生物化学与分子生物学 242第三篇遗传信息的传递 (a)DNA pol皿的核心酶和B亚基；（b)(c)(d)分别是后随链的巳复制、正在复制和未复制的片段，实线是母链，虚线代表子链DNA复制延长速度相当快。以E. coli为例，营养充足、生长条件适宜时，细菌20分钟即可繁殖一代。E. coli基因组DNA全长约4600kb，依此计算，每秒钟能掺入的核昔酸达3800个。 三、复制的终止 复制的终止过程，包括切除引物、填补空缺和连接切口（动画12-9“复制的终止＂）。原核生物基因是环状DNA，复制是双向复制，从起点开始各进行180°，同时在终止点上汇合。


生物化学与分子生物学 三、复制的终止 由于复制的半不连续性，在后随链上出现许多冈崎片段。每个冈崎片段上的引物是RNA而不是DNA。复制的完成还包括去除RNA引物和换成DNA，最后5'把DNA片段连接成完整的子链。这一过程用图12-14加以5'`从___--NVVW说明。实际上此过程在子链延长中已陆续进行，不必等到RNA酶引物的水解靠细胞核内的DNA pol I，水解后留下'i'-OH P空隙(gap)。空隙的填补由DNA pol I而不是DNA pol poll!dNTP皿催化，从5'端向3'端用dNTP为原料生成相当千引物长度的DNA链。dNTP的掺入要有3'-0H，在原引物5'相邻的子链片段提供3'-0H继续延伸，就是说，由后复S'tvVVVvP制的片段延长以填补先复制片段的引物空隙。填补至足够长度后，还是留下相邻的3'-0H和5'-P的缺口5'(nick)。缺口由连接酶连接。按照这种方式，所有的冈`, V崎片段在环状DNA上连接成完整的DN A子链。前导链图12-14子链中的RNA引物被取代也有引物水解后的空隙，在环状DNA最后复制的3'-0H齿状线代表引物端继续延长，即可填补该空隙及连接，完成基因组DNA的整个复制过程。 第四节真核生物DNA复制过程 真核生物的基因组复制在细胞分裂周期的DNA合成期(S期）进行。细胞周期进程在体内受到微环境中的增殖信号、营养条件等诸多因素影响，多种蛋白质因子和酶控制细胞进入S期的时机和DNA合成的速度。真核生物DNA合成的基本机制和特征与原核生物相似，但是由于基因组庞大及核小体的存在，反应体系、反应过程和调节均更为复杂。 一、真核生物DNA复制的起始与原核生物基本相似 真核生物DNA分布在许多染色体上，各自进行复制。每个染色体有上千个复制子，复制的起点很多。复制有时序性，就是说复制子以分组方式激活而不是同步启动。转录活性高的DNA在S期早期就进行复制。高度重复的序列如卫星DNA、连接染色体双倍体的部位即中心体(cen trosome)和线性染色体两端即端粒(telomere)都是在S期的最后阶段才复制的。真核生物复制起点序列较E. coli的oriC复杂。酵母DNA复制起点含llbp富含AT的核心序列：A(T)TTTATA(G)TTTA(T)，称为自主复制序列(autonomous replication sequence, ARS)。也发现比E.coli的oriC序列长的真核生物复制起点。真核生物复制起始也是打开双链形成复制叉已，形成引发体和合成RNA引物。但详细的机制，包括酶及各种辅助蛋白质起作用的先后顺序，尚未完全明了。复制的起始需要DNA pol ex、pole和pol8的参与（表12-2)。此外还需解旋酶，拓扑酶和复制因子(replication factor, RF)，如RFA、RFC等。增殖细胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen, PCNA)在复制起始和延长中发挥关键作用。PCNA为同源三聚体，具有与E. coli DNA pol皿的B亚基相同的功能和相似的构象，即形成闭合环形的可滑动的DNA夹子，在RFC的作用下PCNA结合千引物－模板链；并且PCNA使pol8获得持续合成的能力。PCNA尚具有促进核小体生成的作用（见后）。PCNA的蛋白质水平也是检验细胞增殖能力的重要指标。 二、真核生物DNA复制的延长发生DNA聚合酶转换 现在认为DNApol ex主要催化合成引物，然后迅速被具有连续合成能力的DNA pol8和DNA pole所替换，这一过程称为聚合酶转换。DNA pol8负责合成后随链，DNA pole负责合成前导链。真核生物是以复制子为单位各自进行复制的，所以引物和后随链的冈崎片段都比原核生物的短。实验证明，真核生物的冈崎片段长度大致与一个核小体(nucleosome)所含DNA碱基数(135bp)或其若干倍相等。可见后随链的合成到核小体单位之末时，DNA pol8会脱落，DNA pol ex再引发下游引物合成，引物的引发频率是相当高的。pol ex与pol8之间的转换频率高，PCNA在全过程也要多次发挥作用。以上描述的实际是真核生物复制子内后随链的起始和延长交错进行的复制过程。前导链的连续复制，亦只限于半个复制子的长度。当后随链延长了一个或若干个核小体的长度后，要重新合成引物。FENl和RNase H等负责去除真核复制RNA引物。真核生物DNA合成，就酶的催化速率而言，远比原核生物慢，估算为50个dNTP/S。但真核生物是多复制子复制，总体速度是不慢的。原核生物复制速度与其培养（营养）条件有关。真核生物在不同楛官组织、不同发育时期和不同生理状况下，复制速度大不一样。 三、真核生物DNA合成后立即组装成核小体 复制后的DNA需要重新装配。原有的组蛋白及新合成的组蛋白结合到复制叉后的DNA链上，真核生物DNA合成后立即组装成核小体。生化分析和复制叉的图像一致表明，核小体的破坏仅局限在紧邻复制叉的一段短的区域内，复制叉的移动使核小体破坏，但是复制叉向前移动时，核小体在子链上迅速形成。核小体组蛋白八聚体的数量是同期合成的一个核小体DNA长度的两倍，核素标记实验证明，原有组蛋白大部分可重新组装至DNA链上，但在S期细胞也大蜇、迅速地合成新的组蛋白。 四、端粒酶参与解决染色体末端复制问题 真核生物DNA复制与核小体装配同步进行，复制完成后随即组合成染色体并从G2期过渡到M期。染色体DNA是线性结构。复制中冈崎片段的连接，复制子之间的连接，都易于理解，因为均在线性DNA的内部完成。染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙。剩下的DNA单链母链如果不填补成双链，就会被核内DNase酶解。某些低等生物作为少数特例，染色体经多次复制会变得越来越短（图12-15）。早期的研究者们在研究真核生物复制终止时，曾假定有一种过渡性的环状结构帮助染色体末端复制的完成，后来一直未能证实这种环状结构的存在。然而，染色体在正常生理状况下复制，是可以保持其应有长度的。 ＼江＞，已'.,．.亨`．·, 3'鲁｀｀．．．i^，，，:嚷二．．霉如•重'"..;_,`“·土r...产...5'3勺A5'5'V,·:.'『凸3'3'••'I俨憾m，付曹阶晶“'5'53'端粒是真核生物染色体线性DNA分子的末端结构。形态学上，染色体DNA末端膨大成粒状，这是因为DNA和它的结合蛋白质紧密结合，像两顶帽子那样盖在染色体两端，因而得名包。在某些情况下，染色体可以断裂，这时，染色体断端之间会发生融合或断端被DNA酶降解。但正常染色体不会整体地互相融合，也不会在末端出现遗传信息的丢失。可见，端粒在维待染色体的稳定性和DNA复制的完整性中有着重要的作用。DNA测序发现端粒结构的共同特点是富含T-G短序列的多次重复。如仓鼠和人类端粒DNA都有(Tn Gn),的重复序列，重复达数十至上百次，并能反折成二级结构。20世纪80年代中期发现了端粒酶(telom erase)。1997年，人类端粒酶基因被克隆成功并鉴定了该酶由三部分组成：约45l nt或150~1300nt的端粒酶RNA(human telomerase RNAz/-新合成的端粒端粒酶延长重复序列hTR)、端粒酶协同蛋白1(human telomerase associat ed protein l, hTPl)和端粒酶逆转录酶该酶兼有提供RNA模板和催化逆转录的功能。复制终止时，染色体端粒区域的DNA确有可能缩短或断裂。端粒酶通过一种称为爬养传代次数增加，端粒长度逐渐缩短。生殖细胞中端粒长于体细胞，成年人细胞中端粒比胚胎细胞中端粒短。据上述的实验结果，至少可以认为在细胞水平，老化是和端粒酶活性下降有关的。当然，生物个体的老化，受多种环境因素和体内生理条件的影响，不能简单地归结为某单一因素的作用。此外，在增殖活跃的肿瘤细胞中发现端粒酶活性增高。但在临床研究中也发现某些肿瘤细胞的端粒比正常同类细胞显著缩短。可见，端粒酶活性不一定与端粒的长度成正比。端粒和端粒酶的研究，在肿瘤学发病机制、寻找治疗靶点上，已经成为一个重要领域。 246第三篇遗传信息的传递 五、真核生物染色体DNA在每个细胞周期中只能复制—次真核染色体DNA复制的一个重要特征是复制仅仅出现在细胞周期的S期，而且只能复制一次。染色体的任何一部分的不完全复制，均可能导致子代染色体分离时发生断裂和丢失。不适当的DNA复制也可能产生严重后果，如增加基因组中基因调控区的拷贝数，从而可能在基因表达、细胞分裂、对环境信号的应答等方面产生灾难性后果。真核细胞DNA复制的起始分两步进行，即复制基因的选择和复制起点的激活，这两步分别出现千细胞周期的特定阶段。复制基因(replicator)是指DNA复制起始所必需的全部DNA序列。复制基因的选择出现于G1期，在这一阶段，基因组的每个复制基因位点均组装前复制复合物(pre-replicative complex, pre-RC)。复制起点的激活仅出现于细胞进入S期以后，这一阶段将激活pre-RC，募集若干复制基因结合蛋白和DNA聚合酶，并起始DNA解旋。复制起点的激活与细胞周期进程一致。细胞周期蛋白D的水平在G1后期升高，激活S期的CDK(cyclin-dependent kinase, CDK)。复制许可因子(replication licensing factor)是CDK的底物，为发动DNA复制所必需。复制许可因子一般不能通过核膜进入核内，但是在有丝分裂的末期、核膜重组之前可以进入细胞核，与DNA的复制起点结合。等待被刺激进入S期的CDK激活，启动复制。一旦复制启动，复制许可因子即失去活性或被降解。在细胞周期的其他时间内，新的复制许可因子不能进入细胞核内，保证在一个细胞周期内只能进行一次基因组的复制。在原核细胞中，复制基因的识别与DNA解旋、募集DNA聚合酶偶联进行。E. coli的复制基因是oriC。而在真核细胞中，这两个阶段相分离可以确保每个染色体在每个细胞周期中仅复制一次。 六、真核生物线粒体DNA按D环方式复制 D-环复制(D-loop replication)是线粒体DNA的复制方式。复制时需合成引物。mtDNA为闭合环状双链结构，第一个引物以内环为模板延伸。至第二个复制起点时，又合成另一个反向引物，以外环为模板进行反向的延伸。最后完成两个双链环状DNA的复制（图12-17)。复制中呈字母D形状而得名。D环复制的特点是复制起点不在双链DNA图12-17进行中的D环复制同一位点，内、外环复制有时序差别。左：第一个引物在第一起点上合成；右：延长至第二真核生物的DNA pol-y是线粒体催化DNA复起点，合成第二引物制的DNA聚合酶。20世纪50年代以前，只知道DNA存在千细胞核染色体中。后来在细菌染色体外也发现能进行自我复制的DNA，例如质粒，以后就利用质粒作为基因工程的常用载体。真核生物细胞器—一线粒体，也发现存在mtDNA。人类的mtDNA已知有37个基因。线粒体的功能是进行生物氧化和氧化磷酸化。其中13个mtDNA基因就是为ATP合成有关的蛋白质和酶编码的。其余24个基因转录为tRNA(22个）和rRNA(2个），参与线粒体蛋白质的合成。mtDNA容易发生突变，损伤后的修复较困难。mtDNA的突变与衰老等自然现象有关，也和一些疾病的发生有关。所以mtDNA的突变与修复，成为医学研究上引起广泛兴趣的科学问题。线粒体内蛋白质翻译时，使用的遗传密码和通用的密码有一些差别。 第五节逆转录 双链DNA是大多数生物的遗传物质。然而，某些病毒的遗传物质是RNA。原核生物的质粒，真核生物的线粒体DNA，都是染色体外存在的DNA。这些非染色体基因组，采用特殊的方式进行复制。 第十二章DNA的合成247一、逆转录病毒的基因组RNA以逆转录机制复制 RNA病毒的基因组是RNA而不是DNA，其复制方式是逆转录(reverse transcription)，因此也称为逆转录病毒(retrovirus)尽。但是并非所有的RNA病毒都是逆转录病毒。逆转录的信息流动方向(RNA一DNA)与转录过程(DNA--+-RNA)相反，是一种特殊的复制方式。1970年，H. Temin和D. B斗timore分别从RNA病毒中发现能催化以RNA为模板合成双链DNA的酶，称为逆转录酶(reverse transcriptase)，全称是依赖RNA的DNA聚合酶(RNA-dependent DNA polymerase)已从单链RNA到双链DNA的生成可分为三步（图12-18)：首先是逆转录酶以病毒基因组RNA为模板，催化dNTP聚合生成DNA互补链，产物是RNA/DNA杂化双链。然后，杂化双链中的RNA被逆转录酶中有RNase活性的组分水解，被感染细胞内的RNase H(H=Hybrid)也可水解RNA链。RNA分解后剩下的单链DNA再用作模板，由逆转录酶催化合成第二条DNA互补链。逆转录酶有三种活性：RNA指导的DNA聚合酶活性，DNA指导的DNA聚合酶活性和RNase H活性，作用需Zn2＋为辅因子。合成反应也按照5'一3'延长的规律。有研究发现，病毒自身的tRNA可用作复制引物。


生物化学与分子生物学 第十二章DNA的合成247一、逆转录病毒的基因组RNA以逆转录机制复制 5'--－一一RNA模板5AAAAAA3,合成cDNA第一链i．逆转录酶i逆转录酶RNA/DNA-----_____AAAAAA33'杂化双链3'TITITI'5'(a)逆转录病毒细胞内复制。病毒的tRNA可作为cDNA第二链合成的引物；（b）试管内合成cD NA。单链cDNA的3'端能够形成发夹状的结构作为引物，在大肠杆菌聚合酶I Klenow作用下，合成cDNA的第二链按上述方式，RNA病毒在细胞内复制成双链DNA的前病毒(provirus)。前病毒保留了RNA病毒全部遗传信息，并可在细胞内独立繁殖。在某些情况下，前病毒基因组通过基因重组(gene recombination)，插入到细胞基因组内，并随宿主基因一起复制和表达。这种重组方式称为整合(integration)。前病毒独立繁殖或整合，可成为致病的原因。


生物化学与分子生物学 二、逆转录的发现发展了中心法则 逆转录酶或逆转录现象的发现是分子生物学研究中的重大事件。中心法则认为，DNA的功能兼有遗传信息的传代和表达，因此DNA处于生命活动的中心位置。逆转录现象说明，至少在某些生物，RNA同样兼有遗传信息传代功能。这是对传统的中心法则的挑战。、飞i}对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论，至20世纪70年代初，从逆转录病毒中发现了癌基因。至今，癌基因研究仍是病毒学、肿瘤学和分子生物学领域的重大课题。艾滋病病原人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)也是RNA病毒，有逆转录活性。


生物化学与分子生物学 二、逆转录的发现发展了中心法则 分子生物学研究还应用逆转录酶作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为cDNA法。在人类这样庞大的基因组DNA(3.2xl09bp)中，要选取其中一个目的基因，有相当大难度。对RNA进行提取、纯化，相对较为可行。取得RNA后，可以通过逆转录方式在试管内操作。用逆转录酶催化dNTP在RNA模板指引下的聚合，生成RNA/DNA杂化双链。用酶或碱把杂化双链上的RNA除去，剩下的DNA单链再作为第二链合成的模板。在试管内以DNA pol I的大片段，即Klenow片段催化dNTP聚合。第二次合成的双链DNA，称为cDNA。c是互补(compleme ntary)的意思。cDNA就是编码蛋白质的基因，通过转录又得到原来的模板RNA，现在已利用该方法建立了多种不同种属和细胞来源的含所有表达基因的cDNA文库，方便人们从中获取目的基因。 小结 DNA复制是指DNA基因组的扩增过程。在此过程中，以亲代DNA作为模板，按照碱基配对原则合成子代DNA分子。复制需多种酶和蛋白质辅因子的参与。细胞内的DNA复制有半保留性、半不连续性和双向性等特征。


生物化学与分子生物学 小结 原核生物的复制过程包括起始、延长和终止。起始是将DNA双链解开形成复制又。复制的延长由引物或延长中的子链提供3'-0H，供dNTP掺入生成磷酸二酣键，延长中的子链有前导链和后随链之分，复制产生的不连续片段称为冈崎片段。复制的终止需要去除RNA引物、填补留下的空隙并连接片段之间的缺口使之成为连续的子链DNA。真核生物复制发生于细胞周期的S期，其过程与原核生物相似，但更为复杂和精致。复制的延长与核小体组蛋白的分离和重新组装有关。复制的终止需要端粒酶延伸端粒DNA。非朵色体基因组采用特殊的方式进行复制。逆转录是RNA病毒的复制方式。逆转录现象的发现，加深了人们对中心法则的认识，拓宽了RNA病毒致癌、致病的研究。在基因工程操作上，还可用逆转录酶制备cDNA。D环复制是真核生物线粒体DNA的复制方式。


生物化学与分子生物学 思考题（高国全）第十三章DNA损伤和损伤修复 生物遗传物质DNA的遗传保守性是维持生物物种相对稳定的最主要因素。然而，在长期的生物演进过程中，生物体时刻受到来自内、外环境中各种因素的影响，DNA的改变不可避免。各种体内外因素所导致的DNA组成与结构变化称为DNA损伤(DNA damage)。DNA损伤可产生两种后果：一是损伤导致DNA的结构发生永久性改变，即突变；二是损伤导致DNA失去作为复制和（或）转录的模板的功能。


生物化学与分子生物学 思考题（高国全）第十三章DNA损伤和损伤修复 在长期的生物进化中，无论低等生物还是高等生物均形成了自己的DNA损伤修复系统，可随时修复损伤的DNA，恢复DNA的正常结构，保持细胞的正常功能。实际上，DNA损伤的同时即伴有DNA损伤修复系统的启动。受损细胞的转归，在很大程度上，取决于DNA损伤的修复效果，如损伤被正确修复，细胞的DNA的结构恢复正常，细胞就能够维持正常状态；如损伤严重，DNA不能被有效修复，则可能通过凋亡的方式，清除这些DNA受损的细胞，降低DNA损伤对生物体遗传信息稳定性的影响。另外，当DNA的损伤发生不完全修复时，DNA发生突变，染色体发生畸变，可诱导细胞出现功能改变，甚至出现衰老、细胞恶性转化等生理病理变化。当然，如果遗传物质具有绝对的稳定性，那么生物将失去其进化的基础，就不会呈现大千世界、万物生辉的自然景象。因此，自然界生物的多样性依赖于DNA损伤与DNA损伤修复之间的良好平衡。


生物化学与分子生物学 第一节DNA损伤 DNA损伤的诱发因素众多，一般可分为体内因素与体外因素。体内因素主要包括机体代谢过程中产生的某些活性代谢物，DNA复制过程中发生的碱基错配，以及DNA本身的热不稳定性等，均可诱发DNA“自发“损伤。体外因素则主要包括辐射、化学毒物、药物、病毒感染、植物以及微生物的代谢产物等。值得注意的是，体内因素与体外因素的作用，往往是不能截然分开的。通常，体外因素是通过体内因素引发DNA损伤的。然而，不同因素所引发的DNA损伤的机制往往又是不相同的。


生物化学与分子生物学 —、多种因素通过不同机制导致DNA损伤(—)体内因素 1. DNA复制错误在DNA复制过程中，碱基的异构互变，4种dNTP之间的浓度的不平衡等均可能引起碱基的错配，即产生非Watson-Crick碱基对。尽管绝大多数错配的碱基会被DNA聚合酶的即时校读功能所纠正，但依然不可避免地有极少数的碱基错配被保留下来。DNA复制的错配率约此外，复制错误还表现为片段的缺失或插入。特别是DNA上的短片段重复序列，在真核细胞基因组上广泛分布，导致DNA复制系统工作时可能出现“打滑“现象，使得新生DNA上的重复序列的拷贝数发生变化。DNA重复片段在长度方面表现出的高度的多态性，在遗传性疾病的研究上有重大价值。亨廷顿病(huntington disease)、脆性X综合征(fragile X syndrome)、肌强直性营养不良(myotonic dystrophy)等神经退行性疾病均属千此类。


生物化学与分子生物学 —、多种因素通过不同机制导致DNA损伤(—)体内因素 2. DNA自身的不稳定性在DNA自发性损伤中，DNA结构自身的不稳定性是最频繁发挥作用的因素。当DNA受热或所处环境的pH发生改变时，DNA分子上连接碱基和核糖之间的糖昔键可自发发生水解，导致碱基的丢失或脱落，其中以脱嗦呤最为普遍。另外，含有氨基的碱基可能自发发生脱氨基反应，转变为另一种碱基，如C转变为U,A转变为I（次黄嗦呤）等。3.机体代谢过程中产生的活性氧机体代谢过程中产生的活性氧(reacti ve oxygen species, ROS)可以直接作用修饰碱基，如修饰鸟嗦呤，产生8-轻基脱氧鸟嗦呤等。（二）体外因素最常见的导致DNA损伤的体外因素，主要包括物理因素、化学因素和生物因素等。这些因素导致DNA损伤的机制各有其特点。1.物理因素物理因素中最常见的是电磁辐射。根据作用原理的不同，通常将电磁辐射分为电离辐射和非电离辐射。a粒子、B粒子、X射线、丫射线等，能直接或间接引起被穿透组织发生电离，损伤DNA，属电离辐射；而紫外线和波长长于紫外线的电磁辐射属非电离辐射。


生物化学与分子生物学 —、多种因素通过不同机制导致DNA损伤(—)体内因素 低波长紫外线的吸收，可使DNA分子中同一条链相邻的两个胸腺啥唗碱基(T)，以共价键连接形成胸腺瞪唗二聚体结构(TI)，也称为环丁烧型啼唗二聚体，见图13-1。另外，紫外线也可导致其他啥唗间形成类似的二聚体，如CT和CC二聚体等。二聚体的形成可使DNA产生弯曲和扭结，影响DNA的双螺旋结构，使复制与转录受阻。再者，紫外线还会导致DNA链间的其他交联或链的断裂等损伤。 脱氧尺一风鳍—N C=0 脱氧/c—N\(核糖＼栏V—d/\/核糖—N\/c=0H/\CH3日＼/'c||—N\-H UV器—N\C二／c＝0＼脱氧／』0 三 H(b)磷酸酷/H,,\C一c/—CH32.化学因素能引起DNA损伤的化学因素种类繁多，主要包括自由基、碱基类似物、碱基修饰物和嵌入染料等。值得注意的是，许多肿瘤化疗药物是通过诱导DNA损伤，包括碱基改变、单链或双链DNA断裂等，阻断DNA复制或RNA转录的，进而抑制肿瘤细胞的增殖。因此，对DNA损伤，以及后继的肿瘤细胞死亡机制的认识，将十分有助千对肿瘤化疗药物的改进。


生物化学与分子生物学 三 (1)自由基导致DNA损伤：自由基是指能够独立存在，外层轨道带有未配对电子的原子、原子团或分子。自由基的化学性质异常活跃，可引发多种化学反应，影响细胞功能。自由基的产生可以是体外因素与体内因素相互作用的结果，如电离辐射产生胫自由基(·OH)和氢自由基(H.），而生物体内的代谢过程可产生活性氧自由基。．OH具有极强的氧化性质，而H·则具有极强的还原性质。这些自由基可与DNA分子发生反应，导致碱基、核糖和磷酸基损伤，引发DNA的结构与功能异常。 物理因素和化学因素造成的DNA损伤的情况如图13-2所示。插入／只H/一尸－」＿、广HO H啥唗二聚体碱基交换碱基的碱基的如 c的形成c-u自发丢失化学修饰A-I3．苯并芘的诱变衍生物3生物因素生物因素主要指病毒和霉菌，如麻疹病毒、风疹病毒、疤疹病毒、黄曲霉、寄生曲霸等，其蛋白质表达产物或产生的毒素和代谢产物，如黄曲霉素等有诱变作用。


生物化学与分子生物学 物理因素和化学因素造成的DNA损伤的情况如图13-2所示。插入／只H/一尸－」＿、广HO H啥唗二聚体碱基交换碱基的碱基的如 黄曲霉素主要由黄曲霉产生。在湿热地区的食品和饲料中出现黄曲霉毒素的概率最高。它们存252.,第三篇遗传信息的传递在于土壤、动植物、各种坚果中，特别是容易污染花生、玉米、稻米、大豆、小麦等粮油产品，是霉菌毒素中毒性最大、对人类健康危害极为突出的一类霉菌毒素。 二、DNA损伤有多种类型 DNA分子中的碱基、核糖与磷酸二酣键均是DNA损伤因素作用的靶点。根据DNA分子结构改变的不同，DNA损伤有碱基脱落、碱基结构破坏、瞪唗二聚体形成、DNA单链或双链断裂、DNA交联等多种类型。1.缄基损伤与糖基破坏化学毒物可通过对碱基的某些基团进行修饰而改变碱基的理化性质，破坏碱基的结构。比如：O亚硝酸等可导致碱基脱氨；＠在胫自由基的攻击下，晓唗碱基易发生加成、脱氢等反应，导致碱基环破裂；＠具有氧化活性的物质可造成DNA中嗦呤或瞪唗碱基的氧化修饰，形成8轻基脱氧鸟昔或6～甲基尿啼唗等氧化代谢产物。DNA分子中的戊糖基的碳原子和轻基上的氢可能与自由基反应，由此戊糖基的正常结构被破坏。


生物化学与分子生物学 二、DNA损伤有多种类型 由千碱基损伤或糖基破坏，在DNA链上可能形成一些不稳定点，最终导致DNA链的断裂。2碱基之间发生错配如前所述，碱基类似物的掺入、碱基修饰剂的作用可改变碱基的性质，导致DNA序列中的错误配对。在正常的DNA复制过程中，存在着一定比例的自发的碱基错配发生，最常见的是组成RNA的尿密唗替代胸腺瞪唗掺入到DNA分子中。


生物化学与分子生物学 二、DNA损伤有多种类型 3. DNA链发生断裂DNA链断裂是电离辐射致DNA损伤的主要形式。某些化学毒剂也可导致DNA链断裂。戊糖环的破坏、碱基的损伤和脱落都是引起DNA断裂的原因。碱基损伤或糖基的破坏可引起DNA双螺旋局部变性，形成酶敏感性位点，特异的核酸内切酶能识别并切割这样的位点，造成DNA链断裂。DNA链上受损碱基也可以被另一种特异的DNA－糖昔酶除去，形成无嗦呤啥唗位点(ap urinic-apyrimi di ni c site, AP site)，或称无碱基位点，这些位点在内切酶等的作用下可造成DNA链的断裂。DNA断裂可以发生在单链或双链上，单链断裂能迅速在细胞中以另一条互补链为模板重新合成，完成修复；而双链断裂在原位修复的概率很小，需依赖重组修复，这种修复导致染色体畸变的可能性很大。因此，一般认为双链断裂的DNA损伤与细胞的致死性效应有直接联系。


生物化学与分子生物学 二、DNA损伤有多种类型 4. DNA链的共价交联被损伤的DNA分子中有多种DNA交联形式。DNA分子中同一条链中的两个碱基以共价键结合，称为DNA链内交联(DNA intrastrand cross-linking)。低波长紫外线照射后形成的瞪唗二聚体就是DNA链内交联的最典型的例子。DNA分子一条链上的碱基与另一条链上的碱基以共价键结合，称为链间交联(DNA interstrand cross-linking)。DNA分子还可与蛋白质以共价键结合，称为DNA－蛋白质交联(DNA protein cross-linking)。以上对各种类型的DNA损伤进行了阐述。实际上DNA损伤是相当复杂的。当DNA受到严重损伤时，在其局部范围所发生的损伤常常不止一种，而是多种类型的损伤复合存在。最常见的是碱基损伤、糖基破坏和链断裂可能同时存在。这样的损伤部位被称为局部多样性损伤部位。


生物化学与分子生物学 二、DNA损伤有多种类型 上述DNA损伤可导致DNA模板发生碱基置换、插入、缺失、链的断裂等变化，并可能影响到染色体的高级结构。就碱基置换来讲，DNA链中的一种嗦呤被另一种嗦呤取代，或一种瞪唗被另一种l密唗取代，称为转换；而嗦呤被啼唗取代或反之，则称为颠换。转换和颠换在DNA复制时可引起碱基错配，导致基因突变。碱基的插入和缺失可引起移码突变。DNA断裂可阻止RNA合成过程中链的延伸。而DNA损伤所引起的染色质结构变化也可以造成转录的异常。所有这些变化均可造成某种或某些基因信息发生异常或丢失，进而导致其表达产物的量与质的变化，对细胞的功能造成不同程度的影响。


