中隔后，仍能持续分泌神经生长因子，并使90％的胆碱能神经元得到恢复。同时，移植的细胞也能很好地在宿主动物脑组织中存活，并且在结构上已完全整合于受体的脑组织中。此外发现所移植的工程细胞还能分化为神经胶质细胞，这项研究显示工程细胞的基因治疗在临床应用的可能性。工程细胞除了用于恢复神经元功能之外，癌症的工程细胞治疗也是研究热点之一。人们希冀将来源于干细胞的，可杀伤癌细胞的特殊细胞铀定到特定的癌细胞，从而直接将癌细胞杀伤；或是将修饰癌细胞的药物，其中包括可引起癌细胞凋亡的因子，输送至癌细胞，使癌细胞死亡。


医学细胞生物学 （二）工程细胞的治疗运用 由千干细胞具有长期增殖的特性，因此是用千基因治疗的良好细胞载体，该途径即称为千细胞／基因联合治疗(combined stem cell/gene therapy)。在众多的干细胞中，骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell, BMMSC)比较受到人们的青眯，认为它是一个较为理想的候选细胞。原因是间充质干细胞具有较大范围的跨系分化能力，此外，骨髓间充质干细胞的来源、分离和培养都比较容易。例如，将血管内皮生长因子(VEGF)基因导入骨髓间充质干细胞，再诱导其分化为心肌细胞后植入心肌梗死区。植入的细胞一方面可以替代死亡了的心肌细胞，同时由于VEGF的作用，可以刺激周围血管的形成。这种将细胞治疗与基因治疗相结合起来的方法，为众多疾病治疗带来新的前景。诚然，为了避免免疫排斥以及可能的潜在致病因素的影响，载体细胞最好是同一个体的，即用于遗传修饰的细胞最好来源于病入本身。


医学细胞生物学 四、组织工程 组织工程的概念是由R. Langer和J. Pavcanti于1987年提出和确定的，是指运用细胞生物学和工程学的原理，研究和开发能修复或改善损伤组织的形态和功能的生物替代物，将其填入机体，恢复失去或下降的功能。组织工程的基本原理和方法是将可体外扩增的正常组织和细胞吸附于一种生物相容性良好的、可被机体吸收的生物材料上，从而形成具有三维空间结构的复合体；然后将细胞－生物材料复合体植入机体器官的病损部位，替代受损的器官。细胞在生物材料被机体逐渐吸收的过程中形成了新的具有相应形态结构和功能的器官或组织，恢复器官或组织的功能或部分功能，从而达到修复创伤或是重建的目的。组织工程的主要研究内容包括如下几个方面：少种子细胞的性质；＠细胞外基质(extracellular matrix, ECM)替代物的研制与开发；＠组织工程化组织(ti ssue engineered tissue)对各种病损组织替代的研究。其中关键问题是植入组织细胞多大程度可恢复或代偿机体失去的功能以及是否有免疫排斥等问题。


医学细胞生物学 （一）组织工程皮肤 组织工程皮肤可分为三大类型：表皮替代物、真皮替代物和全皮替代物。表皮替代物由生长在可降解基质或聚合物膜片上的表皮细胞组成，所谓活性绷带(living bandage)即是此类工程皮肤；真皮替代物是含有细胞或不含细胞的基质结构，用来诱导成纤维细胞的迁移、增殖和分泌细胞外基质；全皮替代物包含以上两种成分，既有表皮又有真皮结构。一般认为，利用表皮于细胞或者混合有表皮千细胞的细胞所构建的真皮可以保持着自我更新能力，有利于皮肤的修复与维持；另外还可以形成较厚的表皮层，恢复皮肤对机体的保护功能。 （二）组织工程肾脏 随着组织工程技术的发展和临床肾脏疾病晚期患者肾脏新供源的迫切需求，组织工程肾脏全器官培养的研究日益深入。Ross等利用组织工程技术，将大鼠肾细胞外基质和胚胎干细胞通过受鼠肾动脉和输尿管输注，结果发现在受鼠的肾小球，血管和肾小管等处均检测到供者胚胎千细胞源的组织特异性分化细胞。目前，已经可以制备带有天然细胞外基质的无细胞支架及再种植非人灵长类供肾细胞的组织工程肾脏。


医学细胞生物学 （三）组织工程骨和软骨 骨组织工程多用BMMSC作为种子细胞，通过培养过程中加地塞米松、维生素C或B－甘油磷酸钠等诱导为成骨样细胞，并用骨钙素、钙结节形成、碱性磷酸酶、1型胶原蛋白等来鉴定。将这种细胞按工程程序培养即可形成组织工程骨。此外，也可将BMMSC直接注入靶组织，它在局部微环境(niche)发生转分化，形成骨或软骨。人MSC的培养基中加入一定量的转铁蛋白、丙酮酸、胰岛素、地塞米松、转化生长因子等，则MSC可分化成为呈II型胶原阳性的软骨细胞。 （四）人工工程血管 将内皮细胞和平滑肌细胞联合种植于多孔三维的多聚L－乳酸支架上，可形成血管。也有学者用成肌细胞(myoblasts)、胚胎成纤维细胞以及内皮细胞联合种植于多聚L-乳酸(PLLA)和多聚乳酸－甘醇酸(PLGA)构成的可降解网格支架上，观察到血管的形成。工程血管的形成将为器官移植的血液供应提供了前提条件。