生物化学与分子生物学 二、DNA损伤有多种类型 需要指出的是，由于密码子的简并性（第十五章），上述的碱基置换并非一定发生氨基酸编码的改变。碱基置换可以造成改变氨基酸编码的错义突变(missense mutation)、变为终止密码子的无义突变(nonsense mutation)和不改变氨基酸编码的同义突变(same sense mutation)。教科书和文献中对千错义突变用氨基酸的单字母符号和位置共同注明，如B-Raf的第600位的颌氨酸突变为谷氨酸则写为V600E，具体标示为B-RafV600E0在生命的各种活动中，生物体发生DNA损伤不可避免。这种损伤所导致的结局取决于DNA损伤的程度，以及细胞对损伤DNA的修复能力。DNA损伤修复是指纠正DNA两条单链间错配的碱基、清除DNA链上受损的碱基或糖基、恢复DNA的正常结构的过程。DNA修复(DNA repair)是机体维持DNA结构的完整性与稳定性，保证生命延续和物种稳定的重要环节。


生物化学与分子生物学 二、DNA损伤有多种类型 细胞内存在多种修复DNA损伤的途径或系统。常见的DNA损伤修复途径或系统包括，直接修复、切除修复、重组修复和损伤跨越修复等（表13-1)。值得注意的是，一种DNA损伤可通过多种途径修复，而一种修复途径也可同时参与多种DNA损伤的修复过程。 一、有些DNA损伤可以直接修复 直接修复是最简单的一种DNA损伤的修复方式。修复酶直接作用千受损的DNA，将之恢复为原来的结构。


生物化学与分子生物学 一、有些DNA损伤可以直接修复 1晇哫二聚体的直接修复瞪唗二聚体的直接修复又称为光复活修复或光复活作用。生物体内存在着一种DNA光裂合酶(DNA photolyase)，能够直接识别和结合于DNA链上的瞪唗二聚体部位。在可见光(400nm)激发下，光复活酶可将瞪唗二聚体解聚为原来的单体核昔酸形式，完成修复（图13-3)。DNA光裂合酶最初在低等生物中发现，有两个与吸收光子有关的生色基团，次甲基四氢气：了三产五＼三二霄霄合气叶酸和FADH2。次甲基四氢叶酸吸收光子后将FAD比激活，再由激活的FADH2将电子转移给瞪唗二聚体，使其还原。鸟类等高等生物虽然也存在DNA光裂合酶，但是光复活修复并不是高等生物修复啼唗二聚体的主要方式。哺乳动物细胞缺乏DNA光裂合酶。2.浣基化喊基的直接修复催化此类直接修复的酶是一类特异的烧基转移酶，可以将烧基从核背酸直接转移到自身肤链上，修复DNA的同时自身发生不可逆转的失活。比如，人类06－甲基鸟嗦呤DNA甲基转移酶，能够将06位的甲基转移到酶自身的半胱氨酸残基上，使甲基化的鸟噤呤恢复正常结构（图13-4)。


生物化学与分子生物学 一、有些DNA损伤可以直接修复 带有活性SHi基团的甲基转移酶结合在甲基化的碱基部位固IA.l日拔国1,l飞I DNA复制@同，＇且，)它DNA复制l甲基化后失活ll同包，四修复的结果的甲基转移酶突变的结果圈13-4院基化城基的直接修复3.单链断裂的直接修复DNA连接酶能够催化DNA双螺旋结构中一条链上缺口处的5'－磷酸基团与相邻片段的3'－轻基之间形成磷酸二醋键，从而直接参与DNA单链断裂的修复，如电离辐射所造成DNA单链上的切口。 二、切除修复是最普遍的DNA损伤修复方式 切除修复是生物界最普遍的一种DNA损伤修复方式。通过此修复方式，可将不正常的碱基或核昔酸除去并替换掉。依据识别损伤机制的不同，又分为碱基切除修复和核昔酸切除修复两种类型。


生物化学与分子生物学 二、切除修复是最普遍的DNA损伤修复方式 1碱基切除修复碱基切除修复(base excision repa订，BER)依赖于生物体内存在的一类特异的DNA糖昔酶。整个修复过程包括：心识别水解：DNA糖昔酶特异性识别DNA链中已受损的碱基并将其水解去除，产生一个无碱基位点；＠切除：在此位点的5'－端，无碱基位点核酸内切酶将DNA链的磷酸二酷键切开，同时去除剩余的磷酸核糖部分；＠合成：DNA聚合酶在缺口处以另一条链为模板修补合成互补序列；＠连接：由DNA连接酶将切口重新连接，使DNA恢复正常结构（图13-5)。尽抑癌蛋白p53在哺乳动物细胞中参与调控碱基切除修复。直接证据是DNA烧化剂诱导的DNA损伤，在表达野生型p53的细胞可被有效修复，而在p53缺失的细胞，其修复速度明显减慢。


生物化学与分子生物学 二、切除修复是最普遍的DNA损伤修复方式 2.核昔酸切除修复与碱基切除修复不同，核昔酸切除修复(nucleotide excision repair, NER)系统并不识别具体的损伤，而是识别损伤对DNA双螺旋结构所造成的扭曲，但修复过程与碱基切除修复相似。首先，由一个酶系统识别DNA损伤部位；其次，在损伤部位两侧切开DNA链，去除两个切口之间的一段受损的寡核昔酸；再次，在DNA聚合酶作用下，以另一条链为模板，合成一段新的DNA，填补缺损区；最后由连接酶连接，完成损伤修复。区切除修复是DNA损伤修复的一种普遍形式，它并不局限于某种特殊原因造成的损伤，而能一般«r炉』性地识别和纠正DNA链及DNA双螺旋结构的变化，修复系统能够使用相同的机制和一套修复蛋白DNA糖昔酶特异性识别并水t单核昔酸缺口解受损碱基，产生AP位点切除剩余磷酸核糖，产生缺口j声言．怕恤伽屾咖吓皿皿）


生物化学与分子生物学 核昔酸并连接彝仆仙们加国国仙叭仙仙）质去修复一系列性质各异的损伤。 遗传性着色性干皮病(xeroderma pigmentosum, XP)的发病是由于DNA损伤核昔酸切除修复系统基因缺陷所致。有关入类XP相关的核昔酸切除修复系统缺陷基因的一般情况见表13-2。此外，Cockyne综合征和人毛发低硫营养不良等疾病的遗传病因也是DNA损伤核甘酸切除修复系统基因缺陷。基因名称基因的染色编码蛋白质的编码蛋白质编码蛋白质的主要功能体定位氨基酸数细胞定位XPA9q22.3273细胞核可能结合受损的DNA，为切除修复复合体其他因子到达DNA受损部位指示方向XPB2q21782细胞核在DNA切除修复中，发挥解螺旋酶的功能XPC3p25940细胞核可能是受损DNA的识别蛋白质XPD19ql3.3760细胞核转录因子TFII H的一个亚单位，与XPB一起，在受损DNA修复中，发挥解螺旋酶的功能XPE llql2-131140细胞核主要结合受损DNA的啼唗二聚体处llpll-12427XPF16pl3.12905细胞核结构专一性DNA修复核酸内切酶，在DNA损伤切除修复中，在受损DNA的5'－端切口XPG13q331186细胞核镁依赖的单链核酸内切酶，在DNA损伤切除修复中，在受损DNA的3'－端切口人类的DNA损伤核背酸切除修复需要大约30多种蛋白质的参与。其修复过程如下：CD由损伤部位识别蛋白XPC和XPA等，再加上DNA复制所需的SSB，结合在损伤DNA的部位；(2)XPB和XPD发挥解旋酶的活性，与上述蛋白质共同作用在受损DNA周围形成一个凸起；＠XPG与XPF发生构象改变，分别在凸起的3'－端和5'－端发挥核酸内切酶活性，在增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)的帮助下，切除并释放受损的寡核昔酸；＠遗留的缺损区由DNA聚合酶8或e进行修补合成；＠由连接酶完成连接。


生物化学与分子生物学 核昔酸并连接彝仆仙们加国国仙叭仙仙）质去修复一系列性质各异的损伤。  256第三篇遗传信息的传递 核昔酸切除修复不仅能够修复整个基因组中的损伤，而且能够修复那些正在转录的基因模板链上的损伤，后者又称为转录偶联修复(transcription-coupled repair)，因此，更具积极意义。在此修复中，所不同的是由RNA聚合酶承担起识别损伤部位的任务。3.碱基错配修复错配是指非Watson-Crick碱基配对。碱基错配修复也可被看作是碱基切除修复的一种特殊形式，是维持细胞中DNA结构完整稳定的重要方式，主要负责纠正以下错误：心复制与重组中出现的碱基配对错误；＠因碱基损伤所致的碱基配对错误；＠碱基插入；＠碱基缺失。从低等生物到高等生物，均拥有保守的碱基错配修复系统或途径。


生物化学与分子生物学 256第三篇遗传信息的传递 大肠杆菌参与DNA复制中错配修复的蛋白质包括Mut(mutase)H、Mu tL,MutS、DNA解旋酶、单链DNA结合蛋白、核酸外切酶I、DNA聚合酶皿，以及DNA连接酶等l0余种蛋白质或相关酶成分，修复过程十分复杂已。修复过程中面临的主要问题是如何区分母链和子链。在细菌DNA中甲基化修饰是一个重要标志，母链是高度甲基化的，主要是其腺噤呤A发生甲基化修饰，而新合成子链中的腺嗦呤A的甲基化修饰尚未进行，这提示错配修复应在此链上进行。首先由M utS蛋白识别错配碱基，随后由MutL和MutH等蛋白质协同相应的核酸外切酶，将包含错配点在内的一小段DNA水解、切除，经修补、连接后，恢复DNA正确的碱基配对。


生物化学与分子生物学 256第三篇遗传信息的传递 继细菌错配修复机制被揭示之后，真核细胞的错配修复机制的研究，近年来也取得很大进展。现已发现多种与大肠杆菌的M utS和Mu tL高度同源的参与错配修复的蛋白质，如与大肠杆菌M u tS高度同源的人类的MSH2(M utS Homolog2)、MSH6和MSH3等。MSH2和MSH6的复合物可识别包括碱基错配、插入、缺失等DNA损伤，而由MSH2和MSH3形成的蛋白质复合物则主要识别碱基的插入与缺失。真核细胞并不像原核细胞那样以甲基化来区分母链和子链，可能是依赖修复酶与复制复合体之间的联合作用识别新合成的子链。有关入类错配修复系统成员的一般情况见表l3-3。蛋白质基因染色体cDNA全长氨基主要功能细胞组织分布名称定位全长(bp)定位酸数MLHJ3p21.32484756错配修复细胞核大肠、乳腺、肺、脾、睾丸、前列腺、甲状腺、胆袋、心肌MLH314q24.348951453错配修复细胞核广泛，尤多见于消化道上皮PMSJ2q31-333121932错配修复细胞核与MLHl组织分布一致PMS27p222859862错配修复细胞核与MLHl组织分布一致MSH22p22-213181934错配修复细胞核广泛，在肠道表达多限于隐窝MSHJ Sql1-1231871137错配修复细胞核在非小细胞肺癌和造血系统恶性肿瘤中表达减少MSH4l p313085936染色体重组细胞核睾丸、卵巢MSH56p21.32883834染色体重组细胞核广泛，尤其在睾丸、胸腺和免疫系统中高表达MSH62p1642631360错配修复细胞核_、DNA严重损伤时需要重组修复双链DNA分子中的一条链断裂，可被模板依赖的DNA修复系统修复，不会给细胞带来严重后果。然而，DNA分子的双链断裂是一种极为严重的损伤。与其他修复方式不同的是，双链断裂修复由千没有互补链可言，因此难以直接提供修复断裂所必需的互补序列信息。为此，需要另外一种更为复杂的机制，即重组修复来完成DNA双链断裂的修复。重组修复是指依靠重组酶系，将另一段未受损伤的DNA移到损伤部位，提供正确的模板，进行修复的过程。依据机制的不同，重组修复可分为同第十三卓DNA损伤和损伤修复257源重组修复和非同源末端连接重组修复。


生物化学与分子生物学 256第三篇遗传信息的传递 1.同源重组修复所谓的同源重组修复(homologous recombination repa江），指的是参加重组的两段双链DNA在相当长的范围内序列相同200bp)，这样就能保证重组后生成的新区序列正确。大肠杆菌同源重组的分子机制已比较清楚，起关键作用的是RecA蛋白，也被称作重组酶，它是一个由352个氨基酸组成的蛋白质。多个RecA单体在DNA上聚集，形成右手螺旋的核蛋白细丝，细丝中具有深的螺旋凹槽，可以识别和容纳DNA链。在ATP存在的情况下，RecA可与损伤的DNA单链区结合，使DNA伸展，同时RecA可识别一段与受损DNA序列相同的姐妹链，并使之与受损DNA链并列排列，交叉互补，并分别以结构正常的两条DNA链为模板重建损伤链。最后在其他酶的作用下，解开交叉互补连接新合成的链，完成同源重组。同源重组生成的新片段具有很高的忠实性。有关酵母同源重组的分子机制也已被研究揭示，与大肠杆菌的相似，详见图13-6。在酵母的重组修复过程中先后有Mre、Nbs、Rad50、Rad52、Rad51B、Rad51C、Racl51D、XRCC2、XRCC3和RPA等相关蛋白质或酶参与。 DNA双链断裂损伤部位i DNA末端加工,'DNA末端加工35,'XRCC2/XRCC3链交换DNA合成III'F35''l-I-I-I-l-I立重鱼l1-1 (1)由黑色与灰色线条组成的DNA双链为断裂损伤的DNA双链。(2)由深蓝色与浅蓝色线条组成的DNA双链为完好DNA双链，与断裂损伤的DNA双链序列同源。(3)上图D，两个方向的重组合成的DNA中，只有右侧的酶或相关蛋白质被标示出来。(4)上图E，虚线条框所示的四条DNA单链的交叉互补中，灰色的DNA单链与浅蓝色的DNA单链互补，后者是前者合成的模版；黑色的DNA单链与深蓝色的DNA单链互补，同样后者是前者合成的模版2非同源末端连接的重组修复非同源末端连接重组修复(non-homologous end joining recombination repair)是哺乳动物细胞DNA双链断裂的一种修复方式，顾名思义，即两段DNA链的末端不需要同源性就能相互替代连接巴。因此，非同源末端连接重组修复的DNA链的同源性不高，修复的D NA序列中可存在一定的差异。对千拥有巨大基因组的哺乳动物细胞来说，发生错误的位置可能并不在必需基因上，这样依然可以维持受损细胞的存活。非同源末端连接重组修复中起关键作用的蛋白质分子是DNA依赖的蛋白激酶(DNA-dependen t protein kinase, DNA-PK)，是一种核内的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，由一个分子量大约为465kD的催化亚基(DNA-PKcs)和一个能结合DNA游离端的杂二聚体蛋白Ku组成。DNA-PKcs的作用是介导DNA-PK的催化功能，而Ku蛋白可与双链DNA的断端连接，促进双链断裂的重接。＼il吓另一个参与非同源末端连接重组修复的重要蛋白质是XRCC4(X-ray repa订，compleme nting defective, in Chinese hams ter)，它能与DNA连接酶形成复合物，增强连接酶的活力，在DNA连接酶与组装在DNA末端的DN~-PK复合物相结合的过程中起中间体作用。非同源末端连接重组修复既是修复DNA损伤的一种方式，又可以被看作是一种生理性基因重组的策略，将原来并未连在一起的基因或片段连接产生新的组合，如B淋巴细胞、T淋巴细胞的受体基因、免疫球蛋白基因的构建与重排等。


生物化学与分子生物学 DNA双链断裂损伤部位i DNA末端加工,'DNA末端加工35,'XRCC2/XRCC3链交换DNA合成III'F35''l-I-I-I-l-I立重鱼l1-1 四、跨越损伤DNA合成是一种差错倾向性DNA损伤修复当DNA双链发生大范围的损伤，DNA损伤部位失去了模板作用，或复制叉已解开母链，致使修复系统无法通过上述方式进行有效修复，此时，细胞可以诱导一个或多个应急途径，通过跨过损伤部位先进行复制，再设法修复。而根据损伤部位跨越机制的不同，这种跨越损伤DNA的修复又被分为重组跨越损伤修复与合成跨越损伤修复两种类型。


生物化学与分子生物学 DNA双链断裂损伤部位i DNA末端加工,'DNA末端加工35,'XRCC2/XRCC3链交换DNA合成III'F35''l-I-I-I-l-I立重鱼l1-1 1.重组跨越损伤修复当DNA链的损伤较大，致使损伤链不能作为模板复制时，细胞利用同源重组的方式，将DNA模板进行重组交换，使复制能够继续下去岱。然而，在大肠杆菌中，还有某些新的机制，当复制进行到损伤部位时，DNA聚合酶皿停止移动，并从模板上脱离下来，然后在损伤部位的下游重新启动复制，从而在子链DNA上产生一个缺口。RecA重组蛋白将另一股健康母链上对应的序列重组到子链DNA的缺口处填补。通过重组跨越，解决了有损伤的DNA分子的复制问题，但其损伤并没有真正地被修复，只是转移到了另一个新合成的一个子代的DNA分子上，由细胞内其他修复系统来后继修复。


生物化学与分子生物学 DNA双链断裂损伤部位i DNA末端加工,'DNA末端加工35,'XRCC2/XRCC3链交换DNA合成III'F35''l-I-I-I-l-I立重鱼l1-1 2合成跨越损伤修复当DNA双链发生大片段、高频率的损伤时，大肠杆菌可以紧急启动应急修复系统，诱导产生新的DNA聚合酶(DNA聚合酶W或V)，替换停留在损伤位点的原来的DNA聚I_,,_1!LexA基因RecA基因可诱导基因:I一一一一一一一一一一一一一一一一一1,今今｀激令令'自水解个个个失阻遏VWWN,/1VWWM/1VWVWIM mRNALexA基因RecA基因可诱导基因图13-7sos修复中LexA-RecA操纵子的作用机制DNA损伤，RecA活化，激活LexA水解酶活性，LexA自切断，失阻遏功能操纵子被诱导合酶皿，在子链上以随机方式插入正确或错误的核昔酸使复制继续，越过损伤部位之后，这些新的DNA聚合酶完成使命后从DNA链上脱离，再由原来的DNA聚合酶皿继续复制。因为诱导产生的这些新的DNA聚合酶的活性低，识别碱基的精确度差，一般无校对功能，所以这种合成跨越损伤复制过程的出错率会大大增加，是大肠杆菌SOS反应或SOS修复的一部分。在大肠杆菌等原核细胞中，SOS修复反应是由RecA蛋白与LexA阻遏物的相互作用引发的，有近30个SOS相关基因编码蛋白质参与此修复反应。正常情况下，RecA基因以及其他的SOS相关的可诱导基因的上游，有一段共同的操纵序列(5'-CTG-NlO-CAG-3'）被LexA阻遏蛋白所阻遏，只有低水平的转录和翻译，产生少量的相应蛋白质。当DNA严重损伤时，RecA蛋白表达，激活LexA的自水解酶活性当LexA阻遏蛋白因水解从RecA基因，以及SOS相关的可诱导基因的操纵序列上解离下来后，一系列受LexA阻遏的基因得以表达，参与SOS修复活动。完成修复后，LexA阻遏蛋白重新合成，SOS相关的可诱导基因重新关闭（图13-7)。需要指出的是，SOS反应诱导的产物可参与重组修复、切除修复和错配修复等修复过程。这种修复机制因海空紧急呼救信号“SOS”而得名。此外，对于受损的DNA分子，除了启动上述诸多的修复途径，以修复损伤之外，细胞还可以通过其他的途径将损伤的后果降至最低。例如，通过DNA损伤应激反应活化的细胞周期检查点机制，延迟或阻断细胞周期进程，为损伤修复提供充足的时间，诱导修复基因转录翻译，加强损伤的修复，使细胞能够安全进入新一轮的细胞周期。与此同时，细胞还可以激活凋亡机制，诱导严重受损的细胞凋亡，在整体上维持生物体基因组的稳定。 第三节DNA损伤及其修复的意义 遗传物质稳定性的世代相传是维待物种稳定的主要因素。然而，如果遗传物质是绝对一成不变的话，自然界也就失去了进化的基础，也就不会有新的物种出现。因此，生物多样性依赖于DNA损伤与损伤修复之间的良好的动态平衡。 一、DNA损伤具有双重效应 一般认为DNA损伤是有害的；然而，就损伤的结果而言，DNA损伤具有双重效应，DNA损伤是基因突变的基础。通常，DNA损伤通常有两种生物学后果。一是给DNA带来永久性的改变，即突变，可能改变基因的编码序列或基因的调控序列。二是DNA的这些改变使得DNA不能用作复制和转录的模板，使细胞的功能出现障碍，重则死亡。从久远的生物史来看，进化是遗传物质不断突变的过程。可以说没有突变就没有如今的生物物种的多样性。当然在短暂的某一段历史时期，我们往往无法看到一个物种的自然演变，只能见到长期突变的累积结果，适者生存。因此突变是进化的分子基础。DNA突变可能只改变基因型，而不影响其表型，并表现出个体差异。目前，基因的多态性已被广泛应用于亲子鉴定、个体识别，器官移植，以及疾病易感性分析等。DNA损伤若发生在与生命活动密切相关的基因上，可能导致细胞，甚至是个体的死亡。人类常利用此性质杀死某些病原微生物。DNA突变还是某些遗传性疾病的发病基础。有遗传倾向的疾病，如高血压和糖尿病，尤其是肿瘤，均是多种基因与环境因素共同作用的结果。 二、DNA损伤修复障碍与多种疾病相关 细胞中DNA损伤的生物学后果，主要取决千DNA损伤的程度和细胞的修复能力。如果损伤得不到及时正确的修复，就可能导致细胞功能的异常。DNA碱基的损伤将可能导致遗传密码子的变化，经转录和翻译产生功能异常的RNA与蛋白质，引起细胞功能的衰退、凋亡，甚至发生恶性转化。双链DNA的断裂可通过同源或非同源重组修复途径加以修复，但非同源重组修复的忠实性差，修复过程中可能获得或丧失核昔酸，造成染色体畸形，导致严重后果。DNA交联影响染色体的高级结构，妨碍基因的正常表达，对细胞的功能同样产生影响。因此，DNA损伤与肿瘤、衰老以及免疫性疾病等多种疾病的发生有着非常密切的关联（表13-4)巴。 疾病易患肿瘤或疾病修复系统缺陷 着色性干皮病皮肤癌、黑色素瘤核昔酸切除修复遗传性非息肉性结肠癌结肠癌、卵巢癌错配修复转录偶联修复遗传性乳腺癌乳腺癌、卵巢癌同源重组修复Bloom综合征白血病、淋巴瘤非同源末端连接重组修复范科尼贫血再生障碍性贫血、白血病、生长迟缓重组跨越损伤修复Cockyne综合征视网膜萎缩、侁儒、耳聋、早衰、对UV敏感核昔酸切除修复、转录偶联修复毛发低硫营养不良毛发易断、生长迟缓核昔酸切除修复(-)DNA损伤修复系统缺陷与肿瘤先天性DNA损伤修复系统缺陷病人容易发生恶性肿瘤。肿瘤发生是DNA损伤对机体的远期效应之一。众多研究表明，DNA损伤一DNA损伤修复异常一基因突变一肿瘤发生是贯穿肿瘤发生发展的重要环节。DNA损伤可导致原癌基因的激活，也可使抑癌基因失活。癌基因与抑癌基因的表达失衡是细胞恶变的重要机制。参与DNA损伤修复的多种基因具有抑癌基因的功能，目前已发现这些基因在多种肿瘤中发生突变而失活。1993年，有研究发现，人类遗传性非息肉性结肠癌(hereditary nonpolyposis colorectal cancer, HNPCC)细胞存在错配修复与转录偶联修复缺陷，造成细胞基因组的不稳定性，进而引起调控细胞生长的基因发生突变，引发细胞恶变。在HNPCC中MLHJ和MSH2基因的突变时有发生。MLHI基因的突变形式主要有错义突变、无义突变、缺失和移码突变等。而MSH2基因的突变形式主要有移码突变、无义突变、错义突变以及缺失或插入等；其中以第622位密码子发生Cl T转换，导致脯氨酸突变为亮氨酸最为常见，结果使MSH2蛋白的功能丧失。


生物化学与分子生物学 疾病易患肿瘤或疾病修复系统缺陷 BRCA基因(breas t cancer gene)参与DNA损伤修复的启动与细胞周期的调控。BRCA基因的失活可增加细胞对辐射的敏感性，导致细胞对双链DNA断裂修复能力的下降。现已发现BRCAJ基因在70％的家族遗传性乳腺癌和卵巢癌病例中发生突变而失活。值得注意的是，DNA修复功能缺陷虽可引起肿瘤的发生，但巳癌变的细胞本身DNA修复功能往往并不低下，相反会显著升高，使得癌细胞能够充分修复化疗药物引起的DNA的损伤，这也是大多数抗癌药物不能奏效的直接原因，所以关于DNA修复的研究可为肿瘤联合化疗提供新思路。


生物化学与分子生物学 （二）DNA损伤修复缺陷与遗传性疾病 着色性干皮病(XP)病人的皮肤对阳光敏感，照射后出现红斑、水肿，继而出现色素沉着、干燥、角化过度，最终甚至会出现黑色素瘤、基底细胞癌、鳞状上皮癌及棘状上皮瘤等瘤变发生。具有不同临床表现的XP病人存在明显的遗传异质性，表现为不同程度的核酸内切酶缺乏引发的切除修复功能缺陷，所以病入的肺、胃肠道等器官在受到有害环境因素刺激时，会有较高的肿瘤发生率。然而，在对XP的进一步研究中发现，一些病入虽具有明显的临床症状，但在UV辐射后的核昔酸切除修复中却没有明显的缺陷表型，故将其定名为“XP变种“(XP variant, XPV)。这类病人的细胞在培养中表现出对UV辐射的轻微增高的敏感性，变种的切除修复功能正常，但复制后修复的功能有缺陷。最新的研究发现，某些XP变种的分子病理学机制是由它对D NA碱基损伤耐受的缺陷所致，而不是修复方面的缺陷。已共济失调毛细血管扩张症(ataxia telangiectasia, AT)是一种常染色体隐性遗传病，主要影响机体．八1，的神经系统、免疫系统与皮肤。AT病人的细胞对射线及拟辐射的化学因子，如博来霉素等敏感，具有极高的染色体自发畸变率，以及对辐射所致的DNA损伤的修复缺陷。病人的肿瘤发病率相当高。AT的发生与在DNA损伤信号转导网络中发挥关键作用的ATM分子的突变有关。此外，DNA损伤核昔酸切除修复的缺陷可以导致人毛发低硫营养不良(trichothiodystrophy, TTD)、Cockayne综合征(Cockayne syndrome,CS)和范科尼贫血(Fanconi anemia)等遗传病勹。


生物化学与分子生物学 （二）DNA损伤修复缺陷与遗传性疾病  （三）DNA损伤修复缺陷与免疫性疾病 DNA修复功能先天性缺陷病人，其免疫系统常有缺陷，主要是T淋巴细胞功能缺陷。随着年龄的增长，细胞中的DNA修复功能逐渐衰退，如果同时发生免疫监视功能的障碍，便不能及时清除癌变的突变细胞，从而导致发生肿瘤。因此，DNA损伤修复、免疫和肿瘤等均是紧密关联的。 （四）DNA损伤修复与衰老 有关DNA损伤修复能力比较研究发现，寿命长的动物如象、牛等的DNA损伤的修复能力较强；寿命短的动物如小鼠、仓鼠等的DNA损伤的修复能力较弱。人的DNA修复能力也很强，但到一定年龄后会逐渐减弱，突变细胞数与染色体畸变率相应增加。如人类常染色体隐性遗传的早老症和韦尔纳综合征病人，其体细胞极易衰老，一般早年死于心血管疾病或恶性肿瘤。 ,．n一”“m一＇小结 DNA损伤是指各种体内外因素导致的DNA组成与结构上的变化，主要有碱基或戊糖基的破坏、碱基错配、DNA单链或双链断裂、DNA链共价交联等多种表现形式。


生物化学与分子生物学 ,．n一”“m一＇小结 细胞内在因素，如DNA复制中的错配、DNA结构本身的不稳定性、机体代谢中产生的有害活性分子等，均可诱发DNA的“自发＂损伤。外环境中的物理因素（电离辐射、紫外线）、化学因素（自由基、碱基类似物、碱基修饰剂、嵌入性朵籵）和生物因素等也均可损伤DNA。DNA损伤具有双重生物学效应。各种因素诱发的DNA结构改变是生物进化的基础；同时DNA的损伤也可使细胞功能出现障碍，与多种疾病，如肿瘤等相关。细胞拥有DNA损伤修复机制，可以修复DNA链上的损伤，恢复DNA的正常结构。这一机制对于维持DNA结构的完整性与稳定性，保证生命延续和物种稳定至关重要。细胞有直接修复、切除修复、重组修复和跨越损伤修复等多种DNA损伤修复途径。一种DNA损伤可通过多种途径修复，一种修复途径也可参与多种DNA损伤的修复。DNA损伤修复的缺陷与肿瘤、衰老以及免疫性疾病等密切相关。 2. RecA蛋白是如何调节SOS的？ 3.为什么DNA的甲基化状态可以被DNA损伤修复所利用？4突变能影响高等真核生物结构基因表达的几个水平？5.假如发生了碱基对的错配，如何被有效修复？


生物化学与分子生物学 （李恩民）第十四章RNA的合成 生物体以DNA为模板合成RNA的过程称为转录(tran scrip tion)，意指将DNA的碱基序列转抄为RNA。DNA分子上的遗传信息是决定蛋白质氨基酸序列的原始模板，mRNA是蛋白质合成的直接模板。通过RNA的合成，遗传信息从染色体的贮存状态转送至细胞质，从功能上衔接DNA和蛋白质这两种生物大分子。1958年，F. Crick将上述遗传信息的传递方式归纳为中心法则(central dogma)。1970年H. Temin发现了逆转录现象，对中心法则进行了补充。在生物界，RNA合成有两种方式。一是DNA指导的RNA合成，也称转录，为生物体内的主要合成方式。转录产物除mRNA、rRNA和tRNA外，在真核细胞内还有snRNA、miRNA等非编码RNA。对RNA转录过程的调节可以导致蛋白质合成速率的改变，并由此而引发一系列细胞功能变化。因此，理解转录机制对于认识许多生物学现象和医学问题具有重要意义。mRNA在转录、转录后加工发生错误可引起细胞异常和疾病。RNA的转录合成是本章的主要内容。


生物化学与分子生物学 （李恩民）第十四章RNA的合成 另一种是RNA依赖的RNA合成(RNA-dependent RNA synthesis)，也称RNA复制(RNA replication)，由RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase)催化，常见于病毒，是逆转录病毒以外的RNA病毒在宿主细胞以病毒的单链RNA为模板合成RNA的方式，限于篇幅本章未予叙述。 第一节原核生物转录的模板和酶 RNA的生物合成属于酶促反应，反应体系中需要DNA模板、NTP（包括ATP、UTP、CTP和GTP)、DNA依赖的RNA聚合酶(DNA-dependent RNA polymerase，简称RNA pol汃其他蛋白质因子及M忙等。合成方向为5'__,3'，核昔酸间的连接方式为3',5'－磷酸二酣键。 一、原核生物转录的模板 在DNA分子双链上，一股链作为模板，按碱基配对规律指导转录生成RNA，另一股链则不转录。用核酸杂交法对模板DNA和转录产物RNA进行测定，或对DNA、RNA的碱基进行序列测定，都可证明DNA分子上的一个基因只有一股链一模板链出编码链。


生物化学与分子生物学 二、RNA聚合酶催化RNA合成(—)RNA聚合酶能从头启动RNA链的合成 RNA pol催化RNA的转录合成。该反应以DNA为模板，以ATP、GTP、UTP和CTP为原料，还需要Mg”作为辅基。RNA合成的化学机制与DNA的复制合成相似。RNA pol通过在RNA的3'-0H端加入核昔酸，延长RNA链而合成RNA。3'-0H在反应中是亲核基团，攻击所进入的核昔三磷酸的a磷酸，并释放出焦磷酸，总的反应可以表示为：（NMP)n+NTP--t(NMP)n+l+PPi。RNA pol和双链DNA结合时活性最高，但是只以双链DNA中的一股DNA链为模板。新加入的核甘酸以Watson-Crick碱基配对原则和模板的碱基互补。注意在此与DNA链中A配对的是U而不是T。前述的DNA聚合酶在启动DNA链延长时需要RNA引物存在，而RNA pol能够在转录起点处使两个核昔酸间形成磷酸二醋键，即直接启动转录（图14-2)，因而RNA链的起始合成不需要引物。


生物化学与分子生物学 令令令念RNA聚合酶（二）RNA聚合酶由多个亚基组成 大肠杆菌(E. coli)的RNA pol是目前研究得比较透彻的分子。这是一个分子量达450kD，由5种亚基a2(2个a)、B、B'、Q和6组成的六聚体蛋白质。各主要亚基及功能见表14-1。 264第三篇遗传信息的传递 核心酶(core enzyme)由凸邸'Q亚基组成。试管内的转录实验（含有模板、酶和底物NTP等）证明，核心酶能够催化NTP按模板的指引合成RNA。但合成的RNA没有固定的起始位点。加有叭sigma)亚基的酶能在特定的起始点上开始转录，可见G亚基的功能是辨认转录'ITGACA起始点。6亚基加上核心酶称为全酶(holoenzyme)。活细胞的转录起始，是需要全酶-35的。转录延长阶段则仅需核心酶。图14-3显示RNA pol全酶在转录起始区的结合。大肠杆菌内有一些不同的RNA pol全图14-3原核生物RNA聚合酶全酶及其在转录起始区酶，其差异是6亚基的不同。目前已发现多的结合DNA双链己打开，o因子尚未脱落种o亚基，并用其分子量命名区别，最常见的是句0（分子量70kD)。句0是辨认典型转录起始点的蛋白质，大肠杆菌中的绝大多数启动子可被含有句0因子的全酶所识别并激活。将细菌从通常培养的37°C升温至42屯，细菌可迅速增加一套共17种蛋白质的合成。这些蛋白质被称为热激蛋白(heat shock proteins, HSP)。当温度升至50宽，大部分蛋白质合成已停止，HSP却能继续合成。HSP的编码基因称为热激基因(Hsp)。Hsp基因的转录起点的上游序列与其他基因不同，因而需另一种6因子，即社2（分子量32kD)辨认及启动其转录。可见，社2是应答热刺激而被诱导产生的，它本身也属于一种HSP。其他原核生物的RNA pol在结构和功能上均与大肠杆菌相似。抗生素——利福平(rifampicin)可以特异抑制原核生物的RNA pol，成为抗结核菌治疗的药物。它特异性地结合RNA聚合酶的B亚基。若在转录开始后才加入利福平，仍能发挥其抑制转录的作用，这说明B亚基是在转录全过程都起作用的。


生物化学与分子生物学 264第三篇遗传信息的传递  三、RNA聚合酶结合到启动子上启动转录 对于整个基因组来讲，转录是分区段进行的。每一转录区段可视为一个转录单位，称为操纵子(operon)（见第十六章）。操纵子中包括了若干个基因的编码区及其调控序列。调控序列中的启动子(promote1)是RNA p ol结合模板DNA的部位，也是决定转录起始点的关键部位。原核生物是以RNA pol全酶结合到启动子上而启动转录的，其中由G亚基辨认启动子，其他亚基相互配合。启动子结构的阐明回答了转录从哪里起始这一问题，是转录机制研究的重要发现。为了确认RNA pol在基因组的结合位点，研究中采用了一种巧妙的方法，即RNA pol保护法国。在实验中，先将提取的DNA与提纯的RNA pol混合温育一定时间，再加入核酸外切酶进行反应。结果显示，大部分DNA链被核酸酶水解为核昔酸，但一个40-60bp的DNA片段被保留下来。这段DNA没有被水解，是因为RNA pol结合在上面，因而受到保护。受保护的DNA位于转录起始点的上游，并最终被确认为是被RNA pol辨认和紧密结合的区域，是转录起始调节区（图14-4)。


生物化学与分子生物学 三、RNA聚合酶结合到启动子上启动转录 对数百个原核生物基因操纵子转录上游区段进行的碱基序列分析，证明RNA pol保护区存在共有序列。以开始转录的5'－端第一位核昔酸位置转录起点(transcription start site, TSS；或initiator)为+l，用负数表示其上游的碱基序号，发现－35和－10区A-T配对比较集中。－35区的最大一致性序列是TTGACA。-l0区的一致性序列TATAAT，是在1975年由D. Pribnow发现的，故被称为Pribnow盒(Prib now box)。－35区与－l0区相隔16~18个核昔酸，－10区与转录起点相距6或7个核昔酸。


生物化学与分子生物学 三、RNA聚合酶结合到启动子上启动转录 A-T配对相对集中，表明该区段的DNA容易解链，因为A-T配对只有两个氢键维系。比较RNA pol结合不同区段测得的平衡常数，发现RNA pol结合在－10区比结合在－35区更为牢固。把RNA pol分子大小与DNA链长度进行比较，可确定其结合DNA链时分子的跨度。从这些结果推论出：-35区RNA聚合酶保护区结构基因终止点图14-4RNA聚合酶保护法研究转录起始区图中部为受酶保护的DNA区段放大，图最下方示－35区段和－10区段的共有序列是RNA pol对转录起始的识别序列(recognition sequence)。结合识别序列后，RNA pol向下游移动，达到Pribnow盒，与DNA形成相对稳定的RNA pol-DNA复合物，就可以开始转录。 第二节原核生物的转录过程 原核生物的转录过程可分为转录起始、转录延长和转录终止三个阶段。


生物化学与分子生物学 —、转录起始需要RNA聚合酶全酶 转录全过程均需RNA pol催化，起始过程需全酶，由G亚基辨认起始点，延长过程的核昔酸聚合仅需核心酶催化。简言之，转录起始就是RNA pol在DNA模板的转录起始区装配形成转录起始复合体，打开DNA双链，并完成第一和第二个核背酸间聚合反应的过程（动画14-1”原核生物的转录起始＂）。转录起始复合物中包含有RNA pol全酶、DNA模板以及与转录起点配对的NTPs。起始阶段的第一步是由RNA pol识别并结合启动子，形成闭合转录复合体(closed transcription comp lex)，其中的DNA仍保持完整的双链结构。原核生物需要靠RNA pol中的6亚基辨认转录起始区和转录起点。首先被辨认的DNA区段是－35区的TTGACA序列，在这一区段，酶与模板的结合松弛；接着酶移向－10区的TATAAT序列并跨过了转录起点，形成与模板的稳定结合。


生物化学与分子生物学 —、转录起始需要RNA聚合酶全酶 起始的第二步是DNA双链打开，闭合转录复合体成为开放转录复合体(open transcription complex)。开放转录复合体中DNA分子接近－10区域的部分双螺旋解开后转录开始。无论是转录起始或延长中，DNA双链解开的范围都只在17bp左右，这比复制中形成的复制叉小得多。起始的第三步是第一个磷酸二酷键的形成。转录起始不需引物，两个与模板配对的相邻核昔酸，在RNA pol催化下生成磷酸二酷键。转录起点配对生成的RNA的第一位核昔酸，也是新合成的RNA分子的5'－端，以GTP或ATP较为常见。比如，当5'－端第一位核昔酸GTP与第二位的NTP聚合生成磷酸二酣键后，仍保留其5'－端3个磷酸基团，生成聚合物是5'-pppGpN-OH-3'，其3'－端的游离经基，可以接收新的NTP并与之聚合，使RNA链延长下去。RNA链的5'－端结构在转录延长中一直保留，至转录完成。


生物化学与分子生物学 —、转录起始需要RNA聚合酶全酶 RNA合成开始时会发生流产式起始(abortiv e initiation)的现象。发生流产式起始的时候，RNA pol在完全进入延伸阶段前不从启动子上脱离，而是合成长度小千10个核昔酸的RNA分子，并将这些短片段RNA从聚合酶上释放而终止转录。这个过程可在进入转录延长阶段前重复多次，从而产生多个短片段RNA。流产式起始被认为是启动子校对(promoter proofreading)的过程，其发生可能与266第三篇遗传信息的传递RNA聚合酶和启动子的结合强度有关。当一个聚合酶成功合成一条超过10个核昔酸的RNA时，便形成一个稳定的包含有DNA模板、RNA pol和RNA片段的三重复合体，从而进入延长阶段。当RNA合成起始成功后，RNA pol离开启动子，称为启动子解脱(promoter escape)，也叫启动子清除(promoter clearance)。启动子清除发生后，转录进入延长阶段。


生物化学与分子生物学 二、RNA聚合酶核心酶独立延长RNA链 第一个磷酸二酷键生成后，转录复合体的构象发生改变，G亚基从转录起始复合物上脱落，并离开启动子，RNA合成进入延长阶段。此时，仅有RNA pol的核心酶留在DNA模板上，并沿DNA链不断前移，催化RNA链的延长。实验证明，G亚基若不脱落，RNA pol则停留在起始位置，转录不继续进行。化学计量又证明，每个原核细胞，RNA pol各亚基比例为：a:13:13':a=4000:2000:2000:600, a因子的量在细胞内明显比核心酶少。在体外进行的RNA合成实验也证明，RNA的生成量与核心酶的加入量成正比；开始转录后，产物量与6亚基加入与否无关。脱落后的6因子又可再形成另一全酶，反复使用。RNA链延长时，核心酶会沿着模板DNA不断向下游前移。聚合反应局部前方的DNA双链不断解链，合成完成后的部分又重新恢复双螺旋结构。核心酶可以覆盖40bp以上的DNA分子段落，但转录解链范围约17bp。RNA链延长过程中的解链和再聚合可视为这一17bp左右的开链区在DNA上的动态移动，其外观类似泡状，被称为“转录泡"(transcription bubble)。


生物化学与分子生物学 二、RNA聚合酶核心酶独立延长RNA链 在解链区局部（图14-5), RNA pol的核心酶催化着模板指导的RNA链延长，转录产物3'－端会有一小段暂时与模板DNA保持结合状态，形成一8bp的RNA-DNA杂合双链(hybrid duplex)。随着RNA链不断生长，5＇－端脱离模板向空泡外伸展。从化学结构看，DNA/DNA双链结构比DNA/RNA形成的杂化双链稳定。核酸的碱基之间有3种配对方式，其稳定性是：G=C>A=T>A=U。GC配对有3个氢键，是最稳定的；AT配对只在DNA双链形成；AU配对可在RNA分子或DNA/RNA杂化双链上形成，是3种配对中稳定性最低的。所以已转录完毕的局部DNA双链，就必然会复合而不再打开。根据这些道理，也就易于理解空泡为什么会形成，而转录产物又是为什么可以向外伸出了。


生物化学与分子生物学 转录泡模板链杂合双螺旋8bp转录方向 观察图14-5中的“转录泡＂局部，可概括出转录延长以下特点：心核心酶负责RNA链延长反应；(2)RNA链从5'－端向3'－端延长，新的核昔酸都是加到3'-0H上；＠对DNA模板链的阅读方向是3'－端向5'－端，合成的RNA链与之呈反向互补，即酶是沿着模板链的3'一5'方向或沿着编码链的5'一3'方向前进的；＠合成区域存在着动态变化的8bp的RNA-DNA杂合双链；＠模板DNA的双螺旋结构随着核心酶的移动发生解链和再复合的动态53变化。 三、原核生物转录延长与蛋白质的翻译同时进行 在电子显微镜下观察原核生物的转录产物，可看到像羽毛状的图形（图14-6)。正在进行翻译的核糖体进一步分析表明，在同一个DNA模板分子上，有多个转录复合体同时在进行着RNA图14-6原核生物转录和翻译同步现象示意图的合成；在新合成的mRNA链上还可观察到结合在上面的多个核糖体，即多聚核糖体。这是因为在原核生物，RNA链的转录合成尚未完成，蛋白质的合成已经将其作为模板开始进行翻译了。转录和翻译的同步进行在原核生物是较为普遍的现象，保证了转录和翻译都以高效率运行，满足它们快速增殖的需要。


生物化学与分子生物学 三、原核生物转录延长与蛋白质的翻译同时进行 四、原核生物转录终止分为依赖p因子与非依赖p因子两大类RNA pol在DNA模板上停顿下来不再前进，转录产物RNA链从转录复合物上脱落下来，就是转录终止。依据是否需要蛋白质因子的参与，原核生物的转录终止分为依赖p(Rho)因子与非依赖p因子两大类。 （一）依赖p因子的转录终止 用T4噬菌体DNA作体外转录实验，发现其转录产物比在细胞内转录出的产物要长。这一方面说明转录终止点是可以被跨越而继续转录的；还说明细胞内的某些因子有执行转录终止的功能。根据这些线索，1969年，Roberts J在T4噬菌体感染的大肠杆菌中发现了能控制转录终止的蛋白质，命名为p因子。体外转录体系中加入了p因子后，转录产物长于细胞内的现象不复存在。p因子是由相同亚基组成的六聚体蛋白质，亚基分子量为46kD。p因子能结合RNA，又以对polyC的结合力最强，但对polydC/dG组成的DNA的结合能力就低得多。在依赖p因子终止的转录中，产物RNA的3'端会依照DNA模板，产生较丰富而且有规律的C碱三三三另三三三三些了了三三五三三三三二:;;ol,图14-7依赖p因子的转录终止RNA链上条纹线处代表富含C的p因子结合区段；p因子结合RNA（图右侧部分）发挥其ATP酶及解旋酶活性（二）非依赖因子的转录终止p DNA模板上靠近转录终止处有些特殊碱基序列，转录出RNA后，RNA产物可以形成特殊的结构子的转录终止。可导致终止的转录产物的3'－端常有多个连续的U，其上游的一段特殊碱基序列又可形成鼓梩状的茎环或发夹形式的二级结构，这些结QG顷结构的形成是非依赖因子终止的信号。p如图14-8所示，RNA链延长至接近终止区时，(转录出的RNA片段随即形成茎环结构。这种二级－结构是阻止转录继续向下游推进的关键。其机制可从两方面理解：一是RNA分子形成的茎环结构可能改变RNApol的构象。注意RNApol的分子量大，它不但覆盖转录延长区，也覆盖部分3'－端新合成的3'RNA聚合酶RNA链，包括刚形成的RNA茎环结构。RNA茎环3'5'结构可影响RNApol的结构而使其构象改变，从而图14-8非依赖因子的转录终止模式p使RNAl-DNA模板的结合方式发生改变。RNApo pol不再向下游移动，于是转录停止。其二，转录复合物(RNApolDNARNA)上形成的局部RNA/--DNA杂化短链的碱基配对是不稳定的，随着RNA茎环结构的形成，RNA从DNA模板链上脱离，单链DNA复原为双链，转录泡关闭，转录终止。另外，RNA链上的多聚U也是促使RNA链从模板上脱落的重要因素。（动画14-3“非依赖因子的转录终止”)p真核生物的转录过程比原核复杂。真核生物和原核生物的RNApol种类不同，结合模板的特性不一样。原核生物RNApol可直接结合DNA模板，而真核生物RNApol需与辅因子结合后才结合模板，所以两者的转录起始过程有较大区别，转录终止也不相同。真核基因组中转录生成的RNA中有20％以上存在反义RNA(antisenseRNA)，提示某些DNA双链区域在不同的时间点两条链都可以作为来终止转录，不需要蛋白因子的协助，即非依赖p因DNA模板进行转录。另外，基因组中的基因间区也可以作为模板被转录而产生长非编码RNA等，提示真核基因组RNA生物合成是很广泛的现象。


生物化学与分子生物学 （一）依赖p因子的转录终止  一、真核生物有多种DNA依赖的RNA聚合酶 真核生物至少具有3种主要的RNA pol，分别是RNA聚合酶I(RNA pol I)、RNA聚合酶II(RNA pol II)和RNA聚合酶皿(RNA pol ill)。RNA pol I位于细胞核的核仁(nucleolus)，催化合成rRNA的前体，rRNA的前体再加工成28S、5.8S及18S rRNA。RNA pol II在核内转录生成前体mRNA，然后加工成mRNA并输送给胞质的蛋白质合成体系。mRNA是各种RNA中寿命最短、最不稳定的，需经常重新合成。在此意义上说，RNA pol II是真核生物中最活跃的RNA pol。RNA pol II也合成一些非编码RNA如长非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)微小RNA和piRNA（与Piwi蛋白相互作用的RNA)。


生物化学与分子生物学 一、真核生物有多种DNA依赖的RNA聚合酶 RNA pol皿位千核仁外，催化tRNA、5SrRNA和一些核小RNA(sma ll nuclear RNA, snRNA)的合成。真核细胞的三种RNA pol不仅在功能和理化性质上不同，而且对一种毒蘑菇含有的环八肤(cyclic octapeptide)毒素一—a－鹅膏覃碱(a-aman itine)的敏感性也不同，RNA pol I对a－鹅膏覃碱不敏感；RNA pol II对a-鹅膏覃碱十分敏感；RNA pol皿对a－鹅膏簟碱比较敏感（表14-2)。


生物化学与分子生物学 一、真核生物有多种DNA依赖的RNA聚合酶 种类I Il皿转录产物45SrRNA前体mRNA, lncRNA, piRNA, miRNA tRNA,5SrRNA,snRNA对鹅吁妞碱的反应耐受极敏感中度敏感真核生物RNA pol的结构比原核生物复杂，以上所述三种真核生物的RNA pol都有两个不同的大亚基和十几个小亚基。三种真核生物RNA pol都具有核心亚基，与大肠杆菌RNA pol的核心亚基有一些序列同源性。最大的亚基（分子质量160-220kD)和另一大亚基（分子质量128-150kD)与大肠杆菌RNA pol的B'和B亚基有一定同源性。例如，RNA pol JI由12个亚基组成，其最大的亚基称为RBPl。除核心亚基外，3种真核生物RNA pol具有数个共同小亚基。另外，每种真核生物RNA pol各自还有3~7个特有的小亚基。这些小亚基的作用还不十分清楚，但是，每一种亚基对真核生物RNApol发挥正常功能都是必需的。三种聚合酶所含亚基的比较见图14-9。


生物化学与分子生物学 大肠杆菌的核心酶亚基组成叩亘萸真核RNA聚合酶P'和p样亚基曰日门日 ◄[>CTD．叩-亡］图14-9真核生物三种RNA聚合酶的亚基◄t>三种真核RNA聚合酶(RNA pol)均含有的5啤亚基种核心亚基与原核的B、旷两个a亚基和Q令。令。令。亚基有同源性，作为比较参考，大肠杆菌RNA pol的亚基组成列在上方。图中的田和卧分别。。。代表B'和B样亚基和仁］为Q样亚共同亚基4基；O为w样亚基。三种酶都含有4种共同的口口口亚基(O、O、口和．）。另外，RNA pol I、II和皿分别含有5、3、7种独有的特异性亚基...


生物化学与分子生物学 酶特异性亚基5个3个7个 RNA pol II最大亚基的狻基末端有一段共有序列(consensus sequence)，为Tyi·-Ser-Pro-Thr-Ser-ProSer样的七肤重复序列片段，称为狻基末端结构域(carboxyl-terminal domain, CTD)。RNA pol I和RNA pol皿没有CTD。所有真核生物的RNA pol II都具有CTD，只是7个氨基酸共有序列的重复程度不同。酵母RNA pol II的CTD有27个重复共有序列，其中18个与上述7个氨基酸共有序列完全一致；哺乳动物RNA pol II的CTD有52个重复基序，其中21个与上述7个氨基酸共有序列完全一致。CTD对于维持RNA pol II的催化活性是必需的。体内外实验都证明，CTD的磷酸化在转录起始中起关键作用。当RNA pol II启动转录后，CTD的许多Ser和一些Tyr残基是处千磷酸化状态。RNA聚合酶I、II皿分别使用不同类型的启动子，分别为I类、II类和皿类启动子，其中皿类启动子又可被分为3个亚型（见第十一章）。染色体上两个相邻基因的转录方向有的是相同的，有的是不同的。双向启动子(b吐rectional promote1)是位千两个相邻且转录方向相反的基因之间的一段DNA序列（图14-10)。近年来在人类等动植物基因组中存在大量的相邻且转录方向相反的基因，被称为双向转录基因对(b吐rectional gene p扣rs),也被称之为｀头对头“基因对(head-to-head gene pairs)。当这两个相邻的＂头对头“基因转录起始位点之前导链间的距离小于1kb左右时，这段基因间DNA序列可称之为双向启动子。根据相反方向基因重叠程度的不同，双向转录基因对可分为两类：基因5'－端不重叠基因2的双向转录基因对和基因5'－端重叠的双向转录基因对。相应的双向启动子也分为两类：启动子序列重叠基因1反向链的双向启动子和启动子序列不重叠的双向启动子。<1000bp~第1类双向启动子是真正意义上的双向启动子。真核细胞内还有其他类型的DNA依赖的RNA图14-10双向启动子hp, base-pair.，碱基对聚合酶，例如RNA聚合酶N(RNA polymerase N)在植物中合成小干扰RNA(s iRNA); RNA聚合酶V(RNA polymerase V)在植物中合成的RNA与siRNA介导的异染色质形成有关。真核细胞线粒体的RNA聚合酶属于单亚基RNA聚合酶蛋白质家族，与上述RNA聚合酶在结构上非常不同，在此不详述。


生物化学与分子生物学 酶特异性亚基5个3个7个 二、顺式作用元件和转录因子在真核生物转录起始中有重要作用RNA pol II催化基因转录的过程，可以分为3个期：起始期(RNA pol II和通用转录因子形成闭合复合体）、延长期和终止期，起始期和延长期都有相关的蛋白质参与。真核生物的转录起始上游区段比原核生物多样化。转录起始时，RNA pol不直接结合模板，其起始过程比原核生物复杂。(—)与转录起始有关的顺式作用元件不同物种、不同细胞或不同的基因，转录起始点上游可以有不同的DNA序列，但这些序列都可统称为顺式作用元件(cis-acting element)，一个典型的真核生物基因上游序列示意如图14-11。顺式作用元件包括核心启动子序列、启动子上游元件(upstream promoter elements)，又叫近端启动子元件(proximal promoter elements)等近端调控元件和增强子(enhancer)等远隔序列。


生物化学与分子生物学 酶特异性亚基5个3个7个 转录起始点至上游－37bp的启动子区域是核心启动子(core promote1)区，是转录起始前复合物(prein山ation complex, PIC)的结合位点。真核生物转录起始也需要RNA pol对起始区上游DNA序列作辨认和结合，生成起始复合物。起始点上游多数有共同的TATA序列，称为Hognest盒或TATA盒(TATA box)。通常认为这就是启动子的核心序列。TATA盒的位置不像原核生物上游－35区和－10区那样典型。某些真核生物基因如管家基因(house-keeping gene)也可以没有TATA盒。许多RNA pol II识别的启动子具有保守的共有序列：位千转录起始点附近的起始子(initiator, Inr)（图14-11)。启动子上游元件是位于TATA盒上游的DNA序列，多在转录起始点上游约40~200bp的位置，比较常见的是位于－70bp至－200bp的CAAT盒和GC盒。这些元件与相应的蛋白因子结合能提高或改变转录效率。


生物化学与分子生物学 酶特异性亚基5个3个7个 增强子是能够结合特异基因调节蛋白并促进邻近或远隔特定基因表达的DNA序列。增强子距转录起始点的距离变化很大，从lOOObp到50OOObp，甚至更大，但一般作用于最近的启动子，在所控基因的上游和下游都可发挥调控作用，但以上游为主。


生物化学与分子生物学 （二）转录因子 RNA pol II启动转录时，需要一些称为转录因子(transcription factor, TF)的蛋白质，才能形成具有活性的转录复合体。能直接、间接辨认和结合转录上游区段DNA或增强子的蛋白质，统称为反式作用因子(trans-acting factor)。前缀trans－有“分子外”的意义，指的是它们从DNA分子之外影响转录过程。反式作用因子包括通用转录因子(general transcription factor)和特异转录因子。通用转录因子，有时称为基本转录因子(basal transcription factor)，是直接或间接结合RNA pol的一类转录调控因子。相应于RNA pol I、II、皿的TF，分别称为TF I、TF II、TF皿。真核生物的TF II又分为TFIIA,TFIIB等，主要的TF II的功能巳清楚，列于表14-3。所有的RNA pol II都需要通用转录因子，这些通用转录因子有TFII A、TFIIB、TFIID、TFIIE、TF II F、TFII H，在真核生物进化中高度保守。转录因子功能TFil D含TBP亚基，结合启动子的TATA盒DNA序列TFII A辅助和加强TBP与DNA的结合TF II B结合TFII D，稳定TFII D-DNA复合物；介导RNA polII的募集TFII E募集TFIIH并调节其激酶和解螺旋酶活性；结合单链DNA，稳定解链状态TFII F结合RNA Pol II并随其进入转录延长阶段，防止其与DNA的接触TFIIH解旋酶和ATPase酶活性；作为蛋白激酶参与CTD磷酸化通用转录因子TFII D不是一种单一蛋白质。它实际上是由TATA盒结合蛋白质(TATA binding protein, TBP)和8~l0个TBP相关因子(TEP-associated factor, TAF)组成的复合物。TBP结合一个lObp长度DNA片段，刚好覆盖基因的TATA盒，而TFII D则覆盖一个35bp或者更长的区域。TBP的分子量为20-40kD，而TFIID复合物的分子量大约为700kD。TBP支待基础转录但是不是诱导等所致的增强转录所必需的。而TFII D中的TAFs对诱导引起的增强转录是必要的。有时把TAFs叫做辅激活因子(co-activator)。人类细胞中至少有12种TAF。可以想象TF II D复合物中不同TAFs与TBP的结合可能结合不同启动子，这可以解释这些因子对特定启动子存在不同的亲和力和在各种启动子中的选择性活化。中介子(mediator)也是在反式作用因子和RNA pol之间的蛋白质复合体，它与某些反式作用因子相互作用，同时能够促进TF IIH对RNA pol狻基端结构域的磷酸化。有时把中介子也归类于辅激活因子。