医学细胞生物学 （五）组织工程心脏瓣膜 目前对于组织工程心脏瓣膜的研究非常活跃。其制备方法多样，主要包括：心在体外将细胞种植于生物降解的支架上并在生物反应器内发育成熟形成组织；＠将细胞种植在天然生物降解的支架上；＠通过植入降解组织引导组织再生，即由内源性细胞重塑组织；＠植入脱细胞瓣膜材料；＠利用内源性病理生理过程在体内生成组织。经典的组织工程模式包括：构建细胞（包括分化不同阶段的干细胞）和细胞赖以生长的支架，然后将细胞／支架复合物放入生物反应器孵育以构建组织，将体外构建的组织植入体内后即发生组织生长和重塑。此间发生的主要病理生理过程有：心细胞增殖和迁移；＠细胞外基质的生成和组织生长；＠支架降解；＠组织重塑。体内组织工程瓣膜包含植入的细胞和（或）受者源的新细胞。 （六）其他工程器官 迄今组织工程角膜己比较成熟，其他组织或器官由于体积大、组成细胞多以及功能复杂等因素在实施中还存在一定困难，但已有组织工程膀胱、肝脏、小肠、食管等的报道。随着对种子细胞及其分化潜能以及支架基质等方面的研究进展，组织工程器官的名单无疑会越来越宽，将对人类目前尚无法治疗的疾病带来光明前景。


医学细胞生物学 （六）其他工程器官 [1]Freshney RI. Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique and Specialized Applications.6th ed. NewJersey：叭ley-Blackwell,2010[2]陈志南工程细胞生物学北京：科学出版社，2013细胞工程是现代生物技术的主要技术之一，它通过细胞融合或拆合、核－质交换或核移植、染色体或基因转移以及细胞培养和筛选，按照预先的设计，产生新细胞的技术。新细胞的产生可在同种物种，甚至不同物种间进行。大规模细胞培养是细胞工程的基本技术，实际应用中常用的有悬浮培养、固定化培养和微载体培养。悬浮培养主要用于大量生产抗体、疫苗、细胞因子等重组蛋白类药物。固定化培养适用于绝大部分动物细胞培养，细胞可在较小体积培养液中维持较高生长密度。微载体培养是让细胞吸附于微载体表面或内部进行生长与增殖的技术。


医学细胞生物学 （六）其他工程器官 细胞融合是细胞工程的重要工具，是将多个细胞合并成一个细胞的过程，通常用抗药性筛选、营养缺陷筛选及温度敏感筛选等方法荻得融合细胞。它为研究细胞的遗传变异、进化、发育等基础研究提供了有利的方法，并且可用于生产单克隆抗体。细胞核移植是将一个细胞的细胞核移植到一个去核的卵母细胞的过程。其理论意义在于可借此探讨细胞核的全能性、细胞分化的调控，其应用价值在于该项技术可以进行细胞治疗。基因转移是将外原基因导入受体细胞并整合至受体细胞的基因组中，使之遗传性状及表型发生一定改变的技术。利用基因转移技术可荻得转基因动物。常用的基因转移方法有磷酸钙介导的DNA转朵、脂质体介导的转染、电穿孔法、病毒感朵法以及显微注射法。细胞重编程是指已分化细胞的核基因组恢复其分化前的功能状态。该技术是不改变基因序列的情况下，通过表观遗传修饰如DNA甲基化来改变细胞的命运，分为多能性重编程和谱系重编程两大类。细胞工程最有成效的应用是单克隆抗体的制备、生产药用蛋白、细胞治疗和组织过程。


医学细胞生物学 （六）其他工程器官 细胞治疗是将体外培养的具有正常功能的细胞植入患者体内（或直接导入病变部位）以代偿病变细胞（或细胞丢失）所丧失的功能。由这一技术衍生的组织替代技木则称为组织工程。建立在干细胞基础上的细胞治疗与组织工程研究的不断深入将为多种人类难以治愈的疾病的彻底修复带来曙光。