生物化学与分子生物学 （二）转录因子 此外，还有与启动子上游元件如GC盒、CAAT盒等顺式作用元件结合的转录因子，称为上游因子(upstream factor)，如SPl结合到GC盒上，C/EBP结合到CAAT盒上。这些转录因子调节通用转录因子与TATA盒的结合、RNA pol在启动子的定位及起始复合物的形成，从而协助调节基因的转录效率。特异转录因子是在特定类型的细胞中高表达，并对一些基因的转录进行时间和空间特异性调控的转录因子（见第十六章）。与远隔调控序列如增强子等结合的转录因子是主要的特异转录因子。例如，属于特异转录因子的可诱导因子(inducible factor)是与增强子等远端调控序列结合的转录因子。它们只在某些特殊生理或病理情况下才被诱导产生的，如MyoD在肌肉细胞中高表达，HIF-1在缺氧时高表达。可诱导因子在特定的时间和组织中表达而影响转录。


生物化学与分子生物学 （二）转录因子 RNA pol II与启动子结合后启动转录，这需要多种蛋白质因子的协同作用。这通常包括：可诱导霄因子或上游因子与增强子或启动子上游元件的结合；辅激活因子和（或）中介子在可诱导因子、上游因子与通用转录因子RNA pol II复合物之间起中介和桥梁作用；通用转录因子和RNA pol II在启动子处组装成转录起始前复合物。因子和因子之间互相辨认、结合，以准确地控制基因是否转录、何时转录。表14-4列出了识别、结合II类启动子的四类转录因子及其功能。应该指出的是，上游因子和可诱导因子等在广义上也称为转录因子，但一般不冠以TF的词头而各有自己特殊的名称。


生物化学与分子生物学 （二）转录因子 通用机制结合部位具体组分功能通用转录因子TBP结合TATA盒TBP,TF II A、B、E、G、F和H转录定位和起始辅激活因子TAF和中介子在聚合酶和转录因子间起中介上游因子启动子上游元件SPl、ATF、CTF等协助基本转录因子可诱导因子增强子等元件MyoD、HIF-1等时空特异性地调控转录真核生物RNA pol不与DNA分子直接结合，而需依靠众多的转录因子。首先是TF II D的TBP亚基结合TATA，另一TF II D亚基TAF有多种，在不同基因或不同状态转录时，不同的TAF与TBP进行搭配。在TFIIA和IIB的促进和配合下，形成II D-II A-II B-DNA复合体（图14-12)。


生物化学与分子生物学 （二）转录因子 具有转录活性的闭合复合体形成过程中，先由TBP结合启动子的TATA盒，这时DNA发生弯曲，然后TF II B与TBP结合，TF II B也能与TATA盒上游邻近的DNA结合。TF II A不是必需的，其存在时能稳定巳与DNA结合的TF II D-TBP复合体，并且在TBP与不具有特征序列的启动子结合时（这种结合比较弱）发挥重要作用。TFII B可以结合RNA pol II。TF II B-TBP复合体再与由RNA pol II和TFII F组成的复合体结合。TFII F的作用是通过和RNA pol II一起与TF II B相互作用，降低RNA polII晶 tTBP（或TFIID和I或TFII A)DNA品tTFIIB tTFIIF-RNA聚合酶II II与DNA的非特异部位的结合，来协助RNA pol II靶向结合启动子。最后是TF II E和TF II H加入，形成闭合复合体，装配完成，这就是转录起始前复合物（动画14-4“真核生物转录起始前复合物形成”)。


生物化学与分子生物学 tTBP（或TFIID和I或TFII A)DNA品tTFIIB tTFIIF-RNA聚合酶II TFII H具有解旋酶(helicase)活性，能使转录起始点附近的DNA双螺旋解开，使闭合复合体成为开放复合体启动转录。TFil H还具有激酶活性，它的一个亚基能使RNA pol II的CTD磷酸化。还有一种使CTD磷酸化的蛋白质是周期蛋白依赖性激酶9(cycl in-dependent kinase9, CDK9)，是正性转录延长因子(positive transcription elongation factor, P-TEFh)复合体的组成部分，对RNA pol II的活性起正性调节作用。CTD磷酸化能使开放复合体的构象发生改变，启动转录。这时TFIID、TFIIA和TF II B等就会脱离转录起始前复合物。当合成一段含有30个左右核昔酸的RNA时，TFIIE和TFII H释放，RNA pol II进入转录延长期（图14-12)。在延长阶段，TFII F仍然结合RNA pol II，防止其与DNA的结合。CTD磷酸化在转录延长期也很重要，而且影响转录后加工过程中转录复合体和参与加工的酶之间的相互作用。


生物化学与分子生物学 tTBP（或TFIID和I或TFII A)DNA品tTFIIB tTFIIF-RNA聚合酶II （四）少数几个反式作用因子的搭配启动特定基因的转录上述的是典型而有代表性的RNA pol II催化的转录起始。RNA pol I、RNA pol皿的转录起始与此大致相似。不同基因转录特性的研究已广泛开展，并发现数以百计、数量还在不断增加的转录因子。人类编码蛋白质的基因估计有2万个左右，为了保证转录的准确性，不同基因的转录起始需要不同的转录因子来参与，这是可理解的。转录因子是蛋白质，也需要基因为它们编码。一般认为，数个反式作用因子（主要是可诱导因子和上游因子等转录因子）之间互相作用，再与基本转录因子、RNA pol搭配而有针对性地结合、转录相应的基因。可诱导因子和上游因子常常通过辅激活因子或中介子与基本转录因子、RNA pol结合，但有时可不通过它们而直接与基本转录因子、RNA pol结合。转录因子的相互辨认结合，恰如儿童玩具七巧板那样，搭配得当就能拼出多种不同的图形。人类基因虽数以万计，但需要的转录因子可能几百个就能满足表达不同类型基因的需要。目前不少实验都支持这一理论。用生物信息学估算人类细胞中大约有2000种编码DNA结合蛋白的基因，约占基因总数的10%。其中大部分可能是反式作用因子。 三、真核生物RNA转录延长过程不与翻译同步 真核生物转录延长过程与原核生物大致相似，但因有核膜相隔，没有转录与翻译同步的现象。真核生物基因组DNA在双螺旋结构的基础上，与多种组蛋白组成核小体(nucleosome)高级结构。RNA pol前移处处都遇上核小体。RNA聚合酶(500kD,14nm x13nm)和核小体组蛋白核小体八聚体(300kD,6nmx16nm)大小差别不(a)太大。转录延长可以观察到核小体移位和解聚现象。用含核小体结构的DNA片段作模板，在酶、底物存在及合适反应条件下进行转录，能够观察到核小体移位。在试管内(in vitro)转录实验中以(b)DNA酶对DNA进行水解，从DNA电泳图像观察到约200bp及其倍数的阶梯形电泳条带。这种阶梯形电泳条带证明了(c)核小体在转录过程中存在，提示转录过程中核小体只是发生了移位（图14-13)。图14-13真核生物转录延长中的核小体移位但在培养细胞的体内(in vivo)转录实验(a)RNA聚合酶前移将遇到核小体；（b）原来绕在组蛋白上的中观察到，组蛋白中含量丰富的精氨酸DNA解聚及弯曲；（c）一个区段转录完毕，核小体移位发生了乙酰化，该修饰降低正电荷。核小体组蛋白与DNA的结合是靠碱性氨基酸提供正电荷和核昔酸磷酸根上的负电荷来维系的。据此推论：核小体在转录过程中可能发生一时性解聚并重新装配。


生物化学与分子生物学 三、真核生物RNA转录延长过程不与翻译同步  四、真核生物的转录终止和加尾修饰同时进行 真核生物的转录终止，是和转录后修饰密切相关的（动画14-5“真核生物转录终止＂）。真核生物mRNA有多聚腺昔酸[poly(A)］尾巴结构，是转录后才加进去的，因为在模板链上没有相应的多聚胸甘酸(poly dT)。转录不是在poly(A)的位置上终止，而是超出数百个乃至上千个核甘酸后才停止。已发现在可读框的下游，常有一组共同序列AATAAA，再下游还有相当多的GT序列。这些序列称为转录终止的修饰点（图14-14)。 初知/3'加工切切Cuc RNA pol Il修饰点 m-RNA核酸酶-AAUAAA-Poly(A)5'解旋酶i B 停顿`_气放C 转录越过修饰点后，前体mRNA在修饰点处被切断，随即加入poly(A)尾及5'－帽子结构。下游的RNA虽继续转录，但很快被RNA酶降解。因此有理由相信，帽子结构是保护RNA免受降解的，因为修饰点以后的转录产物无帽子结构，很快被降解。


生物化学与分子生物学 停顿`_气放C RNA pol缺乏具有校读(proofreading)功能的3'一5'核酸外切酶活性，因此转录发生的错误率比复制发生的错误率高，大约是十万分之一到万分之一。因为对大多数基因而言，一个基因可以转录产生许多RNA拷贝，而且RNA最终是要被降解和替代的，所以转录产生错误RNA对细胞的影响远比复制产生错误DNA对细胞的影响小。 第四节真核生物前体RNA的加工和降解 真核生物转录生成的RNA分子是前体RNA(pre-RNA)，也称为初级RNA转录物(primary RNA transcript)，几乎所有的初级RNA转录物都要经过加工，才能成为具有功能的成熟的RNA。加工主要在细胞核中进行。一、真核前体mRNA经首、尾修饰、剪接和编辑加工后才能成熟真核生物前体mRNA合成后，需要进行5'－端和3'－端（首、尾部）的修饰以及对前体mRNA进行剪接(splicing)，才能成为成熟的mRNA，被转运到核糖体，指导蛋白质翻译。


生物化学与分子生物学 (—)前体mRNA在5'－端加入“帽＇＇结构 前体mRNA(precursor mRNA)也称为初级mRNA转录物(primary mRNA transcript)或核不均一RNA(heterogeneous nuclear RNA, hnRNA)。大多数真核mRNA的5'－端有7－甲基鸟噤呤的帽结构。RNA pol JI催化合成的新生RNA在长度达25~30个核昔酸时，其5'－端的核昔酸就与7－甲基鸟嗦呤核背通过不常见的5',5'－三磷酸连接键相连（图14-15)。 。｀逞九1碱基1卢三千。干—05oIPIO$~帽2帽结构加帽过程磷酸酶j＼去除y磷酸基团 pp5'NpNp鸟昔酸转移酶lcGTP5'－5'三磷酸键形成


生物化学与分子生物学 鸟嗦呤N-7甲基转移酶!G7位上的甲基2'-0核糖甲基转移酶』靡谥＄言声盓 图14-15真核mRNA的5'－帽结构及加帽过程图中示新加上的第一个G的N-7位甲基化（称为帽l)；甲基化也可以发生在第二位核昔酸上（帽2)；第三位核昔酸的C-2'上也可以发生甲基化加帽过程由加帽酶(capping enzyme)和甲基转移酶(methyltransferase)催化完成。加帽酶有两个亚基。在添加帽结构的过程中，此酶与RNA pol II的CTD结合在一起，其氨基端部分具有磷酸酶活性，其作用是去除新生RNA的5'－端核昔酸的丫－磷酸；其狻基端部分具有mRNA鸟昔酸转移酶活性，将一个GTP分子中的GMP部分和新生RNA的5'端结合，形成5',5'－三磷酸结构；然后由S－腺昔甲硫氨酸先后提供甲基，使加上去的GMP中鸟嗦呤的N7和原新生RNA的5'－端核昔酸的核糖2'-0甲基巨化这两步甲基化反应由不同的甲基转移酶，即鸟嗦呤N-7甲基转移酶和2'-0核糖甲基转移酶进行催化的（图14-15)（动画14-6“帽子结构的修饰”)。


生物化学与分子生物学 鸟嗦呤N-7甲基转移酶!G7位上的甲基2'-0核糖甲基转移酶』靡谥＄言声盓 5'帽结构可以使mRNA免遭核酸酶的攻击，也能与帽结合蛋白质复合体(cap-binding complex of protein)结合，并参与mRNA和核糖体的结合，启动蛋白质的生物合成。（二）前体mRNA在3'－端特异位点断裂并加上多聚腺昔酸尾真核mRNA，除了组蛋白的mRNA，在3'－端都有多聚腺昔酸[poly(A)］尾结构，约含80~250个腺。


生物化学与分子生物学 276第三篇遗传信息的传递 昔酸。大多数已研究过的基因中，都没有3'－端相应的多聚胸背酸序列，说明poly(A)尾的出现是不依赖千DNA模板的。5'J I3'转录最初生成的前体mRNA3'端长千成熟CPSFi前体mRNA的mRNA。因此认为，加入poly(A)之前，先由核酸内切酶切去前体mRNA3'端的一些核昔酸，然后加入poly(A)。前体mRNA F IPCF II csl F\v,上的断裂点也是聚腺甘酸化(polyadenylation)的起始点，断裂点的上游l0~30nt有c sF AAUAAA信号序列，断裂点的下游20~40nt有富含G和U的序列，前者是特异序列，后者是非特异序列。在前体mRNA上PAPi CStF也发现poly(A)尾巴，推测这一过程也应在核内完成，而且先千mRNA中段的剪接。尾部修饰是和转录终止同时进行的过程。一般认为poly(A)的长度与mRNA的寿命呈正相关。随着poly(A)缩短，以该尸mRNA作为模板的翻译活性下降。因此推测，poly(A)的有无与长短与维持mRNA本身稳定性和mRNA作为翻译模板的活性高度相关。一般真核生物在细胞质内出现的PAP"CStF mRNA，其poly(A)长度在100~200个核昔ATP慢速多腺昔酸化酸之间，也有少数例外，如组蛋白基因的转PP+•CF I CF11CStF颐录产物，无论是初级的或成熟的，都没有前体mRNA分子的断裂和加poly(A)PABPlli尾是多步骤过程（图14-16)。断裂和聚腺PABP11昔酸化特异性因子(cleavage and polyadenylation specificity factor, CPSF)是由4条不同的多肤组成的蛋白质，分子质量为360kD。A:：霍巳：酸化CPSF先与AAUAAA信号序列形成不稳定的复合体，然后至少有3种蛋白质－~断裂激动因子(cleavage stimulato1-y factor,图14-16真核mRNA3'－多聚腺苦酸化过程CStF)、断裂因子I(cleavage factor I, CF CPSF，断裂和聚腺昔酸化特异性因子；CF，断裂因子I(cleavage factor); CStF，断裂激动因子；PAP，多聚腺昔酸聚I)、断裂因子Il(CF Il)与CPSF-RNA复合酶；PABPII，多聚腺昔酸结合蛋白II合体结合。CStF与断裂点的下游富含G和U的序列相互作用能使形成的多蛋白复合体稳定。最后在前体mRNA分子断裂之前，多聚腺昔酸聚合酶[poly(A)polymerase, PAP]加入到多蛋白质复合体，前体mRNA在断裂点断裂后，立即在断裂产生的游离3'-0H进行多聚腺昔酸化。在加入大约前12个腺昔酸时，速度较慢，随后快速加入腺昔酸，完成多聚腺昔酸化。多聚腺昔酸化的快速期有一种多聚腺昔酸结合蛋白Il[poly(A)binding protein n，简称PABP Il或PAB Il，与细胞质里的腺背酸结合蛋白PABP不同］参与，PABPil和慢速期合成的多聚腺昔酸结合，提高多聚腺昔酸聚合酶合成多聚腺昔酸的速度。PABPil的另一个功能是：当多聚腺昔酸尾结构达足够长时，使多聚腺昔酸聚合酶停止作用。


生物化学与分子生物学 276第三篇遗传信息的传递  （三）前体mRNA的剪接主要是去除内含子 正如第十一章所述，真核基因结构最突出的特点是其不连续性，即：如果将成熟的mRNA分子序列与其基因序列比较，可以发现并不是全部的基因序列都保留在成熟的mRNA分子中，有一些区段被去除了，因此真核基因又称为断裂基因。实际上，在细胞核内出现的初级转录物的分子量往往比在胞质内出现的成熟mRNA大几倍，甚至数十倍。核酸序列分析证明，mRNA来自前体mRNA，而前体mRNA和DNA模板链可以完全配对。前体mRNA中被剪接去除的核酸序列为内含子的序列，而最终出现在成熟mRNA分子中、作为模板指导蛋白质翻译的序列为外显子序列。去除初级转录物上的内含子，把外显子连接为成熟RNA的过程称为mRNA剪接。以鸡的卵清蛋白基因为例说明mRNA剪接：卵清蛋白基因全长为7.7kb，有8个外显子和7个内含子（图14-17)。图中蓝色并用数字表示的部分是外显子（其中外显子1又被称为前导序列）；用字母表示的白色部分是内含子。初级转录物即前体mRNA是和相应的基因等长的，说明内含子也存在于初级转录物中。成熟的mRNA分子长度约为1.2kb，编码386个氨基酸。


生物化学与分子生物学 i转录 (a)卵清蛋白基因结构；（b）转录初级产物，也称为前体mRNA或杂化核RNA(hnRNA);(c)前体mRNA的首、尾修饰；（d）剪接过程中套索RNA的形成；（e）细胞质中出现的mRNA，套索已去除。图上方为成熟mRNA与DNA模板链杂交的电镜所见示意图，虚线代表mRNA，实线为1.内含子形成套索RNA被剪除剪接首先涉及套索RNA(lariat RNA)的形成，即内含子区段弯曲，使相邻的两个外显子互相靠近而利千剪接。2.内含子在剪接接口处剪除从前体rnRNA一级结构分析及特性的研究，目前对剪接已有较深了解。前体mRNA含有可被剪接体所识别的特殊序列，其内含子两端存在一定的序列保守性。内含子含有5'－剪接位点(5'-splice site)、剪接分支点(branch point)和3'－剪接位点(3'-splice site)。大多数内含子都以GU为5'－端的起始序列，而其末端则为AG-OH-3'。5'-GU···…AG-OH-3'称为剪接接口(spl icing junction)或边界序列。


生物化学与分子生物学 278第三篇遗传信息的传递 3剪接过程需两次转酷反应图14-18中可见，外显子1和外显子2之间的内含子因与剪接体结合而弯曲，内含子5'－端与内含子中的剪接分支点和内含子3'－端互相靠近。第一次转酣反应是由位于内含子分支点的腺嗦呤核昔酸的2'-0H作为亲核基团攻击连接外显子l与内含子之间的3',5'磷酸二酷键，使外显子1与内含子之间的键断裂，外显子l的3'-0H游离出来。此时套索状的内含子与外显子2仍然相连。第二次转酷反应由外显子1的3'-0H对内含子和外显子2之间的磷酸二酣键进行亲核攻击，使内含子与外显子2断开，由外显子1取代了套索状内含子。这样，两个外显子被连接起来而内含子则被以套索状的形式切除掉。在这两步反应中磷酸酷键的数目并没有改变，因此也没有能量的消耗。


生物化学与分子生物学 /．一一、｝第一次转酣反应吨勹—A:pi第二次转酣反应 图14-18剪接过程的二次转酷反应虚线箭头示由核糖的3'-0H对磷酸二酷键的亲核攻击4.剪接体是内含子剪接场所前体mRNA的剪接发生在剪接体(spliceosome)，因此这类内含子称为剪接体内含子。剪接体是一种超大分子(supramolecule)复合体，由5种核小RNA(snRNA)和100种以上的蛋白质装配而成。其中的snRNA被分别称为Ul、U2、U4、U5和U6，其长度范围在100~300个核昔酸，分子中的碱基以尿啼唗含量最为丰富，因而以U作分类命名。每一种snRNA分别与多种蛋白质结合，形成5种核小核糖核蛋白(small nuclear ribonucleoprotein, snRNP)颗粒。从酵母到入类，真核生物的snRNP中的RNA和蛋白质都高度保守。各种snRNP在内含子剪接过程中先后结合到前体mRNA上，使内含子形成套索并拉近上、下游外显子。剪接体的装配需要ATP提供能量。


生物化学与分子生物学 /．一一、｝第一次转酣反应吨勹—A:pi第二次转酣反应 剪接体的形成步骤如图14-19所示：O内含子5'－端和分支点分别与Ul、U2的snRNA结合，使snRNP结合在内含子上。＠U4、U5和U6加入，形成完整的剪接体。此时内含子发生弯曲而形成套索状。上、下游的外显子1和外显子2靠近。＠结构调整，释放Ul和U4。U2和U6形成催化中心，发生第一次转酷反应。此时内含子发生弯曲而形成套索状。随后发生第二次转酷反应，内含子被以套索状切除，外显子1和外显子2被连接在一起。snRNA是以snRNP的形式参与剪切体的组装的，但剪接体中起催化作用的是其中所含的RNA组分。近期的研究证明结合金属离子的U6催化剪接反应。称为可变剪接(alternative splicing)，又称选择性剪接。(a)也就是说，这些真核生物前体mRNA分子的加工可能具有2个以上 的加多聚腺甘酸的断裂和多聚腺昔酸化 (b)的位点，因而可采取剪切（图14-20a)或（和）可变剪接（图14-20b)形成不同的mRNA。可变剪接提高了有限的基因数目的利用率，是增加生物蛋白质多样性的机制之一。


生物化学与分子生物学 的加多聚腺甘酸的断裂和多聚腺昔酸化 例如，免疫球蛋白重链基因的前体mRNA分子有几个加多聚腺昔酸的断裂和多聚腺昔酸化的位点，通过多聚腺昔酸位点选择机制，经过剪切产生免疫球蛋白重链的多样性；果蝇发育过程中的不同阶段会产生3种不同形式的肌球蛋白重链，这是由于同一肌球蛋白重链的前体mRNA分子通过选择性剪接机制，产生3(c)种不同形式的mRNA。同一种前体第一次mRNA分子在大鼠甲状腺产生降钙素转酣反(calciton i n)，而在大鼠脑产生降钙素－基因相关肤(calcitonin-gene related peptide, CGRP)，是由千两种机制都参与了加工过程（图14-21)。


生物化学与分子生物学 第二次（四）mRNA编辑是对基因的编码转酣反应2I+序列进行转录后加工}有些基因的蛋白质产物的氨基酸序 列与基因的初级转录物序列并不完全对固14-19snRNP与前体mRNA结合成为剪接体应，mR NA上的一些序列在转录后发生了(a)Ul、U2分别结合内含子5'－端和分支点；（b)U4、U5、U6加入改变，称为RNA编辑(RNA editing)。形成完整剪接体，外显子l和外显子2接近；（c)U2、U6形成催化中心，经两次转酷反应将内含子以套索状切除，将外显子1和例如，人类基因组上只有1个载脂外显子2连接。snRNA以snRNP的形式参与剪切体的组装蛋白B(apolipoprotein B, ApoB)的基因，转录后发生RNA编辑，编码产生的apoB蛋白却有2种，一种是apoBlOO，由4536个氨基酸残基构成，在肝细胞合成；另一种是apoB48，含2152个氨基酸残基，由小肠黏膜细胞合成。这两种apoB都是由ApoB基因产生的mRNA编码的，然而小肠黏膜细胞存在一种胞啼唗核昔脱氨酶(cytosine deaminase)，能将ApoB基因转录生成的mRNA的第2153位氨基酸的密码子CAA（编码Gln)中的C转变为U，使其变成终止密码子UAA,因此apoB48的mRNA翻译在第2153个密码子处终止（图14-22)。


生物化学与分子生物学 第二次（四）mRNA编辑是对基因的编码转酣反应2I+序列进行转录后加工}有些基因的蛋白质产物的氨基酸序 又如，脑细胞谷氨酸受体(GluR)是一种重要的离子通道。编码GluR的mRNA在转录后还可发生脱氨基使A转变为G，导致一个关键位点上的谷氨酰胺密码子CAG变为CGG（精氨酸），含精氨酸的GluR不能使Ca2＋通过。这样，不同功能的脑细胞就可以选择地产生不同的受体。入类基因组计划执行中曾估计入类基因总数在5万～10万甚至10万以上。测序完成后，现在认为入类只有约l.9万个编码蛋白质的基因。RNA编辑作用说明，基因的编码序列经过转录后加工，是可有多用途分化的，因此也称为分化加工(differe ntial RNA processing)。 280第三篇遗传信息的传递 (a)多（聚）A位点(b)S'剪接位点3'剪接位点多（聚）A位点 芦勿丿 AI｝校：：．帽结构帽结构！剪切及多（聚）腺昔酸化A1位点的剪切及A2位点的剪切及多（聚）腺昔酸化多（聚）腺昔酸化劓I I IIIIl圈圈斟滚滚沁跻件－AAA(A).


生物化学与分子生物学 外显子1外显子2外显子3 卢AAA(A).影饥勿瞿酗暑－AAA(A).趴II IIIII贮瓣i杂。牛AAA(A). IJilllllill旯狩抖－AAA(A).外显子1外显子1外显子2外显子1外显子2外显子3外显子1外显子3成熟的mRNA成熟的mRNA图14-20真核细胞基因的前体mRNA交替加工的两种机制--AAA(A). 修佩眉蹦：：仆－AAA(A).成熟的mRNA仆成熟的mRNA}-AAA(A)n 降钙素图14-21大鼠降钙素基因转录本的可变剪接CGRP：降钙素基因相关蛋白人肝细胞5'一一厄玉卫］C卫卫］厄卫卫］区互卫］肛玉工i仄卫忑］从U A|lCA A脰卫工邯:瓦卫］肛玉卫］肛玉工压＇(apoBlOO)-Gln-Leu-Gln-Thr-Tyr-Met-Ile-Gln-Phe-Asp-Gln-Yyr人肠上皮细胞－－－匝卫卫］厄卫卫］匝工互l仄互卫］匝卫卫］区卫玉］区卫卫］肛工玉］肛卫卫］匝五卫］贮玉忑］厄玉卫］


生物化学与分子生物学 修佩眉蹦：：仆－AAA(A).成熟的mRNA仆成熟的mRNA}-AAA(A)n (apoB48)-Gln-Leu-Gln-Thr-Tyr-Met-Ile-Stop氨基酸残基数214621482150215221542156二、真核前体rRNA经过剪切形成不同类别的rRNA真核细胞的rRNA基因(rDNA)属于冗余基因(redundant gene)族的DNA序列，即染色体上一些相似或完全一样的纵列串联基因(tandem gene)单位的重复。属于冗余基因族的还有5S rRNA基因、组蛋白基因、免疫球蛋白基因等。不同物种基因组可有数百或上千个rDNA，每个基因又被不能转录的基因间隔(gene spacer)分段隔开。可转录片段大小为7~13kb，间隔区也有若干kb大小。这些基因间隔不是内含子。rDNA位千核仁内，每个基因各自为一个转录单位。


生物化学与分子生物学 修佩眉蹦：：仆－AAA(A).成熟的mRNA仆成熟的mRNA}-AAA(A)n 真核生物基因组的rRNA基因中，18S、5.8S和28S rRNA基因是串联在一起的，转录后产生45S的转录产物。45S rRNA是3种rRNA的前身。45S rRNA在核仁小RNA(small nucleolar RNA, snoRNA)以及多种蛋白质分子组成的核仁小核糖核蛋白(small nucleolar ribonucleoprotein, snoRNP)的介导下经历了2'-0-核糖甲基化等化学修饰，这些修饰可能与其后续的加工、折叠和组装后的核糖体功能有关。45S rRNA经过某些核糖核酸内切酶和核糖核酸外切酶的剪切，去除内含子等序列，而产生成熟的18S、5.8S及28S的rRNA（图14-23)。


生物化学与分子生物学 45S rRNA一一一…....剪切18S rRNA5.8S+28S rRNA剪切18S rRNA5.8S rRNA28S rRNA貂雪内含子………．基因间隔圈14-23真核前体rRNA转录后的剪切 rRNA成熟后，就在核仁上装配，与核糖体蛋白质一起形成核糖体，输送到胞质。生长中的细胞，其rRNA较稳定；静止状态的细胞，其rRNA的寿命较短。 三、真核前体tRNA的加工包括核苦酸的碱基修饰 真核生物的大多数细胞有40~50种不同的tRNA分子。编码tRNA的基因在基因组内都有多个拷贝。前体tRNA分子需要多种转录后加工才能成为成熟的tRNA。


生物化学与分子生物学 三、真核前体tRNA的加工包括核苦酸的碱基修饰 以酵母前体tRNAT“分子为例，加工主要包括以下变化：心酵母前体tRNATy,分子5'－端的16个核昔酸前导序列由核糖核酸酶P(RNase P)切除，核糖核酸酶P属千核酶(Ribozyme)。核酶是具有催化功能的RNA。＠氨基酸臂的3'－端2个U被核糖核酸内切酶RNase Z切除，有时核糖核酸外切酶RNase D等也参与切除过程，然后氨基酸臂的3'－端再由核昔酸转移酶加上特有的CCA末端。＠茎环结构中的一些核昔酸碱基经化学修饰为稀有碱基，包括某些嗦呤甲基化生成甲基嗦呤、某些尿晓唗还原为二氢尿啼唗(DHU)、尿啼唗核昔转变为假尿啼唗核昔（中汃某些腺昔酸脱氨成为次黄嗦呤核昔酸(I)等。＠通过剪接切除茎－环结构中部14个核昔酸的内含子。内含子剪切由tRNA剪接内切酶(tRNA-splicing endonuclease, TSEN)完成。切除后的连接反应由tRNA连接酶催化。前体tRNA分子必须折叠成特殊的二级结构，剪接反应才能发生，内含子一般都位于前体tRNA分子的反密码子环（图14-24)。