医学细胞生物学 （陈志南）参考文献主要中文参考书及文献 [1]凌治萍细胞生物学．北京：人民卫生出版社，2001[2]章静波，林建银，杨恬医学分子细胞生物学北京：中国协和医科大学出版社，2002[3]Alberts B Bray D, Hopkin K, et al．基础细胞生物学赵寿元，金承志，丁小燕，译上海：上海科学技术出版社，2002.[4]刘凌云，薛绍白，柳惠图细胞生物学北京：高等教育出版社，2002[5]桂建芳易梅生发育生物学北京：科学出版社，2002[6][7][8][14[15[16[17[18[19[20[21[22」｀及旧癹上八步炙兰瓜晋乎戈; gn¥运学精要（原书第3版）丁小燕，陈跃磊，译北京：科学出版社，2011[28]杨恬医学细胞生物学北京：人民卫生出版，..L＇[29]胡以平医学细胞生物学．北京：高等教育出版社，2014[30]章静波，刘星霞简明干细胞生物学北京：化学工业出版社，2014[31]Meshorer E, Plath K干细胞的细胞生物学韩忠朝，李宗金，译北京：科学出版社，2014[32]左彶，刘艳平细胞生物学3版北京：人民卫生出版社，2015[33]章静波干细胞／基因联合治疗解剖学报2012,43:289-292[34]黄岚青，刘海广冷冻电镜单颗粒技术的发展、现状与未来物理，2017,46:91-99[I]Alberts B,Johnson A, Lewis J, et al. Molecular biology of the cell.4th ed. New York and Landon:Garland Science Publishing Inc,2002.


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医学细胞生物学 参考文献421 [93]Wang M, Kaufman RJ. Protein misfolding in the endoplasmic reticulum as a conduit lo human disease. Nature,2016,529:326-335.[94]Tarte K. Role of the microenvironment across histological subtypes of NHL. Hematology Am Soc Hematol Educ Program,2017,2017:610-617.


医学遗传学 综述论绪 随着生命科学和医学的飞速发展，人们逐渐认识到医学实践中所遇到的一些问题（许多疾病的病因、发病机制、病变过程、预后、诊治和预防等）需要用遗传学的理论和方法才能得以解决。例如，为什么有高血压家族史的人更易罹患高血压病？为什么同一药物对患有同一疾病的不同患者的疗效不同（有入显效、有人无效、有人表现出严重的不良反应）？第一胎生了一个有先天缺陷的婴儿，第二胎也为先天缺陷患儿的（再发）风险有多大，是否可能出生健康的第二胎？唐氏综合征(Down syndrome，也称Down综合征或21三体综合征，一种由于染色体异常而引起的常见痴呆症）是如何发生的，它在新生儿中出现的机会为什么随母亲年龄的增大而增加？遗传病能不能得到有效的根治？怎样才能预防遗传性疾病的发生而达到健康生殖(healthy birth)的目的？随着社会的不断进步，人们对健康生殖的要求越来越迫切；另一方面，由千人们对疾病发生、发展本质的认识有了进一步提高，认为绝大多数疾病的发生、发展和转归都是内在（遗传）的和外在（环境）的因素综合作用的结果；同时在疾病的发展过程中，遗传与致病因素交互作用，或致病因素对机体细胞产生损害作用，或机体细胞对致病因素产生适应性反应（在多数情况下，这一反应通常是通过基因表达而保护机体细胞并去除有害的致病因素），这些交互作用的结果决定着机体细胞未来的发展方向，或恢复细胞的正常生理功能，或细胞产生异常损害，继而发生组织、器官的损害，导致疾病的形成，并在临床上表现为一定的特征。因此，与环境因素一样，遗传因素已成为现代医学中的另一个重要方面，医务工作者在医疗工作中正遇到越来越多的遗传学问题，与此同时，医学与遗传学的结合即形成了医学遗传学(medical genetics)这一介于基础与临床之间的桥梁学科。


医学遗传学 综述论绪  第一节医学遗传学的任务和范畴 在传统的观念上，遗传因素与环境因素在疾病发生、发展中的交互作用考虑得较少，所以比较局限。一般把遗传因素作为唯一或主要病因的疾病称为遗传病(genetic disorder)；相应地，医学遗传学就是用人类遗传学(hum an genetics)的理论和方法来研究这些“遗传病”从亲代传递至子代的特点和规律、起源和发生、病理机制、病变过程及其与临床关系（包括诊断、治疗和预防）的一门综合性学科。有的学者将侧重千遗传病的预防、诊断和治疗等内容划归为临床遗传学(clinical genetics)或遗传医学(genetic medicine)的范畴，而医学遗传学则侧重千遗传病的病因学、病理生理学的研究。然而，现代医学遗传学的概念比传统医学中的概念有很大的扩充，它首先认为疾病是一个涉及内在（遗传）因素与外在（环境）因素的复杂事件，现代医学遗传学更侧重于从综合的角度比较全面地探讨和分析遗传因素在疾病发生、发展和转归过程中的作用。


医学遗传学 第一节医学遗传学的任务和范畴 医学遗传学是以人类遗传学为基础的，它们都是以“人”为研究对象，这是它们的共同点。不同的是，人类遗传学主要从人种和人类发展史的角度来研究人的遗传性状（例如人体形态的测量以及人种的特征），同时广泛地研究形态结构、生理功能上的变异（例如毛发的颜色、耳的形状等）。在临床上这些变异并不干扰或破坏正常的生命活动，其临床意义不大。而医学遗传学往往是从医学角度来研究人类疾病与遗传的关系。因此，医学遗传学可以说是一门由“遗传病”这一纽带把遗传学和医学结合起来的边缘学科。


医学遗传学 第二节医学遗传学发展简史 Gregor Mendel千1865年发表的《植物杂交实验》揭示了生物遗传性状的分离和自由组合规律，这是科学意义上的”遗传学“学科诞生的标志，但Me nd e l这项工作的重要价值直到1900年才被认识；随即，Mendel定律就被用来解释一些入类疾病的遗传现象。杰出的内科医生Arch ibald Edward Garrod(1901)描述了4个尿黑酸尿症家系，首次提出了先天性代谢病的概念，认为这些疾病的性状属千隐性遗传性状；Wi lliam Curtis Farabee(1903)指出短指（趾）为显性遗传性状；Godfrey Hardy和Wilhelm Weinberg(1908)研究了人群中基因频率的变化，提出遗传平衡定律，奠定了群体遗传学的基础；Herman Nilsson-Ehle(1909)研究数量性状的遗传，用多对基因的加性效应和环境因素的共同作用阐述数量性状的遗传规律。在那个时期，遗传学的理论研究得到充分的发展，但限于当时的技术水平，这些理论的实验验证及遗传物质的微观研究还无法深入开展。


医学遗传学 第二节医学遗传学发展简史 20世纪20~40年代，Frederick Griffit h和Oswald Avery用肺炎双球菌转化实验证明了DNA是遗传物质；1953年，James Watson和Franc is Crick提出了DNA的双螺旋模型，使人们认识了遗传物质的化学本质。随着生物化学实验技术的发展，对一些先天性代谢缺陷疾病的生化机制逐步阐明，先后发现了糖原贮积症I型是由于缺乏葡糖－6－磷酸酶，苯丙酮尿症是由千缺乏苯丙氨酸轻化酶引起的，并提出了一种基因一种酶的假说。1952年，由于低渗制片技术的建立（徐道觉等）和使用秋水仙碱获得了更多中期细胞分裂象[Joe Hin Tj io（蒋有兴）和Albert Leven]后，才证实人体细胞染色数目为46（而非48)，标志着细胞遗传学的诞生。以后相继发现Down综合征为21三体(Jerome Lejeune等）、Klinefelter综合征为47, XXY(Patr icia Jacob和John Strong)等。在染色体显带技术出现后，由染色体畸变引起的疾病不断被发现和报道。


医学遗传学 第二节医学遗传学发展简史 20世纪70年代，限制性内切酶的使用使得科学家首次能够对DNA进行可控的操作。1978年，Y uet-W a i Kan（简悦威）运用这两种技术实现了对锁状细胞贫血症的产前基因诊断。Kar"f Banks Mullis在20世纪80年代发明的聚合酶链反应(PCR)技术能在体外实现DNA分子的快速扩增，从而使某些疾病的DNA检测成为临床的常规工作。如今，PCR已成为生命科学领域应用最为广泛的基本技术。


医学遗传学 第二节医学遗传学发展简史 真正促使医学遗传学发生革命性变化的是20世纪90年代开始的入类基因组计划。该计划的研究目标是从整体上阐明人遗传信息的组成和表达，包括遗传图绘制、物理图构建、测序(sequen cing)、转录图绘制和基因鉴定等方面的工作，为人类遗传多样性的研究提供基本数据，揭示上万种人类单基因异常（有临床意义的约计7000种）和上百种严重危害人类健康的多基因病（例如心血管疾病、糖尿病、恶性肿瘤、自身免疫性疾病等）的致病基因或疾病易感基因，建立对各种基因病新的诊治方法，实现精确医疗(precision medicine)，从而推动整个生命科学和医学领域的发展（表绪－l)。现在，医学遗传学巳成为21世纪分子医学(mol ec ular medicin e)的主体。


医学遗传学 表绪－1医学遗传学大事记 年代里程碑主要贡献者1839细胞学说Matthias Jakob Schle1den和Theodor Schwann1865遗传定律Gregor Mendel1882发现染色体Walther Flemming1902发现先天性代谢缺陷病Archibald Edward Gan-od1903染色体是遗传物质的载体Walter Sutton和Theodor Boveri1956锁状细胞贫血症为点突变所致Vernon M. In伊·am1956人染色体数目应为2n=46Joe Hin Tjw（蒋有兴）和Albert Leven1959首例染色体病(Down综合征）Jerome Lejeune1960首次产前筛查性别Pov!Riis and Fritz Fuchs1960外周血的染色体分析Paul Sidney Moorhead1966首次产前染色体分析WR Breg和MW. Steel1966《人类Mendel遗传》(MIM)问世Victor A McKusick1970染色体显带技术T. Caspersson和Zech1975DNA测序技术Frederick Sanger、Walter Gilbert、Allan Maxam1976首次DNA诊断Yuet-Wai Kan（简悦威）