生物化学与分子生物学 c连图1424前体RNA的剪接t三厂酶接四、RNA催化—些内含子的自剪接 1982年，美国科学家T. Cech和他的同事发现四膜虫编码rRNA前体的DNA序列含有间隔内含子序列，他们在体外用从细菌纯化得到的RNA pol转录从四膜虫纯化的编码rRNA前体的DNA，发现在没有任何来自四膜虫的蛋白质情况下，rRNA前体能准确地剪接去除内含子。这种由RNA分子催化自身内含子剪接的反应称为自剪接(self-splicing)。随后，在其他原核生物以及真核生物的线粒体、叶绿体的rRNA前体加工中，亦证实了这种剪接。这些自身剪接内含子的RNA具有催化功能，属千核酶。一些噬菌体的前体mRNA及细菌tRNA前体也发现有这类自身剪接的内含子，并被称之为组I型内含子(group I intron)。组I型内含子以游离的鸟噤呤核昔或鸟嗦呤核昔酸作为辅因子完成剪接。鸟嗦呤核昔或鸟嗦呤核昔酸的3'-0H与内含子的5'－磷酸共同参与转酕反应，切除的内含子是线状。


生物化学与分子生物学 c连图1424前体RNA的剪接t三厂酶接四、RNA催化—些内含子的自剪接 许多生物中还存在组Il型内含子(group ITin tron)。组Il型内含子是另一类独特的、能起催化作用的RNA，其RNA能催化内含子的自剪接。组Il型内含子不如组I型内含子更普遍。这两类内含子有一个共同的特性，就是在体外(in vitro)能够自我剪接，而不需要任何蛋白质酶的催化。但是在体内(in vivo)它们却都需要蛋白质帮助折叠成二级结构。组Il型内含子与组I型内含子的内部保守序列和折叠结构不同。另外，组Il型内含子通过产生一个套索状中间体来进行自剪接，而组I型内含子则不形成套索状中间体（图14-25)。组Il型内含子的剪接与前面介绍的前体mRNA的剪接都形成套索状结构，但是前者没有剪接体参与（图14-25)。与上面三种内含子不同的是，真核细胞tRNA和古菌tRNA的内含子属于tRNA内含子。这些tRNA中位于内部的内含子是由蛋白质催化来进行剪接的，参与的酶是tRNA剪切内切酶和tRNA连接酶。因此，现在发现至少存在有4种类型的内含子，它们分别是组I型内含子、组Il型内含子、剪接体内含子和tRNA内含子。


生物化学与分子生物学 c连图1424前体RNA的剪接t三厂酶接四、RNA催化—些内含子的自剪接 需要指出的是，剪接和剪切等RNA转录后加工在原核生物细胞内的前体rRNA、前体tRNA等非编码RNA中普遍存在，但是，原核生物细胞内没有剪接体，其编码蛋白质的mRNA没有内含子，不进行剪接等转录后加工，也不进行5'－末端＂帽”结构和3'－端多聚腺昔酸尾的添加。 五、真核RNA在细胞内的降解有多种途径 真核细胞的mRNA降解途径可分为两类：正常转录物的降解和异常转录物的降解。正常转录物(a)棘于脱腺昔的mRNA降解(b)非依赖于脱腺昔的mRNA降解脱腺昔酸化酶I'一AAAA脱帽酶2戒G了爵厅尸＝梦立—=＝＝士。


生物化学与分子生物学 外切体 53'外切酶图14-26正常mRNA的降解途径m7G一l.:．一=..AAAA—l-m7G-,＇l.，一气，,，占',l...l-AAAA—m7c一一气豆劂(c)核酸内切酶介导的mRNA降解外切体:;:|5'一3'降解It~rn7r.t<?-1m7G脱帽酶l么宜一，才———沁AAAA;—清道夫型脱帽酶PMRl、MRP)5'->3'外切酶核糖体核糖体UPFl磷酸化AUG，翻译起始点；UPF，无义转录物调节因子EJC，外显子拼接复合体；PTC，提前终止密码子；. NMD诱导 蛋白质翻译产物正常转录产物，无提前终止密码子. EJC被核糖体替无NMD激活2/mRNA进行剪接加工时，异常的剪接反应会在可读框架内产生无义的终止密码子，常称作提前终止密码子(premature translational-termination codon, PTC)。PTC也可由错误转录或翻译过程中的移码而产生。无义介导的mRNA降解(nonsense-mediated mRNA decay, NMD)是一种广泛存在于真核生物细胞中的mRNA质量监控机制。该机制通过识别和降解含有PTC的转录产物防止有潜在毒性的截短蛋白的产生（图14-27)。外显子拼接复合体(exon-junction complex, EJC)是诱导无义介导的mRNA降解的重要因子。EJC通常位于外显子和外显子拼接点的上游附近，在翻译过程中，结合在mRNA上的EJC会随着核糖体在mRNA上的滑动而被逐一移除（图14-27)。如果在外显子－外显子的拼接点之前出现PTC，核糖体会被从mRNA上提前释放，这时PTC下游的EJC仍然保留在mRNA上，EJC结合的一些蛋白质如UPF3（无义转录物调节因子3)等诱导UPF l的磷酸化。磷酸化的UPFl募集脱帽酶Dcpla和外切酶Xrn l等，对mRNA进行降解。许多遗传性疾病是由出现PTC而引起的。


生物化学与分子生物学 NMD诱导 除无义介导的mRNA降解外，异常转录物尚有无终止密码子引起的mRNA降解(non-stop decay, NSD降解）和非正常停滞引起的mRNA降解(no-go decay, NGD降解）及核糖体延伸介导的降解(1ibo some extension-mediated decay, REMD)等，不详述。 小结 一一·尸啊·一维生素是人体内不能合成或合成量甚少，必须由食物供给的一类小分子有机化合物。维生素在调节人体物质代谢、促进生长发育和维持生理功能等方面发挥重要作用，是人体的重要营养素之一。人体对维生素的日需要量极少，但如果长期缺乏，可致维生素缺乏症；而摄入过多，可引发维生素中毒。按溶解特性可将维生素分为脂溶性维生素和水溶性维生素两大类，前者包括维生素A、维生素D、维生素E和维生素K，后者包括B族维生素（维生素Bl、维生素B2、维生素PP、维生素B6、维生素B12、生物素、泛酸和叶酸）和维生素C。


生物化学与分子生物学 小结 维生素A的活性形式为视黄醇、视黄酪和视黄酸，其作用包括：心构成视紫红质，参与视觉传导；＠调控基因表达和细胞生长与分化；＠抗氧化作用；＠抗癌作用。维生素A缺乏可致“夜盲症”或者“眼干燥症”，长期过量摄入可中毒。维生素D的活性形式是1,25-(OH)2-D3，具有调节钙、磷代谢和细胞分化的作用。维生素D缺乏可导致儿童侚倭病，成人软骨病和骨质疏松症。维生素E的活性形式为a－生育酚，其作用包括抗氧化、调节基因表达以及促进血红素合成。维生素K有促疑血作用，并参与骨代谢，缺乏时易出血。B族维生素通常以酶辅因子形式参与和调节物质代谢。维生素B l（硫胺素）的活性形式为焦磷酸硫胺素(TPP)，是脱狻酶和转酮醇酶的辅酶。维生素Bl缺乏可引起脚气病。维生素B2（核黄素）的活性形式是FMN及FAD，两者是体内氧化还原酶的辅基，作为递氢体参与糖、氨基酸和脂肪酸等的氧化过程。维生素队缺乏可引起口角炎等症状。维生素PP（烟酸、烟酰胺）的活性形式为NAD十和NADP十，两者是不需氧脱氢酶的辅酶，起传递氢的作用。维生素PP缺乏可引起瘢皮病。泛酸（遍多酸）的活性形式是辅酶A(CoA)及酰基载体蛋白(ACP)，是多种酰基转移酶的辅酶。生物素（维生素B7)是天然的活性形式，作为狻化酶的辅基，参与CO2固定过程。维生素B6（抗皮炎维生素）的活性形式为磷酸咄哆酪和磷酸咄哆胺，是氨基转移酶和氨基酸脱狻酶的辅酶，也是ALA合酶的辅酶，参与血红素的生成。维生素B6缺乏可造成低血色素小细胞性贫血以及皮炎，而摄入过量可致中毒。叶酸（蝶酰谷氨酸）的活性形式是FH4,FH4作为一碳单位转移酶的辅酶，是携带和传递一碳单位的载体。维生素B12（钻胺素）是唯一含全属元素的维生素，其活性形式是甲钻胺素和5'－脱氧腺符钻胺素，是N5-CH3-F凡转甲基酶的辅酶，参与甲硫氨酸循环。叶酸或者维生素B12缺乏可造成巨幼细胞贫血以及高同型半胱氨酸血症。维生素C(L－抗坏血酸）是天然的生物活性形式。维生素C参与苯丙氨酸与胆汁酸代谢、胶原合成过程中的多种径化反应；维生素C可作为抗氧化剂，也可增强机体免疫力。维生素C缺乏可致坏血病。


生物化学与分子生物学 小结  286第三篇遗传信息的传递第十五章蛋白质的合成 蛋白质具有多种生物学功能，参与生命的几乎所有过程，是生命活动的物质基础。通常一个细胞在某一特定时刻，其生存及活动约需数千种结构蛋白质和功能蛋白质的参与。蛋白质具有高度的种属特异性，不同种属间蛋白质不能互相替代，因此各种生物的蛋白质均由机体自身合成。蛋白质由基因编码，是遗传信息表达的主要终产物。mRNA带有蛋白质合成的编码信息，是蛋白质合成的模板。蛋白质在机体内的合成过程，实际上就是遗传信息从DNA经mRNA传递到蛋白质的过程，此时mRNA分子中的遗传信息被具体地翻译成蛋白质的氨基酸排列顺序，因此这一过程也被形象地称为翻译(translation)。从低等生物细菌到高等哺乳动物，蛋白质合成机制高度保守。新合成的蛋白质多肤链通常并不具备生物学活性，需经过各种修饰、加工并折叠为正确构象，然后靶向运输至合适的亚细胞部位才能行使其功能。


生物化学与分子生物学 第一节蛋白质合成体系 蛋白质生物合成是细胞最为复杂的活动之一。参与细胞内蛋白质生物合成的物质除原料氨基酸外，还需要mRNA作为模板，tRNA作为特异的氨基酸＂搬运工具”，核糖体作为蛋白质合成的装配场所，有关的酶与蛋白质因子参与反应，并且需要ATP或GTP提供能量。 —、mRNA是蛋白质合成的模板 mRNA的发现回答了细胞核内基因组的遗传信息如何编码蛋白质这一重要间题。由DNA转录而来的mRNA在细胞质内作为蛋白质合成的模板，mRNA编码区（可读框）中的核昔酸序列作为遗传密码(genetic code)，在蛋白质合成过程中被翻译为蛋白质的氨基酸序列。


生物化学与分子生物学 —、mRNA是蛋白质合成的模板 mRNA分子中核昔酸序列的翻译以3个相邻核昔酸为单位进行。在mRNA的可读框区域，每3个相邻的核昔酸为一组，编码一种氨基酸或肤链合成的起始／终止信息，称为密码子(codon)，又称三联体密码(tripl et code)。例如，UUU是苯丙氨酸的密码子，UCU是丝氨酸的密码子，GCA是丙氨酸的密码子。构成mRNA的4种核昔酸经排列组合可产生64个密码子，其中的61个编码20种在蛋白质合成中作为原料的氨基酸，另有3个(UAA、UAG、UGA)不编码任何氨基酸，而是作为肤链合成的终止密码子(termination codon)。需要注意的是，AUG具有特殊性，不仅代表甲硫氨酸，如果位于mRNA的翻译起始部位，它还代表肤链合成的起始密码子(initiation codon)（表15-1)。


生物化学与分子生物学 遗传密码具有以下几个重要特点岱： 1方向性组成密码子的核昔酸在mRNA中的排列具有方向性。翻译时的阅读方向只能从5'至3'，即从mRNA的起始密码子AUG开始，按5'-+3'的方向逐一阅读，直至终止密码子。mRNA可读框中从5'－端到3'－端排列的核背酸顺序决定了肤链中从N－端到C－端的氨基酸排列顺序（图15-1a)。2连续性mRNA中密码子之间没有间隔核节酸，即从起始密码子开始，密码子被连续阅读，直至终止密码子出现。因密码子具有连续性，若可读框中插入或缺失了非3的倍数的核昔酸，将会引起mRNA可读框发生移动，称为移码(frame s hift)。移码导致后续氨基酸编码序列改变，使得其编码的蛋白质彻底丧失或改变原有功能，称为移码突变(frameshift mutation)（图15-lb)。若连续插入或缺失3个核昔酸，则只会在多肤链产物中增加或缺失l个氨基酸残基，但不会导致可读框移位。 288第三篇遗传信息的传递第1个核旮酸第2个核旮酸(5'－端）u c A Gu第3个核旮酸(3'－端）


生物化学与分子生物学 288第三篇遗传信息的传递第1个核旮酸第2个核旮酸(5'－端）u c A Gu第3个核旮酸(3'－端） 苯丙氨酸丝氨酸酪氨酸半胱氨酸UCAGUCAGUCAGUCAG苯丙氨酸丝氨酸酪氨酸半胱氨酸亮氨酸丝氨酸终止密码子终止密码子亮氨酸丝氨酸终止密码子色氨酸亮氨酸脯氨酸组氨酸精氨酸亮氨酸脯氨酸组氨酸精氨酸亮氨酸脯氨酸谷氨酰胺精氨酸亮氨酸脯氨酸谷氨酰胺精氨酸异亮氨酸苏氨酸天冬酰胺丝氨酸异亮氨酸苏氨酸天冬酰胺丝氨酸异亮氨酸苏氨酸赖氨酸精氨酸．甲硫氨酸苏氨酸赖氨酸精氨酸缅氨酸丙氨酸天冬氨酸甘氨酸缅氨酸丙氨酸天冬氨酸甘氨酸缅氨酸丙氨酸谷氨酸甘氨酸颌氨酸丙氨酸谷氨酸甘氨酸．位千mRNA起始部位的AUG为肤链合成的起始信号。作为起始信号的AUG具有特殊性，在原核生物中代表甲酰甲硫氨酸，在真核生物中代表甲硫氨酸mRNA5'1A勹1c1G「丁勹1c I I I I I I|「勹1u n3'U G A C U UGCGAUU C C A GA匕飞户...JL六广...J L六广....J L__,.,-J三匕匕匕六广4多肤链Met—Gly—Leu Asn—Ala—Ile—-Pro（终止密码）


生物化学与分子生物学 (b)读码方向/插入的核昔酸5'3 I卢；；』』上；UI GCCAUG L-v_JL-v_仁六广_J"-y--1L六广.....JL六厂」匕匕多肤链Met-Gly—Leu-Thr一Cy_s一Asp--Ala-Met(a)氨基酸的排列顺序对应于mRNA中密码子的排列顺序；（b）核昔酸插入导致移码突变3.简并性64个密码子中有61个编码氨基酸，而氨基酸只有20种，因此有的氨基酸可由多个密码子编码，这种现象称为简并性(degeneracy)。例如，UUU和UUC都是苯丙氨酸的密码子，UCU、UCC、UCA、UCG、AGU和AGC都是丝氨酸的密码子。为同一种氨基酸编码的各密码子称为简并性密码子，也称同义密码子。多数情况下，同义密码子的前两位碱基相同，仅第三位碱基有差异，即密码子的特异性主要由前两位核昔酸决定，如苏氨酸的密码子是ACU、ACC、ACA、ACG。这意味着密码子第三位核昔酸的改变往往不改变其编码的氨基酸，合成的蛋白质具有相同的一级结构。因此，遗传密码的简并性可减少基因突变所带来的生物学效应。4.摆动性密码子通过与tRNA的反密码子配对而发挥翻译作用，但这种配对有时并不严格遵循Watson-Crick碱基配对原则，出现摆动(wobble)。此时mRNA密码子的第1位和第2位碱基(5'-+3'）与？记tRNA反密码子的第3位和第2位碱基(5'一3'）之间仍为Watson-Crick配对，而反密码子的第1位碱基与密码子的第3位碱基配对有时存在摆动现象。例异亮氨酸一5'如，反密码子第1位碱基为次黄嗦呤(inosine, I),3'可与密码子第3位的A、C或U配对；反密码子第1位的U可与密码子第3位的A或G配对；反密tRNA,反密码环码子第1位的G可与密码子第3位的C或U配对摆动位点（图15-2)。由此可见，密码子的摆动性能使一种tRNA识别1nRNA中的多种简并性密码子。mRNA5.通用性遗传密码具有通用性(umveI'Sal)'5'密码子3'即从低等生物如细菌到人类都使用着同一套遗传图15-2反密码子与密码子的识别方式与密码，这为地球上的生物来自同一起源的进化论提摆动配对供了有力证据，另外也使得利用细菌等生物来制造人类蛋白质成为可能。但遗传密码的通用性并不是绝对的，也有少数例外。例如，在哺乳类动物线粒体内，UGA除了代表终止信号，也代表色氨酸；AUA不再代表异亮氨酸，而是作为甲硫氨酸的密码子。


生物化学与分子生物学 (b)读码方向/插入的核昔酸5'3 I卢；；』』上；UI  二、tRNA是氨基酸和密码子之间的特异连接物 作为蛋白质合成原料的20种氨基酸，翻译时由其各自特定的tRNA负责转运至核糖体。tRNA通过其特异的反密码子与mRNA上的密码子相互配对，将其携带的氨基酸在核糖体上准确对号入座。虽然已发现的tRNA多达数十种，一种氨基酸通常与多种tRNA特异结合（与密码子的简并性相适应），但是一种tRNA只能转运一种特定的氨基酸。通常在tRNA的右上角标注氨基酸的三字母符号，以代表其特异转运的氨基酸，如tRNAr“表示这是一种特异转运酪氨酸的tRNA。tRNA上有两个重要的功能部位：一个是氨基酸结合部位，另一个是mRNA结合部位。与氨基酸结合的部位是tRNA的氨基酸臂的－CCA末端的腺昔酸3'-0H；与mRNA结合的部位是tRNA反密码环中的反密码子。参与肤链合成的氨基酸需要与相应tRNA结合，形成各种氨酰－tRNA(am inoacyltRNA)，再运载至核糖体，通过其反密码子与mRNA中对应的密码子互补结合（图15-2)，从而按照mRNA的密码子顺序依次加入氨基酸。


生物化学与分子生物学 三、核糖体是蛋白质合成的场所 合成肤链时mRNA与tRNA的相互识别、肤键形成、肤链延长等过程全部在核糖体上完成。核糖体类似千一个移动的多肤链＂装配厂＂，沿着模板mRNA链从5'端向3'端移动。在此期间携带着各种氨基酸的tRNA分子依据密码子与反密码子配对关系快速进出其中为延长肤链提供氨基酸原料（动画15-1"30S小亚氨酰－tRNA基－tRNA”)。肤链合成完毕，核糖体立刻离开mRNA分子。原核生物和真核生物的核糖体上均存在A位、P位和E位这3个重要的功能部位。A位结合氨酰－tRNA，称氨酰位(am in oacyl site); P位结合肤酰－tRNA,称肤酰位(peptidy l site); E位释放已经卸载了氨基核糖体移动方向>酸的tRNA，称排出位(exit site)（图15图15-3核糖体在翻译中的功能部位3)。


生物化学与分子生物学 290第三篇遗传信息的传递四、蛋白质合成需要多种酶类和蛋白质因子 蛋白质合成需要由ATP或GTP供能，需要Mg气肤酰转移酶、氨酰－tRNA合成酶等多种分子参与反应。此外，起始、延长及终止各阶段还需要多种因子参与：心起始因子(initiation factor, IF)，原核生物和真核生物的起始因子分别以IF和eIF表示；＠延长因子(elongation factor, EF)，原核生物与真核生物的延长因子分别以EF和eEF表示；＠终止因子(termination factor)，又称释放因子(release factor, RF)，原核生物与真核生物的释放因子分别以RF和eRF表示。各类因子的种类及其生物学功能见表15-2（原核生物）及表15-3（真核生物）。


生物化学与分子生物学 种类生物学功能 起始因子IFl占据核糖体A位，防止tRNA过早结合于A位IF2促进fMe t-tRNA仆ie'与小亚基结合IF3防止大、小亚基过早结合；增强P位结合fMet-tRNA仆ic'的特异性延长因子EF-Tu促进氨酰－tRNA进入A位，结合并分解GTP EF-Ts EF-Tu的调节亚基EF-G有转位酶活性，促进mRNA－肤酰－tRNA由A位移至P位释放因子RFl特异识别终止密码UAA或UAG；诱导肤酰转移酶转变为酷酶RF2特异识别终止密码UAA或UGA；诱导肤酰转移酶转变为酷酶RF3具有GTPase活性当新合成肤链从核糖体释放后，促进RF l或RF2与核糖体分离起始因子eIFl结合于小亚基的E位，促进eIF2-tRNA-GTP复合物与小亚基相互作用eIFl A原核IFl的同源物，防止tRNA过早结合千A位eIF2具有GTPase活性，促进起始Me t-tRNAM"与小亚基结合eIF2B,eIF3最先与小亚基结合的起始因子；促进后续步骤的进行eIF4A eIF4F复合物成分，具有RNA解旋酶活性，解开mRNA二级结构，使其与小亚基结合eIF4B结合mRNA，促进mRNA扫描定位起始密码AUG eIF4E eIF4F复合物成分，结合于mRNA的5'－帽结构eIF4G eIF4F复合物成分，结合eIF4E和poly(A)结合蛋白质(PABP)eIF4F包含eIF4A、eIF4E、e IF4G的复合物eIF5促进各种起始因子从小亚基解离，从而使大、小亚基结合eIF5B具有GTPase活性，促进各种起始因子从小亚基解离，从而使大、小亚基结合延长因子eEFlot与原核EF-Tu功能相似eEFl衍与原核EF-Ts功能相似eEF2与原核EF-G功能相似释放因子eRF识别所有终止密码子参与肤链合成的氨基酸需要与相应tRNA结合，形成各种氨酰－tRNA。该过程是由氨酰－tRNA合成酶(aminoacyl-tRNA synthetase)所催化的耗能反应。氨基酸与特异的tRNA结合形成氨酰－tRNA的过程称为氨基酸的活化。


生物化学与分子生物学 种类生物学功能  —、氨酰tRNA合成酶识别特定氨基酸和tRNA mRNA密码子与tRNA反密码子间的识别主要由tRNA决定，而与氨基酸无关，＂搭错车＂的氨基酸仍将依据tRNA的种类进入多肤链导致合成出错。因此氨基酸与tRNA连接的准确性是正确合成蛋白质的关键。氨基酸与tRNA连接的准确性由氨酰－tRNA合成酶决定，该酶对底物氨基酸和tRNA都有高度特异性。目前发现氨酰－tRNA合成酶至少有23种，分别与组成蛋白质的各种氨基酸一一对应，并能准确识别相应的tRNA。在组成蛋白质的常见20种氨基酸中，除了赖氨酸有两种氨酰－t凡NA合成酶与其对应，其他氨基酸各自对应一种氨酰－tRNA合成酶，另外还有识别磷酸化丝氨酸和咄咯酪氨酸的氨酰－tRNA合成酶。


生物化学与分子生物学 —、氨酰tRNA合成酶识别特定氨基酸和tRNA 每个氨基酸活化为氨酰－tRNA时需消耗2个来自ATP的高能磷酸键，其总反应式如下：氨基酸＋tRNA+ATP氨酰－tRNA合成酶，氨酰－tRNA+AMP+PPi氨酰－tRNA合成酶所催化反应的主要步骤包括：心氨酰－tRNA合成酶催化ATP分解为焦磷酸与AMP;(2)AMP、酶、氨基酸三者结合为中间复合体（氨酰－AMP－酶），其中氨基酸的狻基与磷酸腺昔的磷酸以酐键相连而活化；＠活化氨基酸与tRNA3'-CCA末端的腺昔酸的核糖2'或3'位的游离轻基以酕键结合，形成相应的氨酰－tRNA，腺昔一磷酸(AMP)以游离形式被释放出来（图15-4)包。 氨酰AMP勹尸上了氨酰－tRNA氨酰－t RNA合成 巳经结合了不同氨基酸的氨酰－t RNA用前缀氨基酸三字母代号表示，如Tyr-tRNAT“代表tRNATyr的氨基酸臂上已经结合有酪氨酸。氨酰－tRNA合成酶还有校对活性(proofreading activity)，能将错误结合的氨基酸水解释放，再换上正确的氨基酸，以改正合成过程出现的错配，从而保证氨基酸和tRNA结合反应的误差小于10-4包。


生物化学与分子生物学 二、肤链合成的起始需要特殊的起始氨酰－tRNA 从遗传密码表中可见（表15-1)，编码甲硫氨酸的密码子在原核生物与真核生物中同时又作为起始密码子。目前已知，尽管都携带着甲硫氨酸，但结合在起始密码子处的氨酰－tRNA，与结合可读框内部甲硫氨酸密码子的氨酰－tRNA在结构上是有差别的包。结合于起始密码子的属于专门的起始氨酰－tRNA，在原核生物为fMet-tRNA™•'，其中的甲硫氨酸被甲酰化，成为N－甲酰甲硫氨酸(N-formyl methionine, fMet)；在真核生物，具有起始功能的是tRNA,Met(initiator tRNA)，它与甲硫氨酸结合后，可以在mRNA的起始密码子AUG处就位，参与形成翻译起始复合物。Met-tRNA;Me'和Met-tRNAMe'可分别被起始或延长过程起催化作用的酶和蛋白质因子识别。\J,{i}翻译过程包括起始(in山ation)、延长(elongation)和终止(termination)三个阶段。真核生物的肤链合成过程与原核生物的肤链合成过程基本相似，只是反应更复杂、涉及的蛋白质因子更多。


生物化学与分子生物学 —、翻译起始复合物的装配启动脓链合成 翻译的起始是指mRNA、起始氨酰－tRNA分别与核糖体结合而形成翻译起始复合物(translationinitiation complex)的过程。（一）原核生物翻译起始复合物的形成原核生物翻译起始复合物的形成需要30S小亚基、mRNA、fMet-tRNA™"'和sos大亚基，还需要3种IF、GTP和Mg2＋包。其主要步骤如下：1.核糖体大小亚基分离完整核糖体在IF的帮助下，大、小亚基解离，为结合rnRNA和fMet tRNA仆如做好准备。IF的作用是稳定大、小亚基的分离状态，如没有IF存在，大、小亚基极易重新聚合。


生物化学与分子生物学 —、翻译起始复合物的装配启动脓链合成 2. mRNA与核糖体小亚基结合小亚基与mRNA结合时，可准确识别可读框的起始密码子AUG，而不会结合内部的AUG，从而正确地翻译出所编码蛋白质。保证这一结合准确性的机制是：mRNA起始密码子AUG上游存在一段被称为核糖体结合位点(ribosome-binding site, RBS)的序列。该序列距AUG上游约10个核昔酸处通常为－AGGAGG-（也称Shine-Dalgarno序列，S-D序列），可被16S rRNA通过碱基互补而精确识别，从而将核糖体小亚基准确定位于mRNA（图15-5)。 3'末端人令...卿一-一···一 5'-G A U U C C U lliilliilillili U U G A C C U正正召贮匝mRNA上的S-D序列起始密码子3. fMeHRNAfMel结合在核糖体P位fMet-tRNA仆1e'与结合了GTP的IF2一起，识别并结合对应于小亚基P位的mRNA的AUG处。此时，A位被IFl占据，不与任何氨酰－tRNA结合。


生物化学与分子生物学 3'末端人令...卿一-一···一 4.翻译起始复合物形成结合千IF2的GTP被水解，释放的能量促使3种IF释放，大亚基与结合了mRNA、fMet-tRNA file'的小亚基结合，形成由完整核糖体、mRNA、fMet-tRNAfMe'组成的翻译起始复合物。如前所述，核糖体上存在着A位、P位和E位这三个重要的功能部位。在肤链合成过程中，新的氨酰－tRNA首先进入A位，形成肤键后移至P位。但是在翻译起始复合物装配时，结合起始密码子的fMet-tRNA仆1et是直接结合于核糖体的P位，A位空留，且对应于AUG后的密码子，为下一个氨酰－tRNA的进入及肤链延长做好准备。原核生物翻译起始复合物的装配见图15-6。


生物化学与分子生物学 （二）真核生物翻译起始复合物的形成 真核生物翻译起始复合物的装配所需起始因子的种类更多，其装配过程更复杂，且mRNA的5'帽和3'－多聚(A)尾均为正确起始所必需。此外，起始氨酰－tRNA先千mRNA结合于小亚基，与原核生物的装配顺序不同苍。其主要步骤如下：1.43S前起始复合物的形成多种起始因子与核糖体小亚基结合，其中eIFlA和eIF3与原核起始因子IFl和IF3功能相似，可阻止tRNA结合A位，并防止大亚基和小亚基过早结合。eIFl结合于1iL E位，GTP-elF2与起始氨酰-tRNA结合，随后eIF5和elF5B加入，形成43S的前起始复合物。 言 [ 码口忑294第三篇遗传信息的传递扫描定位起始密/核糖体小亚基3'核糖体大亚基43S前起始5'复合物糖体释放。GTP-EF-Tu又可循环生成。 核糖体对氨酰－tRNA的进位有校正作用。肤链生物合成以很高速度进行，延长阶段的每一过程都有时限。在此时限内，只有正确的氨酰－tRNA能迅速发生反密码子－密码子互补配对而进入A位。反之，错误的氨酰－tRNA因反密码子－密码子不能配对结合而从A位解离。这是维待肤链生物合成的高度保真性的机制之一。