医学遗传学 表绪－1医学遗传学大事记 1979体外受精技术（试管婴儿）Patrick Steptoe和Robert Edwards 1982基因工程生产的胰岛素上市众多学者1986发明PCR技术Kary Mullis1987人类染色体连锁图众多学者1987OMIM诞生Victor A McKusick 1990首次基因治疗French Anderson和Michael Blaese1990首次成功的PGD Alan Handyside, Robert Winston等


医学遗传学 2000人类基因组序列的框架图众多学者 2003人类基因组测序完成人类基因组测序协作组和Celera公司2007人类基因组SNP图谱公布国际HapMap协作组2008拟对20个种族或民族的1000多例个体进行基因国际千人基因组计划2010人类可遗传的变异大全出版（可能涉及了95%)国际千人基因组计划基因(gene)是细胞内遗传物质的结构和功能单位，以脱氧核糖核酸(DNA)的化学形式存在于染色体上。在人类，基因通过生殖细胞从亲代向子代传递。人类基因组(human genome)是人体所有遗传信息的总和，包括两个相对独立而相互关联的核基因组(nucle釭genome)与线粒体基因组(mitochonclrial genome)。如果不特别注明，人类基因组通常是指核基因组。


医学遗传学 —、人类基因 人类对基因的认识经历了一个漫长的历史发展过程。从1865年Mendel发表的《植物杂交实验》到1953年如nes Watson和Francis Crick提出了DNA分子双螺旋结构模型(double helix)经过了将近一百年的时间，人们才认识到基因是具有特定”遗传效应”的DNA片段、它决定细胞内RNA和蛋白质（包括酶分子）等的合成，从而决定生物的遗传性状。进一步的研究发现在整个生物界中，绝大部分生物（包括人类）基因的化学本质是DNA。但在某些仅含有RNA和蛋白质的病毒中，其RNA是遗传物质。（一）基因的化学本质组成DNA分子的基本单位是脱氧核昔酸。4种不同的脱氧核背酸：脱氧腺嗦呤核昔酸(dAMP, A汃脱氧鸟噤呤核昔酸(dGMP,G汃脱氧胞啥唗核昔酸(dCMP,C)和脱氧胸腺啥唗核昔酸(dTMP, T)按一定顺序排列起来构成脱氧多核甘酸长链(DNA单链）。两条反向平行排列的脱氧多核昔酸单链通过A与T、C与G的碱基互补方式组成DNA双链。4种脱氧核昔酸(A、T、G、C)的排列顺序在不同的DNA分子中各不相同，蕴含着各种生物性状的遗传信息。


医学遗传学 （二）基因的结构 包括人类在内的真核生物的结构基因是割裂基因（图绪－l），由编码序列（外显子）和非编码序列（内含子）组成，两者相间排列。不同基因所含内含子的数目和大小各不相同。例如，导致杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy, DMD)(Duch e nn e肌营养不良症）的基因DMD全长2400kb，是目前已知人类最大的基因，大约由79个外显子和相应的内含子组成，cDNA全长为11OOObp，编码相对分子质量为427000的蛋白，称为dys trophin（含3685个氨基酸残基），从DMD转录形成一条完整的mRNA分子需要16小时。


医学遗传学 增强子转录起始点外显子转录终止点|I厂AT~,,T"~之二上游启动子启动子(TATA盒）图绪－1割裂基因的结构示意图 割裂基因中的内含子和外显子的关系不是固定不变的，即在同一条DNA分子上的某一段DNA序列，在作为编码某一条多肤链的基因时是外显子；作为编码另一条多肤链的基因时是内含子，这是由千mRNA剪接加工的方式不同所致。结果使同一个基因（确切地说是同一段DNA序列）产生两条或以上的mRNA链。这是真核生物基因的表达中，由于一个基因的内含子成为另一个基因的外显子，产生基因的差异表达，构成割裂基因结构上的一个重要特点。每个割裂基因中第一个外显子的上游和最末一个外显子的下游，都有一段不被转录的非编码区，称为侧翼序列(flanking sequence)。包括启动子、增强子以及终止子等对DNA转录起调控作用的DNA序列。


医学遗传学 增强子转录起始点外显子转录终止点|I厂AT~,,T"~之二上游启动子启动子(TATA盒）图绪－1割裂基因的结构示意图 割裂基因结构中外显子－内含子的接头区是高度保守的一致序列，称为外显子－内含子接头。这是割裂基因结构上的又一个重要特点。每一个内含子的两端具有广泛的同源性和互补性，5＇端起始的两个碱基是GT,3'端最后的两个碱基是AG，通常把这种接头形式叫作GT-AG法则(GT-AG rule)。这两个序列是高度保守的，在各种真核生物基因的内含子中均相同。 二、人类基因组 随着人类基因组计划研究的深入和结构基因组学的基本完成，已知人类基因组约有20000~22000个基因。这些与蛋白质合成有关的基因序列只占整个基因组序列的1.1％左右；4％为基因调控序列和RNA基因序列；20％为内含子、基因非翻译区序列以及假基因；75％为基因外(extragenic)序列，其中55％为重复DNA序列。近年来发现人类基因组存在8000多种非编码RNA基因，表明了人类基因组实际上具有很高的复杂性。人类基因组按DNA序列分类既有单拷贝序列，也有重复频率不等的多拷贝序列（表绪－2）。


医学遗传学 二、人类基因组 （一）单拷贝序列在基因组中仅有单一拷贝或少数拷贝，又称非重复序列。单拷贝序列(single copy)的长度在彸'.{.1巳800bp-IOkb之间多为结构基因。单拷贝或低拷贝DNA序列可占到人类基因组的45%。 （二）重复序列 重复序列(repeti t ive DNA)约占人类基因组的55%。有的重复序列较短，有的较长，分散地穿插于整个基因组。这些重复DNA是通过变性、复性实验研究被发现的，重复DNA的复性速度较非重复DNA快。1串联重复串联重复(tandem repeats)序列以5bp、lObp、20bp或200bp为一个重复单位，它们串联重复很多次，约占整个基因组的10%。大多数重复次数多（高度重复），长度可达几百kb，即为串联重复DNA或卫星DNA(satellite DNA)。通过原位分子杂交检测，已知串联重复DNA大多数位千染色体的异染色质区。由15-lOObp组成的重复单位（常富含GC)，重复20~50次形成的O.l-20kb的短DNA，叫作小卫星DNA(minisat ellite DNA)，又叫作可变数目串联重复(variable number of tandem repeat, VNTR)，比上述的卫星DNA（几百kb)短。而在基因组的间隔序列和内含子等非编码区内，广泛存在着与小卫星DNA相似的一类小重复单位（长度<lOObp)，重复序列为1-6bp，称为微卫星DNA(microsatellite DNA)或短串联重复(short tandem repeat, STR)，如(A)n/（T)n、(CA),/(TG)"、(CT)n、(A G八等。由于这些微卫星DNA区域在人类基因组中出现的数目和频率不同，表现为多态性(polymorphism)，为人类遗传分析提供了大械的多态遗传标志，其多态信息量大于RFLPs，可用于基因定位、群体进化以及基因诊断等研究。在脆性X综合征(fragi l e X syndrome, FXS)、脊髓小脑共济失调等疾病中都发现微卫星DNA如(CAG)，，、(CTG)，等的不稳定性，往往发生三核昔酸重复扩增突变。


医学遗传学 （二）重复序列 2散在重复DNA序列和其他可动DNA因子散在重复(interspersed repeats)DNA是以分散方式分布于整个基因组内的重复序列，约占整个基因组的45%。散在重复DNA序列基本上来自转座子(transposon)，即能迁移到基因组不同区域的可移动的DNA序列，主要包括第1类转座子(class I，也称反转录转座子）和第2类转座子(class II，也称DNA转座子）。这些间隔的DNA长度可短至100-400bp(<500bp)，称为短散在重复元件(short interspersednuclear element, SINE)；也可长达6000-7000bp,称为长散在重复元件(long interspersed nuclear element, LINE)。


医学遗传学 （二）重复序列 Alu重复(A lu repeat)是SINE典型的例子，是人类基因组含量最丰富的散在重复序列，平均每3kb发生一次以上的重复，占基因组总DNA含量的11%，长达300bp，在一个基因组中重复30万～50万次。在Alu重复序列内含有一个限制性内切酶Alu I的特异性识别位点AGCT，可被Alu I酶解为一个170bp和130bp的两个片段，故称为Alu重复。研究表明，神经母细胞纤维瘤的发生是由于NFJ抑癌基因突变所致。曾发现一例患者的1对NFJ等位基因之一有一新的A lu重复序列，使这一NFJ基因失活当另一个NFJ基因发生突变后，遂造成神经母细胞纤维瘤。某些隐性遗传病也是由于Alu重复序列插入到外显子中，致使蛋白质编码区的结构改变，出现临床症状。


医学遗传学 （二）重复序列 人类的LINE包括3类基因家族：LINE-I、LINE-2和LINE-3，约占基因组总DNA含量的20%。它们主要位于常染色质区，特别是位于中期染色体富含A-T碱基的深染G带（G-显带阳性）。其中，l!NE-1（或称LI)家族最为常见，是持续活跃的转座因子，也是最重要的入类转座因子，约占基因组总DNA含量的17%。LINE-I全长约6.1kb，编码2种蛋白：可读框(ORF)1编码一个RNA结合蛋白p40，具有核酸分子伴侣活性；可读框(ORF)2编码一个同时具有内切核酸酶与反转录酶活性的蛋白。LINE-I负责基因组中大多数的反转录，可使非自主的SINE和某些mRNA拷贝反转座，产生假基因和反基因(retrogene)。在整个6100bp的LINE-I全长序列中，80-lOObp的序列便有转座能力，可随着插入一个重要的保守序列而破坏基因的功能，从而导致疾病（如某些血友病患者）。