生物化学与分子生物学 码口忑294第三篇遗传信息的传递扫描定位起始密/核糖体小亚基3'核糖体大亚基43S前起始5'复合物糖体释放。GTP-EF-Tu又可循环生成。 2成肤指核糖体A位和P位上的tRNA所携带的氨基酸缩合成肤的过程。在起始复合物中，P位上起始tRNA所携带的甲酰甲硫氨酸与A位上新进位的氨酰tRNA的a－氨基缩合形成二肤。第一个肤键形成后，二肤酰-tRNA占据核糖体A位，而卸载了氨基酸的tRNA仍在P位。成肤(peptide bond formation)过程由肤酰转移酶(peptidyl transferase)催化，该酶的化学本质不是蛋白质，而是RNA,在原核生物为23S rRNA，在真核生物为28S rRNA。因此肤酰转移酶属于一种核酶(ribozyme)。


生物化学与分子生物学 码口忑294第三篇遗传信息的传递扫描定位起始密/核糖体小亚基3'核糖体大亚基43S前起始5'复合物糖体释放。GTP-EF-Tu又可循环生成。 3转位成肤反应后，核糖体需要向mRNA的3'－端移动一个密码子的距离，方可阅读下一个密码子，此过程为转位(translocation)。核糖体的转位需要延长因子EF-G（即转位酶），并需要GTP水解供能。转位的结果是：心P位上的tRNA所携带的氨基酸或肤在成肤后交给A位上的氨基酸，P位上卸载的tRNA转位后进入E位，然后从核糖体脱落；＠成肤后位千A位的肤酰－tRNA移动到P位；＠A位得以空出，且准确定位在mRNA的下一个密码子，以接受下一个氨酰－tRNA进位。 肤链延长过程的三步反应如图15-8所示。


生物化学与分子生物学 肤链延长过程的三步反应如图15-8所示。 经过第二轮进位—成肤一转位，P位出现三肤酰－tRNA,A位空留并对应于第四个氨酰－tRNA进位。重复此过程，则有四肤酰-tRNA、五肤酰－tRNA等陆续出现千核糖体P位，A位空留，接受下一个氨酰－tRNA进位。这样，核糖体从mRNA的5'－端向3'－端顺序阅读密码子，进位、成肤和转位三步反应吓已循环进行，每循环一次向肤链C端添加一个氨基酸残基，肤链由N－端向C-端逐渐延长。 进位｝成肤转位 真核生物的肤链延长机制与原核生物基本相同，但亦有差异，如两者所需延长因子不同，真核生物需要eEFla、eEFl阳和eEF2这三类延长因子，其功能分别对应于原核生物的EF-Tu、EF-Ts和EFG。此外，在真核生物，一个新的氨酰－tRNA进入A位后会产生别构效应，致使空载tRNA从E位排出。在肤链延长阶段，每生成一个肤键，都需要水解2分子GTP（进位与转位各1分子）获取能量，即消耗2个高能磷酸键。若出现不正确氨基酸进入肤链，也需要消耗能量来水解清除；此外，氨基酸活化为氨酰－tRNA时需消耗2个高能磷酸键。因此，在蛋白质合成过程中，每生成1个肤键，至少需消耗4个高能磷酸键。


生物化学与分子生物学 三、终止密码子和释放因子导致肤链合成终止 肤链上每增加一个氨基酸残基，就需要经过一次进位、成肤和转位反应。如此往复，直到核糖体的A位与mRNA的终止密码子对应。终止密码子不被任何氨酰－tRNA识别，只有释放因子RF能识别终止密码子而进入A位，这一识别过程需要水解GTP。RF的结合可触发核糖体构象改变，将肤酰转移酶转变为酷酶，水解P位上肤酰tRNA中肤链与tRNA之间的酷键，新生肤链随之释放，mRNA、tRNA及RF从核糖体脱离，核糖体大小亚基分离包。mRNA模板、各种蛋白质因子及其他组分都可被重新利用。原核生物有3种RF。RFl特异识别UAA或UAG,RF2特异识别UAA或UGA，且两者均可诱导肤酰转移酶转变为酣酶。RF3具有GTPase活性，当新生肤链从核糖体释放后，促进RFl或RF2与核糖体分离。真核生物仅有一种释放因子eRF,3种终止密码子均可被其识别。


生物化学与分子生物学 三、终止密码子和释放因子导致肤链合成终止 无论在原核细胞还是真核细胞内，1条mRNA模板链上都可附着10~100个核糖体。这些核糖体依次结合起始密码子并沿mRNA5'一3'方向移动，同时进行同一条肤链的合成。多个核糖体结合在1条mRNA链上所形成的聚合物称为多聚核糖体(polyribosome或polysome)。多聚核糖体的形成可以使肤链合成高速度、高效率进行（图15-9)。原核生物的转录和翻译过程紧密偶联，转录未完成时已有核糖体结合于mRNA分子的5'－端开始翻译。真核生物的转录发生在细胞核，翻译在细胞质，因此这两个过程分隔进行。 296第三篇遗传信息的传递大亚基小亚基多肤链第四节蛋白质合成后的加工和靶向输送 新生肤链并不具有生物活性，它们必须正确折叠形成具有生物活性的三维空间结构，有的还需形成二硫键，有的需通过亚基聚合形成具有四级结构的蛋白质。此外，许多蛋白质在翻译后还要经过水解作用切除一些肤段或氨基酸，或对某些氨基酸残基的侧链基团进行化学修饰等，才能成为有活性的成熟蛋白质。这一过程称为翻译后加工(post-translational processing)。


生物化学与分子生物学 296第三篇遗传信息的传递大亚基小亚基多肤链第四节蛋白质合成后的加工和靶向输送 蛋白质合成后还需要被输送到合适的亚细胞部位才能行使各自的生物学功能。有的蛋白质驻留于细胞质，有的被运输到细胞器或镶嵌入细胞膜，还有的被分泌到细胞外。蛋白质合成后在细胞内被定向输送到其发挥作用部位的过程称为蛋白质靶向输送(protein targeting)或蛋白质分拣(protein sorting)。 一、新生脓链折叠需要分子伴侣 蛋白质在合成时，尚未折叠的肤段有许多疏水基团暴露在外，具有分子内或分子间聚集的倾向，使蛋白质不能形成正确空间构象。这种结构混乱的肤链聚集体产生过多会对细胞有致命的影响。实际上，细胞中大多数天然蛋白质折叠并不是自发完成的，其折叠过程需要其他酶或蛋白质的辅助，这些辅助性蛋白质可以指导新生肤链按特定方式正确折叠，它们被称为分子伴侣(molecular chaperone)。原核生物和真核生物都存在多种类型的分子伴侣，目前研究得较为清楚的是热激蛋白70(heat shock protein70, Hsp70)家族和伴侣蛋白(chaperonin)。


生物化学与分子生物学 一、新生脓链折叠需要分子伴侣 Hsp70因其分子量接近70kD而得名，高温刺激可诱导其合成。在蛋白质翻译后加工过程中，Hsp70与未折叠蛋白质的疏水区结合，既可避免蛋白质因高温而变性，又可防止新生肤链过早折叠。Hsp70也可以使一些跨膜蛋白质在转位至膜前保持非折叠状态。有些Hsp70通过与多肤链结合、释放的循环过程，使多肤链发生正确折叠。这个过程需要ATP水解供能，并需要其他伴侣蛋白如Hsp40的共同作用。未折叠多肤链与Hsp70结合，还可以解开多肤链之间的聚集或防止新聚集的产生。多肤链从Hsp70释放后，可以重新折叠成天然构象。如果多肤链折叠不充分，上述过程可重复进行直至天然构象形成（图15-10)。待折叠-未完全折叠天然构象`多肤链士或错误折叠多肤链开放的Hsp70-A吓复合物闭合的Hsp70-ADP复合物（低亲和力）（高亲和力）人热激蛋白家族可存在于细胞质、内质网腔、线粒体、细胞核等部位，发挥多种细胞保护功能，如使线粒体和内质网蛋白质以未折叠状态转运和跨膜；避免蛋白质变性后因疏水基团暴露而发生不可逆聚集；清除变性或错误折叠的肤链中间物等。


生物化学与分子生物学 一、新生脓链折叠需要分子伴侣 有些肤链的正确折叠还需要伴侣蛋白发挥辅助作用。伴侣蛋白的主要作用是为非自发性折叠肤链提供正确折叠的微环境。例如，在大肠杆菌，约有10%～15％的细胞内蛋白质的正确折叠依赖伴侣系统GroEl/GroES，热激条件下依赖该系统的蛋白质则高达30%。在真核细胞，与GroEl/GroES功能类似的伴侣蛋白是Hsp60。GroEL是由14个相同亚基组成的多聚体，可形成一桶状空腔，顶部是空腔的出口。GroES是由7个相同亚基组成的圆顶状复合物，可作为GroEL桶的盖子。需要折叠的肤链进入GroEL的桶状空腔后，GroES可作为盖子瞬时封闭GroEL出口。封闭后的桶状空腔为肤链折叠提供微环境，折叠过程需消耗大量ATP。折叠完成后，形成天然构象的多肤链被释放，尚未完全折叠的肤链可进入下一轮循环，重复以上过程，直至天然构象形成（图15-11)。


生物化学与分子生物学 一、新生脓链折叠需要分子伴侣 除了需要分子伴侣协助肤链折叠外，一些蛋白质形成正确空间构象还需要异构酶(isomerase)的参与。已发现两种异构酶可以帮助细胞内新生肤链折叠为功能蛋白质，一种是蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isomerase, PDI)，另一种是肤脯氨酰基顺－反异构酶(peptide prolyl cis-trans isomerase, PPI)。前者帮助肤链内或肤链间二硫键的正确形成，后者可使肤链在各脯氨酸残基弯折处形成正确折叠。这些都是蛋白质形成正确空间构象和发挥功能的必要条件。 298第三篇遗传信息的传递完成折叠的多肤链未折叠多肤链进入 7Pi7ADP, ESGroEL7ATP, ES


生物化学与分子生物学 丿工气产折叠1未完全折叠的多肮链职尥趴GroEUGroES二、肤链水解加工产生具有活性的蛋白质或多肤 新生肤链的水解是肤链加工的重要形式。新生肤链N－端的甲硫氨酸残基，在肤链离开核糖体后，大部分即由特异的蛋白水解酶切除。原核细胞中约半数成熟蛋白质的N－端经脱甲酰基酶切除N－甲酰基而保留甲硫氨酸，另一部分被氨基肤酶水解而去除N－甲酰甲硫氨酸。真核细胞分泌蛋白质和跨膜蛋白质的前体分子的N－端都含有信号肤(signal peptide)序列，由13~36个氨基酸残基组成，在蛋白质成熟过程中需要被切除。有些情况下，C－端的氨基酸残基也需要被酶切除，从而使蛋白质呈现特定功能。另外，还有许多蛋白质在初合成时是分子量较大的没有活性的前体分子，如胰岛素原、胰蛋白酶原等。这些前体分子也需经过水解作用切除部分肤段，才能成为有活性的蛋白质分子或功能肤。有些多肤链经水解可以产生数种小分子活性肤。如阿黑皮素原(pro-opiomelanocortin,POMC)可被水解而生成促肾上腺皮质激素、B－促脂解素、a－激素、促皮质素样中叶肤、丫－促脂解素、B－内啡肤、B促黑激素、丫－内啡肤及a－内啡肤等9种活性物质（图15-12)。


生物化学与分子生物学 信号肤ACTH。－促脂解素(42-134)二仁 a.-MSH CLIP丫－促脂解素o－内啡肤(1-13)(18-39)(42-101)(104-134)~-MSH丫－内啡肤(84-101)(104-118)图15-12POMC的水解修饰POMC的水解位点由Arg-Lys、Lys-Arg或Lys-Lys序列构成，用数字l~7表示。各活性物质下方括号内的数字为其在POMC中对应的氨基酸编号（将ACTH的N端第一位氨基酸残基编为1号） 三、氨基酸残基的化学修饰改变蛋白质的活性 直接参与肤链合成的氨基酸约有20种，合成后某些氨基酸残基的侧链基团发生化学修饰，这样就显著增加了肤链中的氨基酸种类。巳发现蛋白质中存在100多种修饰性氨基酸。这些修饰可改变蛋白质的溶解度、稳定性、亚细胞定位以及与细胞中其他蛋白质的相互作用等，从而使蛋白质的功能具有多样性。体内常见的蛋白质化学修饰见表15-4。


生物化学与分子生物学 化学修饰类型被修饰的氨基酸残基 磷酸化丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸N－糖基化天冬酰胺0－糖基化丝氨酸、苏氨酸胫基化脯氨酸、赖氨酸甲基化赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸乙酰化赖氨酸、丝氨酸硒化半胱氨酸上述化学修饰均为酶促反应，蛋白激酶、糖基转移酶、轻化酶、甲基转移酶等都在这一过程中发挥重要作用。 四、亚基聚合形成具有四级结构的活性蛋白质 在生物体内，许多具有特定功能的蛋白质由2条以上肤链构成，各肤链之间通过非共价键或二硫键维持一定空间构象，有些还需与辅基聚合才能形成具有活性的蛋白质。由2条以上肤链构成的蛋白质，其亚基相互聚合时所需要的信息蕴藏在肤链的氨基酸序列之中，而且这种聚合过程往往又有一定顺序，前一步骤的聚合往往促进后一步骤的进行。例如，成人血红蛋白由2条a链、2条B链及4个血红素分子组成。a链合成后从核糖体自行脱离，与尚未从核糖体释放的B链相结合，将B链带离核糖体，形成游离的叩二聚体。此二聚体再与线粒体内生成的两个血红素相结合，最后才形成一个由4条肤链（气队）和4个血红素构成的有功能的血红蛋白分子。


生物化学与分子生物学 五、蛋白质合成后被靶向输送至细胞特定部位 蛋白质在细胞质合成后，还必须被靶向输送至其发挥功能的亚细胞区域，或分泌到细胞外。所有需靶向输送的蛋白质，其一级结构都存在分拣信号，可引导蛋白质转移到细胞的特定部位。这类分拣信号又称信号序列(signal sequence)，是决定蛋白质靶向输送特性的最重要结构。有的信号序列存在于肤链的N－端，有的在C－端，有的在肤链内部；有的输送完成后切除，有的保留。现代生物信息学技术可通过基因的结构推测其编码蛋白质在细胞内的可能定位（表15-5)。蛋白质种类信号序列结构特点分泌蛋白质和膜蛋白质信号肤由13~36个氨基酸残基组成，位于新生肤链N－端核蛋白质核定位序列由4~8个氨基酸残基组成，通常包含连续的碱性氨基酸(Arg或Lys)，在肤链的位置不固定内质网蛋白质内质网滞留信号肤链C－端的Lys-Asp-Glu-Leu序列核基因组编码的线粒体线粒体前导肤由20~35个氨基酸残基组成，位于新生肤链N－端蛋白质溶酶体蛋白质溶酶体靶向信号甘露糖－6－磷酸(Man-6-P)有的蛋白质在合成过程中已开始靶向输送，而另有一些蛋白质的靶向输送是从核糖体上释放后才开始的。


生物化学与分子生物学 （一）分泌蛋白质在内质网加工及靶向输送 细胞内分泌蛋白质的合成与靶向输送同时发生，其N－端存在由数十个氨基酸残基组成的信号序列，又称信号肤(signal peptide)。已发现有数百种信号肤存在，它们的共同特点是：(DN－端含一个或多个碱性氨基酸残基；＠中段含l0~l5个疏水性氨基酸残基；＠C－端由一些极性较大、侧链较短的氨基酸残基组成，与信号肤裂解位点(cleavage site)邻近（图15-13)。信号肤酶裂解位点人前胰岛素原MetAlaLeuTrpMet匹扣u I.euPro~Gly Pro AspPro AJaAJaAlaPheVal-牛生长激素Met Met Ala Ala GlyPro匹袒虹Se寸1.eu压压AlaPheAla1.euleuc评leu压加IThr Gin Val Val Gly'Ala Phe-分泌蛋白质的合成及转运机制为：CD在游离核糖体上，信号肤因位于肤链N－端而首先被合成，随后被信号识别颗粒(signal recognition particle, SRP)识别并结合，SRP随即结合到核糖体上；＠内质网膜上有SRP的受体（亦称为SRP对接蛋白），借此受体，SRP－核糖体复合物被引导至内质网膜上；＠在内质网膜上，肤转位复合物(peptide translocation complex)形成跨内质网膜的蛋白质通道，合成中的肤链穿过内质网膜孔进入内质网；＠SRP脱离信号肤和核糖体，肤链继续延长直至完成；＠信号肤在内质网内被信号肤酶(signal peptidase)切除；＠肤链在内质网中折叠形成最终构象，随内质网膜”出芽＂形成的襄泡转移至高尔基复合体，最后在高尔基复合体中被包装进分泌小泡，转运至细胞膜，再分泌到细胞外（图15-14)。


生物化学与分子生物学 （一）分泌蛋白质在内质网加工及靶向输送  延伸的多肤细胞质SRP受体内质网膜信号肤酶内质网腔气蛋白｀｀ （二）内质网蛋白质的C－端含有滞留信号序列内质网中含有多种帮助新生肤链折叠成天然构型的蛋白质，如分子伴侣等。这些需要停留在内质网中执行功能的蛋白质，先经粗面内质网上附着的核糖体合成并进入内质网腔，然后随禄泡输送至高尔基复合体。内质网蛋白肤链的C－端含有内质网滞留信号序列，它们被输送到高尔基复合体后，可通过这一滞留信号与内质网上相应受体结合，随痰泡输送回内质网。（三）大部分线粒体蛋白质在细胞质合成后靶向输入线粒体线粒体虽然自身含有DNA、mRNA、tRNA和核糖体等，可以进行蛋白质的合成，但绝大部分线粒体蛋白质（超过95%，约1100种）是由细胞核基因组的基因编码，它们在细胞质中的游离核糖体中合成后靶向输送到线粒体，其中大部分定位于线粒体基质，其他定位于内膜、外膜或膜间腔。


生物化学与分子生物学 延伸的多肤细胞质SRP受体内质网膜信号肤酶内质网腔气蛋白｀｀ 定位于线粒体基质的蛋白质，其前体分子的N－端包含前导肤序列，由20~35个氨基酸残基组成，富含丝氨酸、苏氨酸及碱性氨基酸。这类蛋白质的靶向输送过程是：心新合成的线粒体蛋白质与热激蛋白或线粒体输入刺激因子结合，以稳定的未折叠形式转运至线粒体外膜；＠通过前导肤序列识别，与线粒体外膜的受体复合物结合；＠在热激蛋白水解ATP和跨内膜电化学梯度的动力共同作用下，蛋白质穿过由外膜转运体和内膜转运体共同构成的跨膜蛋白质通道，进入线粒体基质；＠蛋白质前体被蛋白酶切除前导肤序列，在分子伴侣作用下折叠成有功能构象的蛋白质。输送到线粒体内膜和膜间隙的蛋白质除了上述前导肤外，还另有一段信号序列，其作用是引导蛋白质从基质输送到线粒体内膜或穿过内膜进入膜间隙。 （四）质膜蛋白质由襄泡靶向输送至细胞膜 定位于细胞质膜的蛋白质，其靶向跨膜机制与分泌蛋白质相似。不过，跨膜蛋白质的肤链并不完全进入内质网腔，而是描定在内质网膜上，通过内质网膜”出芽”方式形成襄泡。随后，跨膜蛋白质随翍泡转移至高尔基复合体进行加工，再随痰泡转运至细胞膜，最终与细胞膜融合而构成新的质膜。


生物化学与分子生物学 （四）质膜蛋白质由襄泡靶向输送至细胞膜 不同类型的跨膜蛋白质以不同形式铀定于膜上。例如，单次跨膜蛋白质的肤链中除N－端含信号序列外，还有一段由疏水性氨基酸残基构成的跨膜序列，即停止转移序列(stop transfer sequence)，是跨膜蛋白质在膜上的嵌入区域。当合成中的多肤链向内质网腔导入时，疏水的停止转移序列可与内质网膜的脂双层结合，从而使导入中的肤链不再向内质网腔内转移，形成一次性跨膜的描定蛋白质。多次跨膜蛋白质的肤链中因有多个信号序列和多个停止转移序列，可在内质网膜上形成多次跨膜。 （五）核蛋白质由核输入因子运载经核孔入核 细胞核内含有多种蛋白质，如参与DNA复制和转录的各种酶及蛋白质因子、组蛋白、调节基因表达的转录因子等，它们都是在细胞质中合成后经核孔进入细胞核的，其靶向输送由特异的核定位序列(nuclear localization sequence, NLS)引导。NLS由4~8个氨基酸残基组成，通常包含连续的碱性氨基酸(Arg或Lys)，在肤链的位置不固定，定位完成后保留于肤链而不被切除。


生物化学与分子生物学 （五）核蛋白质由核输入因子运载经核孔入核 核蛋白质的靶向输送还需要多种蛋白质的参与，如核输入因子(nuclear importin)a和B、Ras相关核蛋白质(Ras-related nuclear protein, Ran)等。核输入因子a和B形成异二聚体，识别并结合核蛋白质的NLS序列。核蛋白质的靶向输送基本过程是：心在细胞质合成的核蛋白质与核输入因子结合形成复合物后被导向核孔；＠具有GTPase活性的Ran蛋白水解GTP释能，核蛋白质－核输入因子复合物通过耗能机制经核孔进入细胞核基质；＠核输入因子B和a先后从上述复合物中解离，移出核孔后可被再利用，核蛋白质定位于细胞核内（图15-15)。生物体内的蛋白质历经肤链合成的起始、延长、终止，以及加工和靶向输送后发挥生物学功能。其后，蛋白质在特定的时空条件下被降解。蛋白质的生物合成及其降解是几乎所有生命活动的基础。


生物化学与分子生物学 302第三篇遗传信息的传递核输入因子｀＄白质细胞质核膜二复勹十．又勹P+P1核基质芦用二＼尸第五节蛋白质合成的干扰和抑制 蛋白质生物合成是许多药物和毒素的作用靶点。这些药物或毒素通过阻断原核或真核生物蛋白质合成体系中某组分的功能，来干扰和抑制蛋白质合成过程。真核生物与原核生物的翻译过程既相似又有差别，这些差别在临床医学中有重要应用价值。如抗生素能杀灭细菌但对真核细胞无明显影响，因此原核生物蛋白质合成所必需的关键组分可作为研发抗菌药物的靶点。此外，蛋白质合成的每一步反应几乎都可被特定的抗生素所抑制，这些抗生素可被用于蛋白质合成机制的研究。某些毒素作用于基因信息传递过程，对毒素作用机制的研究，不仅有助于理解其致病机制，还可从中探索研发新药的途径。


生物化学与分子生物学 一、许多抗生素通过抑制蛋白质合成发挥作用 某些抗生素(an tibioti c)可抑制细胞的蛋白质合成，仅仅作用千原核细胞蛋白质合成的抗生素可作为抗菌药，抑制细菌生长和繁殖，预防和治疗感染性疾病。作用千真核细胞蛋白质合成的抗生素可以作为抗肿瘤药。（一）抑制脓链合成起始的抗生素伊短菌素(e deine)和密旋霉素(pactamyci n)可引起mRNA在核糖体上错位，从而阻碍翻译起始复合物的形成，对原核生物和真核生物的蛋白质合成均有抑制作用。伊短菌素还可以影响起始氨酰tRNA的就位和IF3的功能。晚霉素(everninomicin)结合千原核23S rRNA，阻止fMet-tRNA仆1c1的转位。（二）抑制肤链延长的抗生素1干扰进位的抗生素四环素(tetracycline)特异性结合30S亚基的A位，从而抑制氨酰－tRNA的进位。粉霉素(pulvomycin)可降低EF-Tu的GTP酶活性，从而抑制EF-Tu与氨酰－tRNA结合；黄色霞素(kirromycin)可阻止EF-Tu从核糖体释出。2.引起读码错误的抗生素氨基糖背类抗生素能与30S亚基结合，影响翻译的准确性。例如，链霉素(streptomycin)与30S亚基结合，在较低浓度时引起读码错误（在高浓度时是抑制蛋白质合成的起始）；潮霉素B(hygromycin B)和新霉素(neomycin)能与16S rRNA及rpS12结合，千扰30S亚基的解码部位，引起读码错误。这些抗生素均能使延长中的肤链引入错误的氨基酸残基，从而改变细菌蛋白质合成的忠实性。3影响成肤的抗生素氯霉素(chloramphenicol)可结合核糖体亚基，通过阻止肤酰转移而sos常见抗生素的作用位点、作用原理及应用总结于表15-6。应用抗生素作用位点作用原理伊短菌素阻碍翻译起始复合物的形成抗病毒药原核、真核核糖体的小亚基四环素抗菌药抑制氨酰-tRNA与小亚基结合原核核糖体的小亚基链霉素、新霉素、巴龙霉素原核核糖体的小亚基引起读码错误抑制起始抗菌药；氯霉素、林可霉素、红霉素原核核糖体的大亚基抑制肤酰转移酶，阻断肤链延长抗菌药放线菌酮真核核糖体的大亚基抑制肤酰转移酶，阻断肤链延长医学研究噤呤霉素使肤酰基转移到它的氨基上，肤抗肿瘤药原核、真核核糖体夫西地酸、微球菌素原核延长因子EFG阻止转位抗菌药-大观霉素原核核糖体的小亚基阻止转位抗菌药二、某些毒素抑制真核生物的蛋白质合成。比十了。


生物化学与分子生物学 一、许多抗生素通过抑制蛋白质合成发挥作用 抑制肤键形成；林可霉素(lincomycin)作用于A位和P位，阻止tRNA在这两个位置就位而抑制肤键形成；大环内酷类抗生素如红霉素(e1-ythromycin)能与核糖体so s亚基中肤链排出通道结合，阻止新生肤链从核糖体大亚基中排出，从而阻止肤键的进一步形成；嗦呤霉素(puromycin)的结构与酪氨酰tRNA相似，在翻译中可取代酪氨酰－tRNA而进入核糖体A位，中断肤链合成；放线菌酮(cycloheximide)特异性抑制真核生物核糖体肤酰转移酶的活性。4.影响转位的抗生素夫西地酸(£us心c acid汃硫链丝菌肤(thiostrepton)和微球菌素(micrococcin)抑制EF-G的转位酶活性，从而阻止核糖体转位。大观霉素(spectinomycin)结合核糖体30S亚基，阻碍小亚基变构，抑制转位反应。 链脱落某些毒素可通过干扰真核生物的蛋白质合成而呈 现毒性。白喉毒素(diphtheria toxin)是真核细胞蛋白


生物化学与分子生物学 链脱落某些毒素可通过干扰真核生物的蛋白质合成而呈 质合成的抑制剂，它作为一种修饰酶，可使eEF2发生ADP核糖基化修饰，生成eEF2腺昔二磷酸核糖衍生物，使eEF2失活，从而抑制蛋白质的合成（图15-16)。AD。苠麻毒蛋白(ricin)是栳麻籽中所含的植物糖蛋FN H（有活性）`白，由A、B两条肤链组成，两条肤链之间由一个二硫+A白喉毒素键连接。A链是一种蛋白酶，可作用于真核生物核糖体大亚基的28S rRNA，特异催化其中一个腺昔酸发. 生脱嗦呤反应，导致28S rRNA降解而使核糖体大亚 基失活。B链对A链发挥毒性起重要的促进作用，另外B链上的半乳糖结合位点也是能麻毒蛋白发挥毒性作用的活性部位。 白喉毒素的作用原理304第三篇遗传信息的传递 蛋白质是生命活动的重要物质基础。蛋白质具有高度的种属特异性，所以各种生物的蛋白质必须由机体自身合成。蛋白质合成体系包括原朴氨基酸，模板mRNA、氨基酸搬运工具tRNA、蛋白质合成场所核糖体，以及合成各阶段所需的酶和蛋白质因子等，合成过程还需要ATP或GTP供能。


生物化学与分子生物学 白喉毒素的作用原理304第三篇遗传信息的传递 mRNA是蛋白质合成的模板。mRNA可读框中每3个相邻核芬酸编码一种氨基酸，称为密码子。密码子共有64个，其中61个编码各种氨基酸，3个作为肤链合成的终止密码子。密码子具有方向性、连续性、简并性、摆动性和通用性等特点。tRNA是氨基酸和密码子之间的特异衔接子。tRNA与特异氨基酸的连接由氨酰-tRNA合成酶催化，tRNA通过反密码子与mRNA的密码子识别，为肤链合成提供氨基酸原料。核糖体由大、小亚基组成，具有A住、P位和E位三个功能部位，是蛋白质合成的场所。蛋白质合成过程包括起始、延长和终止三个阶段。肤链合成的起始是在各种起始因子的协助下，mRNA、起始氨酰－tRNA分别与核糖体结合，装配成翻译起始复合物的过程。肤链的延长是在核糖体上重复进行的进位、成肤和转位的循环过程，每循环1次，肤链上即可增加1个氨基酸残基。肤链的延长过程需要数种延长因子以及GTP等参与。当核糖体的A位对应于mRNA的终止密码子时，释放因子RF进入A位，致使肤酰转移酶转变为酣酶，水解肤链与tRNA间的酣键，新生肤链释放，核糖体大小亚基分离，肤链合成终止。