医学遗传学 三、基因表达与调控(—)基因表达 基因表达(gene expression)一般是所储存的遗传信息转变为由特定的氨基酸种类和序列构成的多肤链，再由多肤链构成蛋白质或酶分子，从而决定生物各种性状（表型）的过程。基因表达包括两个步骤：心以DNA为模板转录合成mRNA;＠将遗传信息翻译成多肤链中相应的氨基酸种类和序列。1.转录转录(transcription)是在RNA聚合酶催化下，以DNA的3'一5'单链（模板链template strand，或称反义链antisense strand)为模板，按照碱基互补配对原则（但RNA以U和DNA的A配对，其余配对形式与DNA复制时一致），以三磷酸核昔酸(NTP)为原料合成RNA的过程。转录的最终产物是mRNA、tRNA和rRNA等。合成不同的RNA所需的RNA聚合酶不同，RNA聚合酶I合成rRNA; RNA聚合酶II合成mRNA的前体，RNA聚合酶皿合成snRNA及tRNA等小分子RNA。


医学遗传学 三、基因表达与调控(—)基因表达 (1)转录过程：一般将mRNA的合成分为起始、延伸和终止3个连续的步骤。心在起始阶段，RNA聚合酶II与启动子结合，即可启动RNA的转录合成。已发现的启动子包括TATA框(TATA box)、CAAT框(CAAT box)、GC框(GC box)以及增强子(enhancer)等，它们构成了结构基因的侧翼序列，是人类基因组的一些特殊序列，称为调控序列，对基因的有效表达是必不可缺少的；＠延伸过程是RNA聚合酶II由全酶构型变为主酶构型，并沿着模板链的35'方向移动，精确地按照碱基互补原则，以NTP为底物，在3'端逐个添加核昔酸，使mRNA不断延伸；＠RNA聚合酶II在DNA模板上移动到达终止信号时，RNA合成的停止。


医学遗传学 三、基因表达与调控(—)基因表达 (2)转录产物的加工和修饰：由RNA聚合酶II催化所形成的初始转录产物，仅仅是mRNA的前体，必须经过加工和修饰，才能形成有功能的mRNA（图绪－2)。包括：心＂戴帽”(capping)：即在初级转录物的5'端加上“7－甲基鸟噤呤核昔酸＂帽子(m7GpppN)；＠“加尾”(tailing)：大多数真核生物的初级转录物均需在3'端加上“多聚腺昔酸(poly A)“尾，又称poly A化；＠剪接(splicing)：在剪接酶的作用下，将内含子非编码序列切除，再将外显子编码序列由连接酶逐段连接起来，形成成熟的mRNA分子。每个内含子的5'端起始处有GT序列，3＇端尾部有AG序列，这两个序列为高度保守的一致序列，它们是酶切和拼接的信号。同样，tRNA和rRNA的转录最后也要经过相应的加工和修饰过程，才具编码链（非转录链） 5'3'\外显子：I23王＝＝；：非编码链哉录链G~3•~1．转录5'CAP...一l一t3'poly A加尾 2. RNA加工和剪接5'－9咖圈·;;;咖圈'AAAA3'4.翻译5'-士今士+七吵士今~AAAA3'图绪2转录及其加工过程示意图有功能。


医学遗传学 5'3'\外显子：I23王＝＝；：非编码链哉录链G~3•~1．转录5'CAP...一l一t3'poly A加尾 2翻译翻译(tran s l ation)是以mRNA为模板指导蛋白质合成的过程。蛋白质合成在细胞质内的核糖体上进行。mRNA、tRNA和核糖体在翻译中起着重要的作用，mRNA携带遗传信息，作为合成蛋白质的模板；tRNA转运活化的氨基酸和识别mRNA分子上的遗传密码；核糖体是蛋白质合成的场所把各种特定的氨基酸分子连接成多肤链。蛋白质合成通常分为3个阶段：起始、延长和终止。每个阶段都涉及许多不同而重要的生化过程。要成为有功能的成熟的翻译产物，需要对合成初级翻译产物进行加工。mRNA只能决定多肤链中的氨基酸顺序，而蛋白质分子的空间结构是由翻译后修饰所决定的。


医学遗传学 （二）基因表达调控 绝大多数真核生物是多细胞的、复杂的有机体，基因表达控制的特点是能在特定时间和特定细胞中激活特定的基因，从而实现“预订＂的有序的分化发育过程。各种优势蛋白质决定各种组织细胞的特殊形态和功能。一种组织细胞中通常只有一种或几种蛋白质发挥优势作用，如上皮细胞为角蛋白、结缔组织为胶原蛋白和弹性蛋白、红细胞为血红蛋白、胰岛细胞为胰岛素等，这些特异表达的基因称为奢侈基因(luxury gene)。相对地，几乎在一切体细胞中均能被表达的基因称为持家基因(ho usekeep ing gene)，如与DNA复制、RNA转录和蛋白质合成酶有关的基因及控制糖酵解和三狻酸循环的基因。这表明，细胞表型的分化是由于编码这些蛋白质的基因被选择性地表达，而其他多数基因则处于失活状态或效率相对低的表达状态。真核生物基因表达的调控是通过多阶段水平实现的，可以将复杂的调控机制简要的归为转录调控、转录后调控、翻译、翻译后调控和表观遗传学调控五个层次。当然每种表达调控因素并不是完全独立的，如长链非编码RNA(long non-codin g RNA, ln cRNA)是一类转录本长度超过200nt的RNA分子，不编码蛋白，定位于细胞核或细胞质内，以RNA的形式在多种层面上（表观遗传学、转录水平以及转录后水平等）调控基因的表达。\I,冗}戊｝(3)组蛋白修饰和染色质重构：核小体的致密结构能够阻止DNA与蛋白质之间的相互作用，而组蛋白修饰和染色质重构有助于局部的染色质可逆地由浓缩状态转变为易接近的构象。组蛋白乙酰基转移酶(histon e acetyltransferase)可以促使组蛋白乙酰化，使组蛋白与DNA的结合力降低。而染色质重构则是指染色质重构复合体(c hromatin remodeling complex)通过ATP水解暂时改变核小体的结构，从而使各种蛋白质易于与DNA接近。


医学遗传学 （二）基因表达调控 2转录后水平调控前面提到，真核细胞mRNA转录后形成成熟的mRNA需要经过剪接、加帽、加尾等过程，影响其中任何一个环节都将调控基因的表达，如选择性剪接、RNA编辑等。 RNA编辑的加工方式存在。 RNA编辑的生物学意义主要表现在：心经过编辑的mRNA具有翻译活性；＠使该mRNA能被通读心在一些转录物5'末端可创造生成起始密码子AUG，以调节翻译活性；＠RNA编辑可能与生物进化有关；＠RNA编辑不偏离中心法则，因为提供编辑的信息源仍然来源于DNA贮藏的遗传信息。3翻译水平的调控许多基因在蛋白合成的水平上也受到调节，由千免去了改变mRNA转录水平所需的时间，翻译水平的调控对外界刺激的反应更为迅速。 绪论 m1croRNA的调控作用主要包括：(DmiRNA对靶mRNA翻译起始的抑制；＠miRNA对靶mRNA翻译起始后抑制；＠miRNA诱导mRNA转录衰减；＠miRNA的正调控与去抑制。4翻译后水平的调控有些蛋白质合成完成后需经过适当的加工修饰才有活性，因而翻译后修饰是蛋白质结构和功能调节的一种重要方式，大大增加了蛋白质的多样性和复杂性。


医学遗传学 绪论 (l)常见的蛋白质翻译后修饰：体内最常见的蛋白质翻译后修饰是磷酸化修饰，即在蛋白激酶的作用下，将ATP或GTP上的磷酸基团转移到底物上。除此以外，糖基化、泛素化、类泛素化(SUMOylation)、乙酰化和甲基化等也是常见的蛋白质翻译后修饰的方式。通过翻译后修饰维持蛋白质的活性，发挥其生理功能，参与蛋白质的降解和蛋白间的相互作用，影响蛋白在细胞内的分布等。(2)翻译后修饰的协同作用：细胞中翻译后修饰种类繁多，往往是多种修饰协同发挥作用，形成调控网络。无论是生理还是病理过程，都需要各种修饰的蛋白质共同作用。


医学遗传学 绪论 5表观调控一个基因的结构除了编码特定功能产物的DNA序列外，还包括对这个特定产物表达所需的邻接DNA序列。在对某些遗传病的家系研究中发现，虽然基因的编码部分结构完整，也未发生改变，但若它的邻接DNA序列发生了改变，如常见的邻接序列某些区域单个碱基的替换可使此功能产物不能表达，也可能引发疾病。另外，在基因的核昔酸序列不发生突变的情况下，基因的修饰如DNA甲基化、组蛋白的乙酰化等也可能导致基因的活性发生改变，使基因决定的表型出现变化，且可传递少数世代。这就是表观遗传学(epigenetics)所涉及的主要内容。 第四节遗传病概述 基因的结构或表达调控异常则可导致遗传病的发生。按经典的概念，遗传病或遗传性疾病的发生需要有一定的遗传基础，并通过这种遗传基础、按一定的方式传于后代发育形成的疾病。因此，遗传病的传递并非是现成的疾病，而是遗传病的发病基础。而在现代医学中，遗传病的概念有所扩大，遗传因素不仅仅是一些疾病的病因，也与环境因素一起在疾病的发生、发展及转归中起关键性作用。因此，在了解医学遗传学时，既要把握经典的遗传病概念，也要对遗传病的新进展有所认识。但在本教材中，主要是以经典概念为线索展开讨论的。