生物化学与分子生物学 白喉毒素的作用原理304第三篇遗传信息的传递 原核生物和真核生物的肤链合成过程基本相似，只是真核生物的反应更为复杂、涉及的蛋白质因子更多。原核生物和真核生物均以多聚核糖体形式进行肤链的高效合成。原核生物的转录和翻译过程紧密偶联。真核生物的转录发生在细胞核，翻译在细胞质，因此这两个过程分隔进行。新生肤链并不具有生物活性，需要经过复杂的翻译后加工，才能成为有活性的成熟蛋白质。翻译后加工包括在分子伴侣帮助下的肤链折叠、肤链末端及内部的水解、肤链中氨基酸残基的化学修饰、亚基聚合等方式。蛋白质在细胞质合成后，还需要被靶向输送至其发挥功能的亚细胞区域，或分泌到细胞外。所有需靶向输送的蛋白质，其一级结构都存在分拣信号。蛋白质生物合成是许多药物和毒素的作用靶点。这些药物或毒素通过阻断原核或真核生物蛋白质合成体系中某组分的功能，来干扰和抑制蛋白质合成过程。真核生物与原核生物的翻译过程既相似又有差别，这些差别在临床医学中有重要应用价值。


生物化学与分子生物学 白喉毒素的作用原理304第三篇遗传信息的传递 一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一1.蛋白质合成过程中有哪些机制保证多肤链翻译的准确性？2.对蛋白质合成机制的研究有何重要意义？3.真核生物与原核生物的翻译过程既相似又有差别，这些差别在临床医学中有何重要应用价值？ （倪菊华）第十六章基因表达调控 20世纪50年代末，生物学家们揭示了遗传信息从DNA传递到蛋白质的规律一中心法则。此后，科学家们一直在探索究竟何种机制调控着遗传信息的传递。1961年，Jacob F和Monod JL提出了著名的操纵子学说，开创了基因表达调控研究的新纪元。


生物化学与分子生物学 （倪菊华）第十六章基因表达调控 基因表达调控的研究使得人们了解到多细胞生物是如何从一个受精卵及所具有的一套遗传基因组，最终形成具有不同形态和功能的多组织、多器官的个体；也使得人们初步知晓，为何同一个体中不同的组织细胞拥有基本相同的遗传信息，却可以产生各自专一的蛋白质产物，因而具有完全不同的生物学功能。因此，了解基因表达调控是认识生命体和疾病不可或缺的重要内容。 第一节基因表达调控的基本概念与特点 原核生物体系和真核生物体系在基因组结构以及细胞结构上的差异使得它们的基因表达方式有所不同。原核细胞没有细胞核，遗传信息的转录和翻译发生在同一空间，并以偶联的方式进行。真核细胞具有细胞核，使得转录和翻译不仅具有空间分布的特征，而且还有时间特异性。尽管如此，原核生物体系和真核生物体系的基因表达调控遵循一些共同的基本规律。


生物化学与分子生物学 —、基因表达产生有功能的蛋白质和RNA 基因表达(gene expression)就是基因转录及翻译的过程，也是基因所携带的遗传信息表现为表型的过程，包括基因转录成互补的RNA序列，对于蛋白质编码基因，mRNA继而翻译成多肤链，并装配加工成最终的蛋白质产物。在一定调节机制控制下，基因表达通常经历转录和翻译过程，产生具有特异生物学功能的蛋白质分子，赋予细胞或个体一定的功能或形态表型。但并非所有基因表达过程都产生蛋白质。rRNA、tRNA编码基因转录产生RNA的过程也属于基因表达。


生物化学与分子生物学 —、基因表达产生有功能的蛋白质和RNA 不同生物的基因组含有不同数量的基因。细菌的基因组一般约含4000个基因；多细胞生物的基因达数万个，人类基因组含约2万个蛋白质编码基因（见第十一章）。在某一特定时期或生长阶段，基因组中只有小部分基因处千表达状态。例如，大肠杆菌通常只有约5％的基因处于高水平转录活性状态，其余大多数基因不表达或表达水平极低，即生成很少的RNA或蛋白质。基因表达水平的高低不是固定不变的。例如，平时与细菌蛋白质生物合成有关的延长因子编码基因表达十分活跃，而参与DNA损伤修复有关的酶分子编码基因却极少表达；当有紫外线照射引起DNA损伤时，这些修复酶编码基因的表达就变得异常活跃。可见，生物体中具有某种功能的基因产物在细胞中的数量会随时间、环境而变化。 二、基因表达具有时间特异性和空间特异性 所有生物的基因表达都具有严格的规律性，即表现为时间特异性和空间特异性。生物物种愈高级基因表达规律愈复杂愈精细，这是生物进化的需要。基因表达的时间、空间特异性由特异的基因启动子（序列）和（或）调节序列与调节蛋白相互作用决定。


生物化学与分子生物学 二、基因表达具有时间特异性和空间特异性 （一）时间特异性是指基因表达按一定的时间顺序发生按功能需要，某一特定基因的表达严格按一定的时间顺序发生，这就是基因表达的时间特异性306第三篇遗传信息的传递(tempora l specificity)。如噬菌体病毒或细菌侵入宿主后，呈现一定的感染阶段。随感染阶段发展、生长环境变化，这些病原体以及宿主的基因表达都有可能发生改变。有些基因开启，有些基因关闭。例如，霍乱弧菌在感染宿主后，44种基因的表达上调，193种基因的表达受到抑制，而相伴随的是这些细菌呈现出高传染状态。编码甲胎蛋白(a-fetoprotein, a-AFP)的基因在胎儿肝细胞中活跃表达，因此合成大量的甲胎蛋白；在成年后这一基因的表达水平很低，故几乎检测不到AFP。但是，当肝细胞发生转化形成肝癌细胞时，编码AFP的基因又重新被激活，大量的AFP被合成。因此，血浆中AFP的水平可以作为肝癌早期诊断的一个重要指标。


生物化学与分子生物学 二、基因表达具有时间特异性和空间特异性 多细胞生物从受精卵发育成为一个成熟个体，经历很多不同的发育阶段。在每个不同的发育阶段，都会有不同的基因严格按照自己特定的时间顺序开启或关闭，表现为与分化、发育阶段一致的时间性。因此多细胞生物基因表达的时间特异性又称阶段特异性(stage specificity)。（二）空间特异性是指多细胞生物个体在特定生长发育阶段，同—基因在不同的组织器官表达不同在多细胞生物个体某一发育、生长阶段，同一基因产物在不同的组织器官表达水平也可能不同。在个体生长、发育过程中，一种基因产物在个体的不同组织或器官表达，即在个体的不同空间出现，这就是基因表达的空间特异性(spatial specifici ty)。如编码胰岛素的基因只在胰岛的B细胞中表达，从而指导生成胰岛素；编码胰蛋白酶的基因在胰岛细胞中几乎不表达，而在胰腺腺泡细胞中有高水平的表达。基因表达伴随时间或阶段顺序所表现出的这种空间分布差异，实际上是由细胞在器官的分布所决定的，因此基因表达的空间特异性又称细胞特异性(cell specificity)或组织特异性(tissue specificity)。


生物化学与分子生物学 二、基因表达具有时间特异性和空间特异性 同一个体内不同器官、组织、细胞的差异性的基础是特异的基因表达或称为差异基因表达(differential gene expression)。细胞的基因表达谱(gene expression profi le)，即基因表达的种类和强度决定了细胞的分化状态和功能。换言之，在个体内决定细胞类型的不是基因本身，而是基因表达模式(gene expression pattern)。 三、基因表达的方式存在多样性 不同种类的生物遗传背景不同，同种生物不同个体生活环境不完全相同，不同的基因功能和性质也不相同。因此，不同的基因对生物体内、外环境信号刺激的反应性不同。有些基因在生命全过程中持续表达，有些基因的表达则受环境影响。基因表达调控(regulation of gene expression)就是指细胞或生物体在接受内、外环境信号刺激时或适应环境变化的过程中在基因表达水平上作出应答的分子机制，即位于基因组内的基因如何被表达成为有功能的蛋白质（或RNA)，在什么组织表达，什么时候表达，表达多少等。按照对刺激的反应性，基因表达的方式或调节类型存在很大差异。


生物化学与分子生物学 （一）有些基因几乎在所有细胞中持续表达 有些基因产物对生命全过程都是必需的或必不可少的。这类基因在一个生物个体的几乎所有细胞中待续表达，不易受环境条件的影响，或称基本表达。这些基因通常被称为管家基因(housekeeping gene)。例如，三狻酸循环是一中枢性代谢途径，催化该途径各阶段反应的酶的编码基因就属这类基因。管家基因的表达水平受环境因素影响较小，而是在生物体各个生长阶段的大多数或几乎全部组织中持续表达，或变化很小。我们将这类基因表达称为基本（或组成性）基因表达(constitutive gene expression)。基本基因表达只受启动子和RNA聚合酶等因素的影响，而基本不受其他机制调节。但实际上，基本基因表达水平并非绝对“一成不变”，所谓“不变”是相对的。


生物化学与分子生物学 （一）有些基因几乎在所有细胞中持续表达 （二）有些基因的表达受到环境变化的诱导和阻遏与管家基因不同，另有一些基因表达很容易受环境变化的影响。随外环境信号变化，这类基因的表达水平可以出现升高或降低的现象。在特定环境信号剌激下，相应的基因被激活，基因表达产物增加，即这种基因表达是可诱导的。可诱导基因(inducible gene)在一定的环境中表达增强的过程称为诱导(induction)。例如，在有DNA损伤时，修复酶基因就会在细菌体内被激活，导致修复酶反应性地增加。相反，如果基因对环境信号应答时被抑制，这种基因称为可阻遏基因(repressible gene)。可阻遏基因表达产物水平降低的过程称为阻遏(repression)。例如，当培养基中色氨酸供应充分时，细菌体内与色氨酸合成有关的酶编码基因表达就会被抑制。这类基因的调控序列通常含有针对特异刺激的反应元件。诱导和阻遏是同一事物的两种表现形式，在生物界普遍存在，也是生物体适应环境的基本途径。乳糖操纵子机制是认识诱导和阻遏表达的经典模型（见本章第二节）。


生物化学与分子生物学 （三）生物体内不同基因的表达受到协调调节 在生物体内，一个代谢途径通常是由一系列化学反应组成，需要多种酶参与；此外，还需要很多其他蛋白质参与作用物在细胞内、外区间的转运。这些酶及转运蛋白等的编码基因被统一调节，使参与同一代谢途径的所有蛋白质（包括酶）分子比例适当，以确保代谢途径有条不紊地进行。在一定机制控制下，功能上相关的一组基因，无论其为何种表达方式，均需协调一致、共同表达，即为协同表达(coordinate expression)。这种调节称为协同调节(coordinate regulation)。基因的协调表达体现在生物体的生长发育全过程。生物体通过协调调节不同基因的表达以适应环境、维持生长和增殖。生物体所处的内、外环境是在不断变化的。所有生物的所有活细胞都必须对内、外环境的变化作出适当反应，以使生物体能更好地适应变化着的环境状态。生物体这种适应环境的能力总是与某种或某些蛋白质分子的功能有关。细胞内某种功能蛋白质分子的有或无、多或少的变化则由编码这些蛋白质分子的基因表达与否、表达水平高低等状况决定。通过一定的程序调控基因的表达，可使生物体表达出合适的蛋白质分子，以便更好地适应环境，维持其生长。


生物化学与分子生物学 （三）生物体内不同基因的表达受到协调调节 原核生物、单细胞生物调节基因的表达就是为适应环境、维持生长和细胞分裂。例如，当葡萄糖供应充足时，细菌中与葡萄糖代谢有关的酶编码基因表达增强，其他糖类代谢有关的酶基因关闭；当葡萄糖耗尽而有乳糖存在时，与乳糖代谢有关的酶编码基因则表达，此时细菌可利用乳糖作为碳源，维持生长和增殖。高等生物也普遍存在适应性表达方式。经常饮酒者体内醇氧化酶活性较高即与相应基因表达水平升高有关。


生物化学与分子生物学 （三）生物体内不同基因的表达受到协调调节 在多细胞生物，基因表达调控的意义还在于维待细胞分化与个体发育。在多细胞个体生长、发育的不同阶段，细胞中的蛋白质分子种类和含量变化很大；即使在同一生长发育阶段，不同组织器官内蛋白质分子分布也存在很大差异，这些差异是调节细胞表型的关键。例如，果蝇幼虫（蛹）最早期只有一组“母本效应基因(maternal effect gene)”表达，使受精卵发生头尾轴和背腹轴固定，以后有三组“分节基因“顺序表达，控制蛹的“分节”发育过程，最后这些“节”分别发育为成虫的头、胸、翅膀、肢体、腹及尾等。高等哺乳类动物的细胞分化，各种组织、器官的发育都是由一些特定基因控制的。当某种基因缺陷或表达异常时，则会出现相应组织或器官的发育异常。


生物化学与分子生物学 四、基因表达受调控序列和调节分子共同调节 一个生物体的基因组中既有携带遗传信息的基因编码序列，也有能够影响基因表达的调控序列(regulatory sequence)。一般说来，调控序列与被调控的编码序列位千同一条DNA链上，也被称为顺式作用元件(cis-acting element)或顺式调节元件(cis-regulator element, CRE)。还有一些调控基因远离被调控的编码序列，实际上是其他分子的编码基因，只能通过其表达产物来发挥作用。这类调控基因产物称为调节蛋白(regulatory protein)。调节蛋白不仅能对处于同一条DNA链上的结构基因的表达进行调控，而且还能对不在一条DNA链上的结构基因的表达起到同样的作用。因此，这些蛋白质分子又被称为反式作用因子(trans-acting factor)。这些反式作用因子以特定的方式识别和结合在顺式作用元件上，实施精确的基因表达调控。还有一类调控基因的产物为调节RNA，这些RNA分子以不同的作用方式对基因表达进行精细调节。


生物化学与分子生物学 第三篇遗传信息的传递 作为反式作用因子的调节蛋白具有特定的空间结构，通过特异性地识别某些DNA序列与顺式作用元件发生相互作用。例如，DNA双螺旋结构的大沟是调节蛋白最容易与DNA序列发生相互作用的部位。真核生物基因组结构比较复杂，使得有些调节蛋白不能直接与DNA相互作用，而是首先形成蛋白质－蛋白质的复合物，然后再与DNA结合参与基因表达的调控。蛋白质－DNA以及蛋白质－蛋白质的相互作用是基因表达调控的分子基础。 五、基因表达调控呈现多层次和复杂性 无论是原核生物还是真核生物，基因表达调控体现在基因表达的全过程中，即在RNA转录合成和蛋白质翻译两个阶段都有控制其表达的机制。因此基因表达的调控是多层次的复杂过程，改变其中任何环节均会导致基因表达的变化（动画16-1“基因表达多层次调控”)。


生物化学与分子生物学 五、基因表达调控呈现多层次和复杂性 首先，遗传信息以基因的形式贮存于DNA分子中，基因拷贝数越多，其表达产物也会越多，因此基因组DNA的部分扩增(amplification)可影响基因表达。在多细胞生物，某一特定类型细胞的选择性扩增可能就是通过这种机制使某种或某些蛋白质分子高表达的结果。为适应某种特定需要而进行的DNA重排(DNA rearrangement)，以及DNA甲基化(DNA methylation)等均可在遗传信息水平上影响基因表达。其次，遗传信息经转录由DNA传递给RNA的过程，是基因表达调控最重要、最复杂的一个层次。在真核细胞，初始转录产物需经转录后加工修饰才能成为有功能的成熟RNA，并由细胞核转运至细胞质，对这些转录后加工修饰以及转运过程的控制也是调节某些基因表达的重要方式，例如：对mRNA的选择性剪接、RNA编辑等。近年来，以miRNA为代表的非编码RNA对基因表达调控的作用也日益受到重视，使我们可以在一个新的层面上理解基因表达调控。


生物化学与分子生物学 五、基因表达调控呈现多层次和复杂性 蛋白质生物合成即翻译是基因表达的最后一步，影响蛋白质合成的因素同样也能调节基因表达。并且，翻译与翻译后加工可直接、快速地改变蛋白质的结构与功能，因而对此过程的调控是细胞对外环境变化或某些特异刺激应答时的快速反应机制。总之，在遗传信息传递的各个水平上均可进行基因表达调控。尽管基因表达调控可发生在遗传信息传递过程的任何环节，但发生在转录水平，尤其是转录起始水平的调节，对基因表达起着至关重要的作用，即转录起始是基因表达的基本控制点。 第二节原核基因表达调控 原核生物基因组是具有超螺旋结构的闭合环状DNA分子，在结构上有以下特点：O基因组中很少有重复序列；＠编码蛋白质的结构基因为连续编码，且多为单拷贝基因，但编码rRNA的基因仍然是多拷贝基因；＠结构基因在基因组中所占的比例（约占50%）远远大千真核基因组；＠许多结构基因在基因组中以操纵子为单位排列。此外，原核生物的细胞结构也比较简单，其基因组的转录和翻译可以在同一空间内完成，并且时间上的差异不大。在转录过程终止之前mRNA就已经结合在核糖体上，开始了蛋白质的生物合成。


生物化学与分子生物学 —、操纵子是原核基因转录调控的基本单位 前已述及，大肠杆菌的RNA聚合酶由G亚基（或称6因子）和核心酶构成，其中u亚基的作用是识别和结合在DNA模板上的启动序列，启动转录过程。原核生物在转录水平的调控主要取决千转录起始速度，即主要调节的是转录起始复合物形成的速度。原核生物大多数基因表达调控是通过操纵子机制实现的。操纵子由结构基因、调控序列和调节基因组成包。结构基因通常包括数个功能上有关联的基因，它们串联排列，共同构成编码区。这些结构基因共用一个启动子和一个转录终止信号序列，因此转录合成时仅产生一条mRNA长链，为几种不同的蛋白质编码。这样的mRNA分子携带了几条多肤链的编码信息，被称为多顺反子(polycistron)mRNA。


生物化学与分子生物学 —、操纵子是原核基因转录调控的基本单位 调控序列主要包括启动子和操纵元件(operator)。启动子是RNA聚合酶结合的部位，是决定基因表达效率的关键元件。各种原核基因启动序列特定区域内，通常在转录起始点上游－10及－35区域存在一些相似序列（见第十四章），称为共有序列。E. coli及一些细菌启动序列的共有序列在－10区域是TATAAT，又称Pribnow盒，在－35区域为TTGACA（图16-1)。这些共有序列中的任一碱基突变或变异都会影响RNA聚合酶与启动子的结合及转录起始。因此，共有序列决定启动子的转录活性大小。操纵元件并非结构基因，而是一段能被特异的阻遏蛋白识别和结合的DNA序列。操纵序列与启动序列毗邻或接近，其DNA序列常与启动子交错、重叠，它是原核阻遏蛋白(repressor)的结合位点。当操纵序列结合有阻遏蛋白时会阻碍RNA聚合酶与启动子的结合，或使RNA聚合酶不能沿DNA向前移动，阻遏转录，介导负性调节。原核操纵子调控序列中还有一种特异的DNA序列可结合激活蛋白(activator)，结合后RNA聚合酶活性增强，使转录激活，介导正性调节。


生物化学与分子生物学 -35区-10区RNA转录起点 Ara BAD CTGACG~I N16TACTGT N6A共有序列TIGACA TATAAT图16-15种E. coli启动子的共有序列-10区域的TATAAT和－35区域的TIGACA为共有序列调节基因(regulatory gene)编码能够与操纵元件结合的阻遏蛋白。阻遏蛋白可以识别、结合特异的操纵元件，抑制基因转录，所以阻遏蛋白介导负性调节(negative regulation)。阻遏蛋白介导的负性调节机制在原核生物中普遍存在。


生物化学与分子生物学 -35区-10区RNA转录起点 此外，还有一些调控蛋白质对原核基因转录调控起着重要的作用，如特异因子和激活蛋白。这些调控蛋白质的作用分别是：O特异因子决定RNA聚合酶对一个或一套启动序列的特异性识别和结合能力。＠激活蛋白可结合启动子邻近的DNA序列，提高RNA聚合酶与启动序列的结合能力，从而增强RNA聚合酶的转录活性，是一种正性调节(positive regulation)。分解（代谢）物基因激活蛋白(catabolite gene activator protein, CAP)就是一种典型的激活蛋白。有些基因在没有激活蛋白存在时，RNA聚合酶很少或根本不能结合启动子，所以基因不能转录。阻遏蛋白、特异因子和激活蛋白等原核调控蛋白都是一些DNA结合蛋白。凡是能够诱导基因表达的分子称为诱导剂，而凡是能够阻遏基因表达的分子称为阻遏剂。


生物化学与分子生物学 二、乳糖操纵子是典型的诱导型调控 操纵子在原核基因表达调控中具有普遍意义。大多数原核生物的多个功能相关基因串联在一起，依赖同一调控序列对其转录进行调节，使这些相关基因实现协调表达尽。以大肠杆菌的乳糖操纵子(lac operon)为例介绍原核生物的操纵子调控模式。乳糖代谢酶基因的表达特点是：在环境中没有乳糖时，这些基因处千关闭状态；只有当环境中有乳糖时，这些基因才被诱导开放，合成代谢乳糖所需要的酶。乳糖操纵子是最早发现的原核生物转录调控模式。


生物化学与分子生物学 310第三篇遗传信息的传递（一）乳糖操纵子的结构 E. coli的乳糖操纵子含Z、Y及A三个结构基因，分别编码B－半乳糖昔酶((3-galactosidase汃通透酶(permease)和乙酰基转移酶(acetyltransferase)，此外还有一个操纵序列0(operator,0)、一个启动子P(promoter, P)及一个调节基因I。I基因具有独立的启动子(PI)，编码一种阻遏蛋白，后者与0序列结合，使操纵子受阻遏而处千关闭状态。在启动子P上游还有一个CAP结合位点。由P序列、0序列和CAP结合位点共同构成乳糖操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因表达产物的协同表达（图16-2)。


生物化学与分子生物学 别乳糖或IPTGI]J[m衫／呻`//／，I z]y 固16-2lac操纵子与阻遏蛋白的负性调节阻遏蛋白由具有独立启动子(PI)的I基因编码生成后，与操纵序列(0序列）结合，使操纵子受阻遏而处千关闭状态。别乳糖或异丙基硫代半乳糖昔(IPTG)等可以结合阻遏蛋白，使其构象变化而去阻遏（二）乳糖操纵子受到阻遏蛋白和CAP的双重调节1.阻遏蛋白的负性调节在没有乳糖存在时，lac操纵子处于阻遏状态。此时，I序列在PI启动序列作用下表达的Lac阻遏蛋白与0序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录启动。阻遏蛋白的阻遏作用并非绝对，偶有阻遏蛋白与0序列解聚。因此，每个细胞中可能会有寥寥数个分子的B－半乳糖昔酶、通透酶生成。


生物化学与分子生物学 别乳糖或IPTGI]J[m衫／呻`//／，I z]y 当有乳糖存在时，lac操纵子即可被诱导。在这个操纵子体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖经通透酶催化、转运进入细胞，再经原先存在于细胞中的少数6－半乳糖甘酶催化，转变为别乳糖(allolactose)。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白质构象变化，导致阻遏蛋白与0序列解离而发生转录，可使B－半乳糖昔酶分子增加达1000倍。别乳糖的类似物异丙基硫代半乳糖昔(i sopropylthiogala ctoside, IPTG)是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此在基因工程领域和分子生物学实验中被广泛应用。2. CAP的正性调节CAP是同二聚体，在其分子内有DNA结合区及cAMP结合位点。当培养基中缺乏葡萄糖时，cAMP浓度增高，cAMP与CAP结合，这时CAP结合在lac启动序列附近的CAP位点，可刺激RNA聚合酶转录活性，使之提高50倍己；当有葡萄糖存在时，cAMP浓度降低，cAMP与CAP结合受阻，因此lac操纵子表达下降。


生物化学与分子生物学 别乳糖或IPTGI]J[m衫／呻`//／，I z]y 由此可见，对lac操纵子来说，CAP是正性调节因素，Lac阻遏蛋白是负性调节因素。两种调节机制根据存在的碳源性质及水平协调调节lac操纵子的表达。3.协同调节Lac阻遏蛋白负性调节与CAP正性调节两种机制协同合作岱：当Lac阻遏蛋白阻遏转录时，CAP对该系统不能发挥作用；但是如果没有CAP存在来加强转录活性，即使阻遏蛋白从操纵序列上解离仍几无转录活性。可见，两种机制相辅相成、互相协调、相互制约。由于野生型lac启动子作用很弱，所以CAP是必不可少的。lac操纵子的负调节能很好地解释在单纯乳糖存在时，细菌是如何利用乳糖作为碳源的。然而，细菌生长环境是复杂的，倘若有葡萄糖或葡萄糖／乳糖共同存在时，细菌首先利用葡萄糖才是最节能的。这时，葡萄糖通过降低cAMP浓度，阻碍cAMP与CAP结合而抑制lac操纵子转录，使细菌只能利用葡萄糖。葡萄糖对lac操纵子的阻遏作用称分解代谢阻遏(catabolic repress ion)。lac操纵子强的诱导作用既需要乳糖存在又需要缺乏葡萄糖。lac操纵子协同调节机制如图16-3所示。


生物化学与分子生物学 I PI|1|CAP结合位点1P|(匠二］z Y仁三二］t无转录阻遏蛋白C二二］(a)有葡萄糖，无乳糖


生物化学与分子生物学 I PI|1|CAP结合位点1P|(匠二］z Y仁三二］t无转录阻遏蛋白C二二］(a)有葡萄糖，无乳糖 I PI I I I CA啤合位点1P|。z|Y|A|巨I羞l。z|Y|A|阻遏蛋白仁二二)—i i i诱导剂t一一习(a)当葡萄糖存在，没有乳糖存在时，阻遏蛋白封闭转录，CAP不能发挥作用；（b）当乳糖存在时，去阻遏，但因有葡萄糖存在，CAP不能发挥作用；（c）当葡萄糖不存在，乳糖存在时，即去阻遏，CAP又能发挥作用，对lac操纵子有强的诱导调节三、色氨酸操纵子通过阻遏作用和衰减作用抑制基因表达原核生物体积小，受环境影响大，在生存过程中需要最大限度减少能源消耗，对非必需氨基酸都，一，讨负}尽量关闭其编码基因。例如，只要环境中有相应的氨基酸供应，大肠杆菌就不会自己去合成，而会将相应氨基酸的合成代谢酶编码基因全部关闭。大肠杆菌色氨酸操纵子(trp operon)就是一个阻遏操纵子。在细胞内无色氨酸时，阻遏蛋白不能与操纵序列结合，因此色氨酸操纵子处于开放状态，结构基因得以表达。当细胞内色氨酸的浓度较高时，色氨酸作为辅阻遏物与阻遏蛋白形成复合物并结合到操纵序列上，关闭色氨酸操纵子，停止表达用于合成色氨酸的各种酶。色氨酸操纵子的有效关闭还有一种属于促进巳经开始转录的mRNA合成终止的方式来进一步加强，这种方式称为转录衰减(transcription attenuation)，即色氨酸操纵子还可通过转录衰减的方式抑制基因表达。这种作用是利用原核生物中转录与翻译过程偶联进行，转录时先合成的一段前导序列L来实现的。前导序列的结构特点及其发挥衰减作用的机制如图16-4所示。前导序列L的结构特点是：心它可以转录生成一段长度为162bp、内含4个特殊短序列的前导mRNA;＠其中序列l有独立的起始和终止密码子，可翻译成为一个有14个氨基酸残基的前导肤，它的第10位和第11位都是色氨酸残基；＠序列1和序列2间、序列2和序列3间、序列3和序列4间存在一些互补序列，可分别形成发夹结构，形成发卡结构的能力依次是1/2发夹＞2/3发夹＞3/4发夹；＠序列4的下游有一个连续的U序列，是一个不依赖于p因子的转录终止信号转三、、～、、、5'1，序列1”Z正已序列3巳习曰＝uuuu|3'前导mRNA(a)前导序列的结构特征；（b）在Trp低浓度时，核糖体停滞在序列l上，2/3发卡结构形成，转录继续进行；（c）在Trp高浓度时，3/4发卡结构和多聚U序列使得转录提前终止转录衰减的机制是：心色氨酸浓度较低时，前导肤的翻译因色氨酸量的不足而停滞在第10/11的色氨酸密码子部位，核糖体结合在序列l上，因此前导mRNA倾向于形成2/3发夹结构，转录继续进行；＠色氨酸浓度较高时，前导肤的翻译顺利完成，核糖体可以前进到序列2，因此发夹结构在序列3和序列4形成，连同其下游的多聚U使得转录中途终止，表现出转录的衰减。原核生物这种在色氨酸浓度高时通过阻遏作用和转录衰减机制共同关闭基因表达的方式，保证了营养物质和能量的合理利用。前导序列发挥了随色氨酸浓度升高而降低转录的作用，故将这段序列称为衰减子(attenuator)。在trp操纵子中，阻遏蛋白对结构基因转录的负调节起到粗调的作用，而衰减子起到精调的作用。细菌中其他氨基酸合成系统的操纵子（如phe、加、leu、thr等）中也有类似的衰减调控机制。 四、原核基因表达在翻译水平受到精细调控 与转录类似，翻译一般在起始和终止阶段受到调节，尤其是起始阶段。翻译起始的调节主要靠调节分子，调节分子可直接或间接决定翻译起始位点能否为核糖体所利用。调节分子可以是蛋白质，也可以是RNA。（一）蛋白质分子结合千启动子或启动子周围进行自我调节无论是单顺反子还是多顺反子mRNA，许多体系应用了类似的机制，即调节蛋白结合mRNA靶位点，阻止核糖体识别翻译起始区，从而阻断翻译的机制。调节蛋白一般作用于自身mRNA，抑制自身的合成，因而这种调节方式称为自我控制(au togenous control)。细菌mRNA起始密码子上游约10个核昔酸之前的SD序列与16和RNA序列互补的程度以及从起始密码子AUG到嗦呤片段的距离也都强烈地影响翻译起始的效率（见第十五章）。不同基因的mRNA有不同的SD序列，它们与16S rRNA的结合能力也不同，从而控制着单位时间内翻译过程中起始复合物形成的数目，最终控制着翻译的速度。（二）翻译阻遏利用蛋白质与自身mRNA的结合实现对翻译起始的调控翻译起始与转录起始相类似，也受调节蛋白的作用，但与转录不同，RNA在翻译起始过程中有重要的作用。编码区的起始点可与调节分子（蛋白质或RNA)直接或间接地结合来决定翻译起始。在此调控机制中，调节蛋白可以结合到起始密码子上，阻断与核糖体的结合。例如，S8是组成核糖体小亚基的一个蛋白质，可以与16S rRNA的茎环结构结合；L5是组成核糖体大亚基的一个蛋白质，它的mRNA的5'－末端也能形成一个与16S rRNA的茎环结构相类似的结构。因此S8也能与L5的mRNA结合。当16S rRNA含量充足时，可以与所有的S8蛋白结合，不影响L5蛋白质的合成；而当16S rRNA含量不足时，多余的S8则与L5mRNA结合，阻遏L5蛋白质的合成，防止L5合成过量。（三）反义RNA利用结合mRNA翻译起始部位的互补序列调节翻译起始此外，在一些细菌和病毒中还存在一类调节基因，能够转录产生反义RNA(antisense RNA)。反义RNA含有与特定mRNA翻译起始部位互补的序列，通过与mRNA杂交阻断30S小亚基对起始密码子的识别及与SD序列的结合，抑制翻译起始。这种调节称为反义控制(antisense control)。反义RNA的调节作用具有非常重要的理论意义和实际意义。 （四）mRNA密码子的编码频率影响翻译速度 遗传密码表显示，除色氨酸和甲硫氨酸外，其他的氨基酸都有2个或2个以上的遗传密码子。有些是使用频率较高的常用密码子，而有些则是使用频率较低的稀有密码子。当基因中的密码子是常用密码子时，mRNA的翻译速度快，反之，mRNA的翻译速度慢。大肠杆菌dnaG基因是引物酶的编码基因，含有较多的稀有密码子，使得mRNA的翻译速度缓慢，防止引物酶合成过多。 第三节真核基因表达调控 原核细胞的基因表达调控机制已经十分复杂，与之相比，真核生物的基因组结构要复杂得多，加之个体内细胞间广泛存在的信号通讯网络，其基因表达调控的多样性和复杂性远非原核生物所能比拟。 一、真核基因表达特点 多细胞真核生物的基因表达调控具有以下特点：心真核基因组比原核基因组大得多。＠原核基\,`fi因组的大部分序列都为编码基因，而哺乳类基因组中大约只有10％的序列编码蛋白质、rRNA、tRNA等，其余90％的序列，包括大量的重复序列，功能至今还不清楚，可能参与调控。＠真核生物编码蛋白质的基因是不连续的，转录后需要剪接去除内含子，这就增加了基因表达调控的层次。＠原核生物的基因编码序列在操纵子中，多顺反子mRNA使得几个功能相关的基因自然协调控制；而真核生物则是一个结构基因转录生成一条mRNA，即mRNA是单顺反子(monocistron)，许多功能相关的蛋白质，即使是一种蛋白质的不同亚基也将涉及多个基因的协调表达。＠真核生物DNA在细胞核内与多种蛋白质结合构成染色质，这种复杂的结构直接影响着基因表达。＠真核生物的遗传信息不仅存在于核DNA上，还存在于线粒体DNA上，核内基因与线粒体基因的表达调控既相互独立又需要协调。由于真核基因组的这些特点，真核基因表达的调控过程较原核生物要复杂许多（图16-5)。该过程包括了染色质激活、转录起始、转录后修饰、转录产物的细胞内转运、翻译起始、翻译后修饰等多个步骤。在上述过程的每一个环节都可以对基因表达进行干预，从而使得基因表达调控呈现出多层次和综合协调的特点。但是，转录起始的调控是基因表达调控较为关键的环节。 染色体e>＜今、：染色质激活双链DNA~．卜＄嚣＄卢甘贯i转录起始 hnRNA"1TTTTTTTTTTTTT转录后加工«-－－－一修饰及转运 基因表达过程中的J mRNA^了~^了~翻译起始~i◄成熟蛋白质飞9云二、染色质结构与真核基因表达密切相关 以染色质形式组装在细胞核内的DNA所携带的遗传信息表达直接受到染色质结构的制约。当基因被激活时，可观察到染色质相应区域发生某些结构和性质变化，这些具有转录活性的染色质被称为活性染色质(ac tive chromatin)。 （一）转录活化的染色质对核酸酶极为敏感 当染色质活化后，常出现一些对核酸酶（如DNase I)高度敏感的位点，称之超敏位点(hypersensitive si t e)。超敏位点通常位于被活化基因的5'－侧翼区1kb内，但有时也会在更远的5'－侧翼区或3'侧翼区出现一些超敏位点。这些转录活化区域是缺乏或没有核小体蛋白结合的＂裸露“DNA链。 （二）转录活化染色质的组蛋白发生改变 转录活跃区域的染色质中组蛋白的特点是：CD富含赖氨酸的H1组蛋白含量降低；＠H2A-H2B组蛋白二聚体的不稳定性增加，使它们容易从核小体核心中被置换出来；＠核心组蛋白H3、H4可发生乙酰化、磷酸化以及泛素化等修饰。这些都使得核小体的结构变得松弛而不稳定，降低核小体蛋白对DNA的亲和力，易于基因转录。在真核细胞中，核小体是染色质的主要结构单位，四种组蛋白(H2A、H2B、H3和H4各2个分子）组成的八聚体构成核小体的核心区(core particle)，其外面盘绕着DNA双螺旋链。每个组蛋白的氨基端都会伸出核小体外，形成组蛋白尾巴（图16-6)。这些尾巴可以形成核小体间相互作用的纽带，同时也是发生组蛋白修饰的位点。这些修饰包括对组蛋白中富含的赖氨酸、精氨酸、组氨酸等带有正电荷的碱性氨基酸进行的乙酰化、磷酸化和甲基化等修饰过程。(a)组蛋白与DNA组成的核小体；（b）组蛋白的氨基端伸出核小体，形成组蛋白尾巴；(c)四种组蛋白组成的八聚体一般来说，乙酰化修饰能够中和组蛋白尾巴上碱性氨基酸残基的正电荷，减弱组蛋白与带有负电荷的DNA之间的结合，选择性地使某些染色质区域的结构从紧密变得松散，有利于转录因子与DNA的结合，从而开放某些基因的转录，增强其表达水平。而组蛋白甲基化通常不会在整体上改变组蛋白尾巴的电荷，但是能够增加其碱性度和疏水性，因而增强其与DNA的亲和力。乙酰化修饰和甲基化修饰都是通过改变组蛋白尾巴与DNA之间的相互作用发挥基因表达调控的功能，而乙酰化修饰和甲基化修饰的作用往往又是相互排斥的。组蛋白的磷酸化修饰在细胞有丝分裂和减数分裂期间染色体浓缩以及基因转录激活过程中发挥重要的调节作用。组蛋白乙酰化、磷酸化和甲基化修饰对染色质结构和功能的影响总结于表16-1。此外，组蛋白修饰还包括泛素化修饰和ADP－核糖基化。各种不同修饰的效应可能是协同的，也可能是相反的；可能是同时发生，也可能是在不同时刻；修饰的组蛋白底物可能相同，也可能不同。组蛋白修饰对于基因表达影响的机制也包括两种相互包容的理论，即组蛋白的修饰直接影响染色质或核小体的结构，以及化学修饰募集了其他调控基因转录的蛋白质，为其他功能分子与组蛋白结合搭建了一个平台。这些理论构成了”组蛋白密码“假说。当然，组蛋白修饰对基因表达调控的研究还刚刚开始，许多问题仍有待解决。发挥组蛋白共价修饰作用的一些蛋白质分子，如组蛋白乙酰基转移酶(histone acetyltransferase,HAT)和组蛋白去乙酰化酶(hi stone deacetylase, HDAC)，在DNA水平的基因表达调控中具有重要作用。HAT使组蛋白发生乙酰化，促使染色质结构松弛，有利千基因的转录，被称为转录辅激活因子(co-activator)，而HDAC促进组蛋白的去乙酰化，抑制基因的转录，被称为转录辅抑制因子(co-repressor)。 316第三篇遗传信息的传递 组蛋白氨基酸残基位点修饰类型功能H3Lys-4甲基化激活H3Lys-9甲基化染色质浓缩H3Lys-9甲基化DNA甲基化所必需H3Lys-9乙酰化激活H3Ser-10磷酸化激活H3Lys-14乙酰化防止Lys-9的甲基化H3Lys-79甲基化端粒沉默H4Arg-3甲基化激活或抑制．H4Lys-5乙酰化装配H4Lys-12乙酰化装配H4Lys-16乙酰化核小体装配H4Lys-16乙酰化Fly X激活．不同的酶催化产生不同的效应DNA甲基化是真核生物在染色质水平控制基因转录的重要机制。真核基因组中胞啥唗的第5位碳原子可以在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase)的作用下被甲基化修饰为5－甲基胞瞪唗，并且以序列CG中的胞啥唗甲基化更加常见。但是这些甲基化胞瞪唗在基因组中并不是均匀分布，有些成簇的非甲基化CG存在千整个基因组中，人们将这些GC含量可达60%，长度为300-3000bp的区段称作CpG岛(CpG island)。CpG岛主要位千基因的启动子和第一外显子区域，约有60％以上基因的启动子含有CpG岛。业已发现处于转录活跃状态的染色质中，CpG岛的甲基化程度下降，例如管家基因的CpG岛中胞瞪唗甲基化水平较低。CpG岛的高甲基化促进染色质形成致密结构，因而不利于基因表达。


生物化学与分子生物学 316第三篇遗传信息的传递 染色质结构对基因表达的影响可以遗传给子代细胞，其机制是细胞内存在着具有维持甲基化作用的DNA甲基转移酶，可以在DNA复制后，依照亲本DNA链的甲基化位置催化子链DNA在相同位置上发生甲基化。这种现象称为表观遗传(epigenetic i nheritance)。这种遗传信息不是蕴藏在DNA序列中，而是通过对染色质结构的影响及基因表达变化而实现的。表观遗传对基因表达的调控不仅体现在DNA甲基化上，组蛋白的乙酰化、甲基化以及非编码小RNA的调控等都属于表观遗传调控的范畴。 三、转录起始的调节 与原核细胞一样，转录起始是真核生物基因表达调控的关键，但是真核生物的基因转录起始过程比原核细胞的复杂得多。这是因为真核生物的RNA聚合酶需要与多个转录因子相互作用，才能完成转录起始复合物的装配，装配速度决定着基因表达的水平。


生物化学与分子生物学 (—)顺式作用元件是转录起始的关键调节部位 绝大多数真核基因调控机制都涉及编码基因附近的非编码DNA序列一顺式作用元件。顺式作用元件是指可影响自身基因表达活性的DNA序列（图16-7)。真核生物基因组中每一个基因都有各自特异的顺式作用元件。顺式作用元件通常是非编码序列，但是并非都位于转录起始点上游。根据顺式作用元件在基因中的位置、转录激活作用的性质及发挥作用的方式，可将真核基因的这些功能元件分为启动子、增强子、沉默子及绝缘子等。1.真核生物启动子结构和调节远较原核生物复杂真核生物不同基因的启动子序列间的一致性不像原核生物那样明显，而且RNA聚合酶与DNA的结合需要多种蛋白质因子的相互协调作用。因此，真核生物的启动子序列要比原核生物的复杂得多、序列也更长。


生物化学与分子生物学 fr父，七转录起始点 图16-7顺式作用元件图中A、B分别代表同一基因中的两段特异DNA序列。B序列通过一定机制影响A序列，并通过A序列控制该基因的转录起始的准确性及频率。A、B序列就是调节这个基因转录活性的顺式作用元件真核生物启动子一般位于转录起始点上游，为100-200bp序列，包含有若干具有独立功能的DNA序列元件，每个元件长7-30bp。启动子通常含有1个以上的功能组件，其中最具典型意义的就是TATA盒，它的共有序列是TATAAAA（见第十一章）。TATA盒是基本转录因子TF II D的结合位点通常位于转录起始点上游－25--30bp区域，控制转录起始的准确性及频率。除TATA盒外，GC盒(GGGCGG)和CAAT盒(GCCAAT)也是很多基因中常见的功能组件。此外，还发现很多其他类型的功能组件。典型的II类启动子由TATA盒或下游启动子元件(downstream promoter element, DPE)和起始元件(initiator element, Inr)以及上游调控元件组成。


生物化学与分子生物学 fr父，七转录起始点 然而，还有很多启动子并不含TATA盒，这类启动子分为两类：一类为富含GC的启动子，最初发现于一些管家基因，这类启动子一般含数个分离的转录起始点，并有数个转录因子SP l结合位点，对基本转录活化有重要作用；另一类启动子既不含TATA盒，也没有GC富含区，这类启动子可有一个或多个转录起始点，大多转录活性很低或根本没有转录活性，而是在胚胎发育、组织分化或再生过程中受调节。真核生物主要有三种RNA聚合酶，它们分别结合在三类不同的启动子上负责转录不同的RNA~（见第十一章和第十四章）。


生物化学与分子生物学 fr父，七转录起始点 2增强子是—种能够提高转录效率的顺式作用元件增强子的长度大约是200bp，可使旁侧的基因转录效率提高100倍或更多。增强子也是由若干功能组件组成，有些功能组件既可在增强子中出现，也可在启动子中出现。这些功能组件是特异转录因子结合DNA的核心序列。增强子的核心组件常为8-12bp，可以单拷贝或多拷贝串联形式存在。增强子和启动子常交错覆盖或连续。酵母有一种类似高等真核生物增强子样作用的序列，称为上游激活序列(upstream activator sequence, UAS),其在转录激活中的作用方式与增强子类似。增强子的功能及其作用特征如下：（］）增强子与被调控基因位于同一条DNA链上，属千顺式作用元件。(2)增强子是组织特异性转录因子的结合部位，当某些细胞或组织中存在能够与之相结合的特异转录因子时方能表现活性。(3)增强子不仅能够在基因的上游或下游起作用，而且还可以远距离实施调节作用（通常为1~4kb)，个别情况下甚至可以调控30kb以外的基因。


生物化学与分子生物学 318第三篇遗传信息的传递 (4)增强子作用与序列的方向性无关。将增强子的方向倒置后依然能起作用，而方向倒置后的启动子就不能起作用。(5)增强子需要有启动子才能发挥作用，没有启动子存在，增强子不能表现活性。但增强子对启动子没有严格的专一性，同一增强子可以影响不同类型启动子的转录。3.沉默子能够抑制基因的转录沉默子是一类基因表达的负性调控元件，当其结合特异蛋白因子时，对基因转录起阻遏作用，最初在酵母中发现。已有的证据显示沉默子与增强子类似，其作用亦不受序列方向的影响，也能远距离发挥作用，并可对异源基因的表达起作用。4.绝缘子阻碍其他调控元件的作用绝缘子最初在酵母中发现，一般位于增强子或沉默子与启动子之间，与特异蛋白因子结合后，阻碍增强子或沉默子对启动子的作用。绝缘子还可位千常染色质与异染色质之间，保护常染色质的基因表达不受异染色质结构的影响。绝缘子与增强子类似，发挥作用与序列的方向性无关。


生物化学与分子生物学 （二）转录因子是转录起始调控的关键分子 真核基因的转录调节蛋白又称转录调节因子或转录因子(transcrip tion factor, TF)。绝大多数真核转录调节因子由其编码基因表达后进人细胞核，通过识别、结合特异的顺式作用元件而增强或降低相应基因的表达。转录因子也被称为反式作用蛋白或反式作用因子。如本章第一节所述，这些反式作用因子的编码基因与其作用的靶基因之间不存在结构的关联，而顺式作用元件则是在结构上与靶基因串联连接在一起。这种来自于一个基因编码的蛋白质对另一基因的调节作用称为反式激活或反式抑制作用。真核生物转录调控的基本方式就是反式作用因子对顺式作用元件的识别与结合，即通过DNA－蛋白质的相互作用实施调控。并不是所有真核转录调节蛋白都起反式作用，也有些基因产物可特异识别、结合自身基因的调节序列，调节自身基因的开启或关闭，这就是顺式调节作用。具有这种调节方式的调节蛋白称为顺式作用蛋白（图16-8)。依据功能特性，可将转录因子分为通用转录因子(general transcription factor)和特异转录因子(spec ial transcrip tion fac tor)两大类。


生物化学与分子生物学 反式调节蛋白质A勹转录起始点DNA~歹＇彶蛋白质B顺式调节 茵16-8反式与顺式作用蛋白蛋白质A由它的编码基因表达后，通过与B基因特异的顺式作用元件的识别、结合，反式激活B基因的转录，蛋白质A即反式作用蛋白或反式作用因子。B基因产物也可特异识别、结合自身基因的调节序列，顺式调节自身基因的开启或关闭，因此，B调节蛋白称为顺式作用蛋白发挥顺式调节作用1通用转录因子这些转录因子是RNA聚合酶介导基因转录时所必需的一类辅助蛋白质，帮助聚合酶与启动子结合并起始转录，对所有基因都是必需的。有入将其视为RNA聚合酶的组成成分或亚基，故又称为基本转录因子。正如第十四章中所述，通用转录因子TFil D是由TBP和TAFs组成的复合物。TFilD复合物中不同TAFs与TBP的结合可能结合不同启动子，这可以解释这些因子在各种启动子中的选择性活化作用以及对特定启动子存在不同的亲和力。中介子(mediator)也是在反式作用因子和RNA聚合酶之间的蛋白质复合体，它与某些反式作用因子相互作用，同时能够促进TFil H对RNA聚合酶最大亚基的狻基端结构域的磷酸化。有时将中介子也归类于辅激活因子。通用转录因子的存在没有组织特异性，因而对于基因表达的时空选择性并不重要。2.特异转录因子这些转录因子为个别基因转录所必需，决定该基因表达的时间空间特异性，故称特异转录因子。此类特异因子有的起转录激活作用，有的起转录抑制作用。前者称转录激活因子(transcription activator)，后者称转录抑制因子(transcription inhibitor)。转录激活因子通常是一些增强子结合蛋白(enhancer binding prot ein, EBP)；多数转录抑制因子是沉默子结合蛋白，但也有抑制因子以不依赖DNA的方式起作用，而是通过蛋白质－蛋白质相互作用“中和“转录激活因子或TFil D，降低它们在细胞内的有效浓度，抑制基因转录。因为在不同的组织或细胞中各种特异转录因子分布不同，所以基因表达状态、方式不同。这些组织特异性的转录因子才真正决定着细胞基因的时间、空间特异性表达。特异转录因子自身的含量、活性和细胞内定位随时都受到细胞所处环境的影响，是使环境变化在基因表达水平得到体现的关键分子。组织特异性转录因子在细胞分化和组织发育过程中具有重要作用。例如，胚胎干细胞的分化方向在相当大的程度上是由细胞内转录因子的种类所决定。阐明各种组织细胞所特有的转录因子种类，就有可能控制细胞的分化方向。诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell, iPS)的建立说明关键转录因子可以改变一个细胞的命运。科学家们仅用4种转录因子就可以使终末分化的皮肤成纤维细胞转变成为类似于胚胎千细胞样的具有多向分化能力的细胞。此外，还有与启动子上游元件如GC盒、CAAT盒等顺式作用元件结合的蛋白质，称为上游因子(upstream factor)，如SPl结合到GC盒上，C/EBP结合到CAAT盒上。这些反式作用因子调节通用转录因子与TATA盒的结合、RNA聚合酶与启动子的结合及起始复合物的形成，从而协助调节基因的转录效率。与远隔调控序列如增强子等结合的反式作用因子有很多。可诱导因子(inducible factor)是与增强子等远端调控序列结合的转录因子。它们能结合应答元件，只在某些特殊生理或病理情况下才被诱导产生，如MyoD在肌细胞中高表达，HIF-1在缺氧时高表达。与上游因子不同，可诱导因子只在特定的时间和组织中表达而影响转录。RNA聚合酶Il与启动子结合并启动转录需要多种蛋白质因子的协同作用。这通常包括：可诱导因子或上游因子与增强子或启动子上游元件的结合；通用转录因子在核心启动子处的组装；辅激活因子和（或）中介子在通用转录因子或RNA聚合酶Il复合物与可诱导因子、上游因子之间的辅助和中介作用，以准确地控制基因是否转录、何时转录。应该指出的是，上游因子和可诱导因子等在广义上也可称为转录因子，但一般不冠以TF的词头而各有自己特殊的名称。3.转录因子的结构特点转录因子是DNA结合蛋白，至少包括两个不同的结构域：DNA结合结构域(DNA binding domain)和转录激活结构域(activation domain)。此外，很多转录因子还包含一个介导蛋白质－蛋白质相互作用的结构域，最常见的是二聚化结构域。 (1)转录因子的DNA结合结构域 l)锌指(zinc finge1)模体结构：是一类含锌离子的模体。每个重复的”指“状结构含20多个氨基酸残基，形成1个a－螺旋和2个反向平行B－折叠的二级结构。常见的锌指模体中每个B－折叠上有l个半胱氨酸(Cys)残基，而a－螺旋上有2个组氨酸(His)或半胱氨酸(Cys)残基。这4个氨基酸残基与二价锌离子之间形成配位键（图16-9)。整个蛋白质分子可有多个这样的锌指重复单位。每一个单位可将其a－螺旋伸入DNA双螺旋的大沟内，接触4个或更多的碱基。例如与GC盒结合的人成纤维细胞转录因子SPl中就有3个锌指重复结构。＇，中fa图16-9锌指模体结构C＝半胱氨酸；H＝组氨酸；F＝苯丙氨酸；L＝亮氨酸；Y＝酪氨酸；Zn＝锌离子2)碱性螺旋环－螺旋(basic helix-loop-helix, bHLH)模体结构：至少有两个a－螺旋，由一个短肤段形成的环所连接，其中一个a－螺旋的N－端富含碱性氨基酸残基，是与DNA结合的结合域（图16-10)。bHLH模体通常以二聚体形式存在，而且两个a－螺旋的碱性区之间的距离大约与DNA双螺旋的一个螺距相近(3.4nm)，使两个a-螺旋的碱性区刚好分别嵌入DNA双螺旋环c的大沟内。


生物化学与分子生物学 (1)转录因子的DNA结合结构域 3)碱性亮氨酸拉链(basic leucine zipper, bZIP)模体结构：特点是在蛋白质C－末端的氨(a)(b)基酸序列中，每隔6个氨基酸残基是一个疏水图16-10碱性螺旋－环－螺旋模体结构性的亮氨酸残基。当C－末端形成a－螺旋结构(a)独立的碱性螺旋－环－螺旋模体结构示意图；时，肤链每旋转两周就出现一个亮氨酸残基，(b)bHLH模体二聚体与DNA结合的示意图。两并且都出现在a－螺旋的同一侧。这样的两个个a－螺旋的碱性区分别嵌入DNA双螺旋的大沟内肤链能以疏水力结合成二聚体，形同拉链一样的结构（图16-11)。该二聚体的N－端是富含碱性氨基酸的区域，可以借助其正电荷与DNA骨架上的磷酸基团结合。(2)转录因子的转录激活结构域：不同的转录因子具有不同的转录激活结构域，根据氨基酸的组成特点，转录激活结构域可分为三类。


生物化学与分子生物学 (1)转录因子的DNA结合结构域 4.二聚化是常见的蛋白质－蛋白质相互作用方式二聚化作用与bZIP的亮氨酸拉链、bHLH的螺旋－环螺旋结构有关。?，记以上介绍的各种转录因子的功能结构形式都是最典型、最常见的。此外尚有一些独特的结构(a)碱性亮氨酸拉链模体结构示意图；（b)bZIP模体与DNA结合的示意图。两个a-螺旋上的亮氨酸残基彼此接近，形成了类似拉链的结构，而富含碱性氨基酸残基的区域与DNA骨架上的磷酸基团结合形式。（三）转录起始复合物的组装是转录调控的主要方式DNA元件与调节蛋白对转录激活的调节最终是由RNA聚合酶活性体现的，其中的关键环节是转录起始复合物的形成。真核生物主要有三种RNA聚合酶，分别负责催化生成不同的RNA分子（见第十四章）。其中RNA聚合酶II参与转录生成所有mRNA前体及大部分snRNA。参与RNA聚合酶II转录起始的DNA调控序列及转录因子要复杂得多，以满足RNA聚合酶II转录成千上万种处于不同表达水平的基因的需要。


生物化学与分子生物学 (1)转录因子的DNA结合结构域 真核RNA聚合酶II不能单独识别、结合启动子，而是先由基本转录因子TFlID识别、结合启动子序列，再同其他TF II与RNA聚合酶II经由一系列有序结合形成一个功能性的转录前起始复合物(transcriptionpreinitiation complex，详见第十四章）。此外，一些诸如转录激活因子(activator)、中介子(mediator)以及染色质重塑因子(chromatin remodeler)等调节复合体也可参与转录前起始复合物的形成，使RNA聚合酶II得以真正启动mRNA的有效转录（图16-12)。在不同的细胞或阶段，还有一些特异性转录因子通过特定的结合，发挥特异性转录调节作用。


生物化学与分子生物学 (1)转录因子的DNA结合结构域 也正是由于这些基本转录因子和特异转录因子决定了RNA聚合酶Il的活性，这些调节蛋白的浓度与分布将直接影响相关基因的表达。如前所述，特异转录因子的表达具有时间或空间特异性，因此，由它们所参与组成的转录起始复合物也将呈现一种动态变化。\i}IT四、转录后调控主要影响真核mRNA的结构与功能真核生物的基因表达调控在转录后层次不同千原核生物。这一方面是由于两者的转录产物的剪接、修饰等成熟加工过程有很大的差异，另一方面是由于真核生物的RNA产物要被运送至细胞质中去执行功能，其稳定性以及其降解过程都可以影响基因表达的最终结果。


生物化学与分子生物学 (-)mRNA的稳定性影响真核生物基因表达 mRNA是蛋白质生物合成的模板，因此它的稳定性将直接影响到基因表达最终产物的数量，是转录后对基因表达进行调控的一个重要因素。真核生物mRNA分子的半衰期差别很大，有的可长达数十小时以上，而有的则只有几十分钟或更短。一般而言，半衰期短的mRNA多编码调节蛋白，因此，这些蛋白质的水平可以随着环境的变化而迅速变化，达到调控其他基因表达的目的。影响细胞内mRNA稳定性的因素很多，主要有下面几点：1.5'－端的帽结构可以增加mRNA的稳定性该结构可以使mRNA免于在5'－核酸外切酶的作用下被降解，从而延长了mRNA的半衰期。此外，帽结构还可以通过与相应的帽结合蛋白结合而提高翻译的效率，并参与mRNA从细胞核向细胞质的转运。


生物化学与分子生物学 (-)mRNA的稳定性影响真核生物基因表达 2.3'端的poly(A)尾结构防止mRNA降解poly(A)及其结合蛋白可以防止3'－核酸外切酶降解mRNA，增加mRNA的稳定性。如果3'-poly(A)被去除，mRNA分子将很快被降解。此外，3'-poly(A)尾结构还参与了翻译的起始过程。实验证明，mRNA的细胞质定位信号有些也位于3'－非翻译区(3'-untranslated region,3'-UTR)上。组蛋白mRNA没有3'-poly(A)尾的结构，但它的3'－端会形成一种发夹结构，使其免受核酸酶的攻击。一些mRNA的3'-UTR存在一个约50个核昔酸长的AU富含序列(AU-rich sequence, ARE)区，可以与ARE结合蛋白结合，促使poly(A)核酸酶切除poly(A)尾，使mRNA降解（见第十四章）。因此含有ARE区的mRNA通常都不稳定。


生物化学与分子生物学 (-)mRNA的稳定性影响真核生物基因表达 RNA无论是在核内进行加工、由细胞核运至细胞质，还是在细胞质内停留（至降解），都是通过与蛋白质结合形成核糖核蛋白颗粒(ribonucl eoprotein particle, RNP)进行的。mRNA运输、在细胞质内的稳定性等均与某些蛋白质成分有关。所有类型RNA分子中，mRNA寿命最短。mRNA稳定性是由合成速率和降解速率共同决定的（见第十四章）。大多数高等真核细胞mRNA半衰期较原核为长，一般为几个小时。mRNA的半衰期可影响蛋白质合成的量，通过调节某些mRNA的稳定性，即可使相应蛋白质合成量受到一定程度的控制。例如，mRNA5'－端的帽结构和3'－端的尾结构的删除可直接影响mRNA的稳定性。